This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

(Bir mertebe dahilinde yani) ayrışma sabiti için bir Yaklaşık Değer 1. Belirlenmesi <ol><li> Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklanan bir karışım hazırlayın. </li><li> Mümkün olan en yüksek konsantrasyonda söz konusu ligandın stokları hazırlanması ve bu daha sonra en altı ile on kez seyreltilmiş hali. Yaklaşık Kd önceki veri bilindiği durumda, en az iki konsantrasyonları yukarıda ve Kd altında olması hedeflenmektedir. </li><li> Bir kısım QPCR plaka sekiz kuyulara karışımı 18 ul. Birinci oyuğuna çözücünün 2 ul ekleyin. Kalan yedi kuyuda olarak her biri ligand seyreltme serisi (adım 1.2) her bir üyesi, 2 ul ekle. </li><li> Tablada QPCR sızdırmazlık yerleştirin. Levhanın iyi bir sızdırmazlık elde etmek için, plakanın ortasında (özel reaktiflerin tabloya bakınız) bir el aplikatörü yerleştirin. Bir tarafa mühür aşağı pürüzsüz, ve daha sonra diğer yarısı üzerinde tekrarplakası. </li><li> Hava kabarcıklarını çıkarmak için iki dakika boyunca 500 xg&#39;de plaka santrifüj. </li><li> Bir StepOne QPCR enstrüman plakası yerleştirin. (Bu 40 dakika boyunca 99 ° C bir rampa ardından 25 ° C&#39;de 2 dakika duraklama, ve daha sonra 2 dakika duraklama sağlar) &quot;Erime eğrisi&quot; seçeneği, ROX filtreleri seçin, ve hızlı rampa hızı seçin. Termal denatürasyon çalıştırın. NOT: bir çalışma gerçekleştirmek için komut dosyaları http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Alet koşmak sonunda, ekranda &quot;Analiz&quot; butonuna tıklayınız. Sonuç dosyayı kaydedin. </li><li> Protein Termal Shift yazılımını açın. <ol><li> Yeni bir çalışma oluşturun; özellikler sekmesinde, bu bir ad verin ve Koşullar sekmesinde, detay ligandlar. </li><li> Deney Dosyaları sekmesinde taşı, ve kaydedilen sonuçlar dosyası (XXX.eds) ithal ve her iyi (şablon fil içeriğini ayarlamakes) yazarlarda mevcuttur. </li><li> Analiz sekmeye geçmek ve &quot;analiz&quot; düğmesine basın. NOT: Bu sonuçları analiz eder. Bu Excel İhracat sekmesini kullanarak daha fazla araştırma için sonuçları ihracat mümkündür. Sonuçlar bir sekme tasvir biçiminde ihraç edilmektedir. Excel&#39;de ihraç dosyasını açın ve hemen Excel formatında kaydetmek için en iyisidir. </li></ol></li><li> Sadece çözücü mevcudiyetinde protein Şekil 1A &#39;de gösterilene benzer bir sonuç verir olduğunu kontrol edin. Sonra, &quot;suret&quot; bölmesinde sonuçlarında gözlenen erime sıcaklıkları inceleyin. Bu artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığı belirgin bir artış gösterdiğinden emin olun. Not: erime sıcaklığı, ligand içermeyen protein arasındaki yarım olduğu İdeal olarak, bu (protein tam ligand bağlı olduğunu varsayarak) açık bir maksimum erime sıcaklığı ve yaklaşık Kd sağlayacaktırmaksimum. </li></ol> Ayrışma sabitinin belirlenmesi için 2. Deney hazırlığı <ol><li> Bir ana karışımı olarak Tablo 2&#39;de ayrıntıları verilen bir karışım hazırlayın. </li><li> Son deneyde on kat seyreltilerek on beş farklı konsantrasyonlarda stok ligand hazırlayın. İdeal olarak, konsantrasyonlarının yaklaşık Kd altında ve üstünde büyüklük en az iki sıra içerir ve tahmin edilen Kd konsantrasyonlarını merkezi. Bu iki tarafında başka dört puan ile, tahmini K d büyüklükte bir düzen içinde noktaların yedi odaklanın; bir seçim varsa, doyurarak değerlere daha fazla puanı bulunur. NOT: Gerekli, bu ligand stokları ligand çözünürlüğünün sınırlayıcı çift deneysel konsantrasyonda olduğu deneysel koşullar böyle değiştirmek mümkün değilse. </li><li> Master&#39;ın 120 ul ekleyinana karışımı elverişli bir şekilde sevk için bir rezervuar olarak hareket etmek, U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde sekiz çukurlara karıştırın. PCR plakasının bir kolonuna 18 ul dağıtılması için 8 kanallı pipet kullanın. Plaka üzerinde 8 x 6 deseninde 48 dolu gözenekli bir toplam elde etmek üzere bir başka beş sütun için tekrarlayın. </li><li> U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ayrı ayrı kuyucuklarına, 20 ligand stokların ul, veya solventin ekleyin. 8 kanallı pipet, aspire sekiz farklı bağlayıcı hisse senetleri (veya çözücü) 2 ul kullanma. Adım 2.3 master karışımı ile dolu PCR plaka bir sütun bu ekleyin. Iki başka sütunlar için aynı sekiz ligand / çözücü stokları ile tekrarlayın. Aspire 2 Geriye kalan sekiz ligandı ya da çözücü stoklarının ul, ve plakanın bir dördüncü sütunda bu ekleyin. Iki başka sütunlar için bu işlemi tekrarlayın. Bu, tüm 16 ligand ve çözücü numuneler için üç nüsha örnekler vereceğim. </li><li> Plaka üzerine yerleştirin QPCR conta (adım 1.4). </li><li> 500 xg&#39;de plaka santrifüjeİki dakika. </li><li> QPCR enstrüman plakası yerleştirin. Adım 1.6 belirtilen parametreleri kullanarak bir termal denatürasyon çalıştırın. </li><li> Alet koşmak sonunda, ekranda &quot;Analiz&quot; butonuna tıklayınız. Sonuç dosyayı kaydedin. </li><li> Protein Termal Shift yazılımını açın. Yeni bir çalışma oluşturun; özellikler sekmesinde, bu bir ad verin ve Koşullar sekmesinde, detay ligandlar. </li><li> Deney Dosyaları sekmesinde taşı, ve kaydedilen sonuçlar dosyası (XXX.eds) ithalat, ve de her içeriğini ayarlayın. NOT: şablon dosyalarını http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Analiz sekmeye geçmek ve &quot;analiz&quot; düğmesine basın. <ol><li> Triplicates olarak sonuçlarını göstermek için ekranın sol tarafındaki menüden &quot;çoğaltır&quot; sekmesini seçin. Kopyaların nasıl sıkı dayalı verilerin güvenilirliğini değerlendirmek. ShoulTriplikat yoksul tekrarlanabilir olduğunu göstermek d yakından ham verileri incelemek. </li><li> Erime sıcaklığını değerlendirmek için Boltzmann&#39;ı veya Türev yöntemleri kullanılarak verileri analiz edin. &quot;Sonuçları Replicatea&quot; sekmesini seçin ve &quot;tarafından Plot:&quot; geçiş, &quot;sonuç arsa Replicatea&quot; in arasındaki düğme &quot;Tm - Boltzmann&quot; ve &quot;Tm - Türev&quot;. Numune için büyük üretkenlik sağlar yöntemini seçin. Excel Export sekmesini kullanarak daha fazla araştırma için sonuçları ihracat. NOT: Birden fazla geçişler göstermek numuneler için, birden fazla eriyik modunda Türev yöntemi kullanmak hemen hemen her zaman en iyisidir. Sonuçlar bir sekme tasvir biçiminde ihraç edilmektedir. Excel&#39;de ihraç dosyasını açın ve hemen Excel formatında kaydetmek için en iyisidir. </li><li> Sonuçların yeniden üretilebilirlik sağlamak için, ayrı bir günde bir tekrarı dahil olmak üzere, en az iki kez deney tekrarlayın. Veri analizi (aşağıya bkz: adım 3) ShouldKd değeri, ilk tahmin etmek için önemli ölçüde farklı olduğunu göstermektedir, yaklaşık Kd değerleri iyi bir dizi sağlamak için (adım 2.2) uygun olarak, ligand konsantrasyonlarının değiştirilmesi. </li></ol> 3. Veri Analizi renatürasyonun altında ayrışma sabiti belirleme <ol><li> Ligand konsantrasyonlarının Excel&#39;de bir tablo ve erime sıcaklığını oluşturun. </li><li> GraphPad Prism yazılımı açın ve bir XY tablo oluşturun. Ligand konsantrasyonu ve sıcaklık sonucu erime için Y sütun için X kolonu kullanılarak, veri girin. NOT: Gösterilen bir örnek Şekil 1B olduğunu. Önceden yüklenmiş denklemler ve SPSS istatistik paketi kullanılarak alternatif talimatları ile bir komut dosyası, http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Analiz sekmesinde, analiz parametresini değiştirmek için seçeneği seçins (Ctrl + T). , Doğru modeli giriniz &quot;Yeni&quot; seçin ve &quot;yeni bir denklem oluşturma&quot; için. &quot;Tek sitesi ligand bağlanma&quot; olarak Tablo 3&#39;te detaylı denklemi yerleştirin. NOT: Bu adımların bir örneği Şekil 1C gösterilmiştir. Denklemleri önceden yüklenmiş ile komut kullanırken, ilgili denklem listede yerine girdi seçilebilir yönlendirilebilir. Bu denkleminin ekte verilmiştir. </li><li> Kutusunda &quot;Başlangıç ​​Değerlere için Kurallar&quot; seçin ve Tablo 3&#39;te ayrıntılı olarak başlangıç ​​değerleri için kurallar girin. </li><li> (Ligand verilmektedir aynı birimlerinde) ve protein nihai konsantrasyona girmek &quot;ile sürekli eşit&quot; olarak, parametre P sınırlandırmaktadır. </li><li> Analizi gerçekleştirmek için Tamam seçeneğini seçin. NOT: Bu adımların bir örneği Şekil 1D gösterilmiştir. Grafik yazılımı veri ve modele uyum gösteren bir figür oluşturur. T örnekleriöz konusu analizler temsilci verileri gösterilmiştir. </li></ol> Kooperatif Modelleri 4. Uydurma Veri Basit bir kooperatif modeli, ya da iki ayrı ayrılma sabitler tanımlanmıştır model seçmesini, bir kooperatif modeli veri sığdırmak için. Birinci yaklaşım, negatif işbirliğinden durumunda tercih edildiği veya ilk araştırma olarak edilir. Ancak, prensipte iki farklı ayrışma sabiteleri 18 modellemek için pozitif bir birliktelik durumlarda daha iyidir. Bu durumda, ardışık modelleme ligand bağlanma ya da ligandların bağlanma ya da bağımsız olarak varsayarak devam edebilir. <ol><li> , &quot;Basit kooperatif modeli&quot; olarak listelenen Tablo 3 denklemlerin birini yerleştirin, adım 3.3 de, Ancak protokolde 3. olarak &quot;iki ligandların Sıralı bağlama&quot; aynı ilk adımları uygulayın, veya 18 &quot;Bağımsız iki ligandların bağlanması&quot;. </li><li> Başlangıç ​​değerleri için ilgili kuralları seçinTablo 3&#39;te bu denklemlerin her biri ile ilişkili. </li><li> Verilere modelin uyum inceleyin. Veri kötü uygun olmalıdır, başka bir model düşünün. NOT: ayrıca dikkatle Protein Termal Shift yazılımıyla (adım 2.9) ile veri erime sıcaklığına takılmasını incelemek önemlidir: bazen iyi sonuçları almak için buraya parametrelerini değiştirmek için gereklidir. K d iki tarafında sınırlı bir veri seti, ya da (özellikle yüksek ligand konsantrasyonlarda) tek bir anormal noktası, ya önemli ölçüde etkileyebilir: Başka bir göz veri noktalarının aralığı ideal ve herhangi bir anormal noktaları olup olmadığını olmadığıdır Sonuçlar. </li><li> Yeniden üretilebilirlik sağlamak için en az iki kez (adım 2.12) deney tekrarlayın. </li></ol> Erime Sıcaklığı İkili kaydırır gösteriliyor Curves 5. Uydurma Veri Bazen, yerine ligand bir derecelendirilmiş cevaptan daha, proteinler olmuşturÖrnek açık bir şekilde bağlanmış, bağlanmamış numune ayrılır bir ikili yanıtı kabul görülmektedir. Bir örnek, temsili sonuçlar (Şekil 4) sağlanır. Bu durumda, erime sıcaklıklarının montaj Kd için iyi bir uyum sağlamaz. <ol><li> Protein Termal Shift yazılım ham veri çıkışı ihracat. Her sıcaklık noktası için, sıfır ligand için ortalama floresan ve en yüksek ligand konsantrasyonlarının hesaplanması. Bu yanında, her bir veri noktasından sonuçları çizelgeye. NOT: Burada oluşturulan hata monte erime sıcaklıklarında hata daha azdır. </li><li> SPSS istatistik paket açın. SPSS bir veri pencerede her bir deney için sıcaklıkları, iki ortalama veri setlerini ve verileri kopyalayın. Değişken sekmesinde, &quot;düşük&quot; olarak ligandsız için ortalama veri kümesi ve &quot;yüksek&quot; olarak en yüksek ligand konsantrasyonu için ortalama veri kümesi ayarlayın. </li><li> Mevcut sözdizimi dosyasını indirinonline olarak http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . &quot;Çalıştır → Çalıştır tüm&quot; seçiniz. </li><li> İlgili ligand konsantrasyonlarında, yeni bir Excel çalışma kitabına orantılı bağlı sonuçları kopyalayın. </li><li> Graphpad yazılımını açın ve bir XY tablo oluşturun. Ligand konsantrasyonu ve sıcaklık sonucu erime için Y sütun için X kolonu kullanılarak, veri girin. Analiz sekmesinde, &quot;değişim analizi parametreleri&quot; seçeneğini seçin. , Doğru modeli giriniz &quot;Yeni&quot; seçin ve &quot;yeni bir denklem oluşturma&quot; için. &quot;Erime sıcaklığı ikili vardiya Analizi&quot; olarak listelenen Tablo 3&#39;te verilen denklemi girin. </li><li> &quot;İlk Değerler Kuralları&quot; kutusunu seçin ve Tablo 3&#39;te detaylı başlangıç ​​değerleri için kurallar girmek. &quot;Için Sabit eşit&quot; olarak, parametre P sınırlama ve liga gibi aynı birimlerde (protein nihai konsantrasyonu girinnd) verilmiştir. NOT: 3. bölümde protokol için bu kutucukları doldurulduktan örnekleri Şekil 1C, D gösterilmiştir. </li><li> Iyi bir uyum varsa, sonuçlar sonsuz ligand konsantrasyonunda beklenen sonuca ekstrapolasyonuyla geliştirilebilir. Her bir ligand konsantrasyonu bağlanmış olan oranının model, ligand konsantrasyonu ve en yüksek değeri değeri inceleyin. Bu 0.99 veya daha büyükse, daha fazla analiz sonuçları iyileştirmek mümkün değildir. </li><li> 0,99 oranı daha az ise, ilave bir aşama, en yüksek ligand konsantrasyonu numunede bağlanmamış proteinin etkilerini gidermek için gereklidir. Aşama 5.2 &#39;de, (başka bir hücre kullanılabilir, ve R2&#39;nin Tablo 3&#39;te denkleme uygun şekilde değiştirilmesi) hücre R2 içinde (adım 5.7), en yüksek ligand konsantrasyonu noktasında bağlanmış ligand oranını mal. Yüksek ligand konsantrasyonu sonuçlarının sonra ortalama fazladan bir sütun oluşturun. FirsT hücresi &quot;lıgand konsantrasyonunu sonsuz uyarlanabilme&quot; olarak Tablo 3&#39;te listelenen denklemi kopyalama. Bu sütundaki kalan hücrelere bu formülü kopyalayın. NOT: Bu hesaplama, en yüksek ligand konsantrasyonuna bağlı olmayan proteinin etkisini ortadan kaldırır. Ligand serbest protein ve en yüksek ligand konsantrasyonu arasındaki fark, her bir sıcaklık noktasında tamamen bağlanmış ve bağlanmamış proteinin durumlar arasında beklenen farkı sağlamak için yüksek ligand konsantrasyonu bağlanmış olan oranının tersi ile çarpılır. Bu fark, ilave ya da tam ligand bağlı proteini için beklenen floresan vermek üzere bağlanmamış durumda çıkartılmaktadır. </li><li> Bu yeni sütun ile SPSS veri sayfasında maksimum ligand konsantrasyonu için sütun değiştirin ve veri uydurma tekrarlayın. NOT: - model maksimum konsantrasyon derecesinden bağ bağlanmış olan orantılı bir başka önemli bir değişikliği ortaya çıkardığı takdirde 5.9 tekrar edilmesi gerekebilir 5.7 adımları(Bu durumda eğer, muhtemelen dahil daha yüksek bir ligand konsantrasyonu noktası deneyi tekrar ideal olacaktır) üzerine. </li><li> Protein, bir ikili kaydırma ve görüntüler kooperatif davranışı gösterir durumda, denklem aşama 4,1 olanlar ile ikame edilmelidir aşama 5.5 önerdi. &quot;Top&quot; ve &quot;Bottom&quot; parametreleri sırasıyla 1 ve 0 ile değiştirilmesi gerekir. </li><li> Yeniden üretilebilirlik sağlamak için en az iki kez (adım 2.12) deney tekrarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design.">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li><li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology.">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li><li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery.">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li><li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry,+thermal+shift+(ThermoFluor)+assay,+and+multiangle+or+static+light+scattering.">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li><li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability,+protein+crystallization,+and+structure+determination.">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li><li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+our+mistakes:+the+'unknown+knowns'+in+fragment+screening.">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li><li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery.">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li><li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions.">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li><li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands.">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li><li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase:+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor.">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li><li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII.">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li><li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region.">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li><li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant.">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).</li><li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+WcbI,+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme.">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li><li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein.">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li><li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans:+a+screening+test+for+binding+specificity.">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li><li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL.">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li><li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

Diferansiyel tarama fluorimetry proteinleri karakterize ve potansiyel protein ligandları teşhis etmek için güçlü ve çok yönlü bir yöntem olarak gücünü göstermiştir. (Özellikle daha az iyi finanse laboratuvarlarda) protein stabilizasyonu, ilaç keşif ve hızlandırılması kristalleşme 10,23-25 ​​de iyi belgelenmiş başarıları bu bileşiklerin ilk taraması için cazip bir yöntem yaptık. Proteinlerine ilave bileşikler, belirgin bir erime sıcaklığı, 7,9 açıkça doza bağlı bir artış göstermektedir. Ancak, afinite için bileşikleri sıralaması yardımcı olmak için görünür bağlanma sabitleri belirlemek için bu deneylerin sonuçlarını kullanmak için birkaç girişimleri olmuştur. Burada, sistematik bir ligandın varlığında, proteinler için belirgin bir ayrışma sabiti belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Burada sunulan sonuçlar DSF hızlı ve güçlü bir şekilde için ayrışma sabitinin tahminleri sağlayabilir göstermektedirBir protein-lijand kombinasyonu. Gözlemlenen veriler parametrelerin olası değerine ilişkin varsayımlar yapmak için gerek kalmadan, K d hızlı bir belirlenmesini sağlamak üzere piyasada mevcut araçları ile manipüle edilebilir. Yöntem, istenilen protein hem de zaman içinde hasis olma, bazı benzer yöntemlere kıyasla önemli bir avantajı vardır. Burada tarif edilen deney, deney başına (üç kopya halinde tekrarlanan deneylerde yaklaşık 0.4 mg) bir protein 0.13 mg tüketecektir. Bu ortalama bir 40 kDa proteini ile tek bir deney benzer miktarda tüketmek izotermal titrasyon kalorimetri (ITC), olumlu ile karşılaştırır. Bu protokol için gerekli deneylerin tam set deney tek bir set için, hazırlık olmak üzere yaklaşık 4 saat etkilerdi. Yine, bu tür güçlü iken, genellikle en iyi verilerin elde etmek için önemli bir optimizasyon gerektirebilir ITC veya yüzey plazmon rezonansı gibi yöntemlere göre önemli ölçüde daha hızlı olması muhtemeldir. Bizim sonuçlar dikkatli ham verileri incelemek için bir gereklilik olduğunu ortaya koymaktadır, bu verilerin uygun erime sıcaklığını belirlemek için, ve erime sıcaklığı verilerinin uygun ayrışma sabiti belirlemek için. İlk sorun, protein erimesi üretilen ham veri şeklidir. Bazı durumlarda, şekil Şekil 1A gözlenene yaklaşık olmayabilir. Ortak sorunlar ligand düşük sıcaklık değişimleri, yüksek arka floresan ve sıcaklık sıradışı çoklu geçişleri içerir. Düşük sıcaklık geçişi ligandlann bir dizi bağlayıcı görülür. Bu yöntem için, en önemli parametre sıcaklık geçişi ile karşılaştırıldığında, Tm ölçüm hatasıdır. , Üçlü Ölçümlerin standart sapması bağlanmamış ve tam bağlı protein arasındaki erime sıcaklık geçişinin% 10&#39;unu yok olduğunda veri genellikle gayet iyi takılabilir. Deneyimlerimiz bu nerede böyle tempıcaklık kaymalar, tek tek veri noktalan son derece hassas ise sadece 2 ° C, bu ayar, verilerin yerleştirilmesi için yeterli olabilir bulunmaktadır. İkinci bir konu alışılmadık eğrileri şekillenir. Ligan bağlama proteininin açılımı modları etkiler gibi bu, genellikle, serbest protein ve ligand bağlı şekilde farklılık gösterir. Bu durumda, kullanıcı, veri erime sıcaklığı ve ayrışma sabiti belirlemek için kullanılacak olan modellerin uygun dikkate alınarak kullanılabilen olmadığını değerlendirmelidir. Başka bir genel sorun, proteine ​​bir kofaktör eklenmesi (örneğin, heksokinaz örneğimizde MgCI2), en güvenilir veri elde etmek için gerekli olmasıdır. Bizim deneyim ilk okutmalarında iyi sonuçları elde etmek esastır aşamasında deneyde tüm olası faktörlerin dikkatli dikkate olmuştur. Ayrıca alternatif teorik tedaviler bu verilerin 15,17 özelliklerini ortaya çıkarabilir. Son olarak, bu C edilen bazı proteinler için nadir değildirontain doğal olarak yüksek eşiğe göstermek için hidrofobik bölgeler maruz bırakılmıştır. Başka yerde yoğun 6,9 gözden geçirilmiş, bu problemlere çözümler vardır. Özel olarak, kullanıcı (örneğin, Şekil 4) ve türevlerinin kullanılması durumunda, birden fazla erir modellenmelidir olup Boltzmann veya türevi modelleri kullanmak için olmadığını değerlendirmelidir. Açılımı termal modelleme iki yöntem Boltzmann yöntemi tutmasına eğrisine düzenli bir sigmoid şekli varsayarak, Boltzmann denklemi deneysel verilere uygun farklı. Bunun aksine, yöntem, her türev noktası (Şekil 1A &#39;da alt panel) deneysel veriler birinci türevi alır ve en birinci türevinin noktası olarak erime sıcaklığı dikkate alır. 3 ° C - türevi Yöntem genel olarak, yaklaşık 2 ile daha yüksek bir erime sıcaklığına döndürür. Çoğu protein, daha tutarlı döndürüriki yöntemden biri için sonucu (yani, üçlü deney için erime sıcaklığının standart hatası daha düşüktür). Bu genellikle iyice eğrisi açılma proteinin tam bir şekli ile ilgili olup, bu deneysel her durumda en iyi yöntemi belirlemek için gereklidir. Türevi modeli kullanıldığında, birden fazla erime olayları dikkate almak da önemlidir. Bazı veriler açıkça çoklu geçişler için kanıt göstermek ve bu durumlarda sonuçlar, bu birden fazla erime olayları modellenmiştir olmadığını yorumlamak daha kolay olması muhtemeldir. Bu protokolün bağlamında, ligand eklenmesi bir protein tersi (en termal kırılgan subdomain stabilize ederek, örneğin) bir tek geçiş birden fazla erime geçişleri sahip kaydırmaya veya neden olabilir genellikle böyledir. Bu nedenle ham veri kullanmak için iyi olacak hangi yaklaşım dikkate alınarak önce birlikte incelendiğinde olduğunu savunmaktadır. M takibenBireysel erime sıcaklıklarının odelling, başka sorunları protokol bölümünde sunulan modeller bu uydurma ortaya çıkabilir. Bu analiz, çoğunlukla gözlenen veri ve modelin arasındaki tutarsızlıkları vurgular gibi dikkatle, bir logaritmik ölçek kullanarak ayrışma sabiti denkleme uyum incelemek için zorunludur (e .g., Şekil 3). Elde edilen sonuçlar genel olarak sağlam iken, yorumlanması bakım verilerden daha iyi sonuçlar elde etmek için fırsat ve en anlama sahiptir. Bu verilerin gündeme belirli bir konu DSF de, birliktelik gösterebilir proteinler, ya da birden fazla bağlayıcı olaylara konulmalıdır yorumudur. Bu, şimdiye kadar sadece çok özel bağlama etkinlikleri (örneğin, WcbM, boyut dışlama kromatografisi ile, bir multimer olarak işlev gören en homologu 26 bir multimer olan protein, [bir veri sahip olmaları beklenir proteinler bu olguyu gözlemledikgösterilmiştir]). Bu günün tüm açık DSF denatürasyondan gözlenen olumsuz kooperativiteye enzim sonuçta olumsuz bir birliktelik göstereceğini belirtir ki değil: ziyade, bu yöntemleri daha geniş bir yelpazede kullanarak daha fazla iyice incelenmesi gerekir karmaşık bağlayıcı bir göstergesi olabilir. Bu tür proteinlerin daha kapsamlı çalışmaların ilginç etkilerini tespit etmek olasıdır ki, bize düşündürmektedir. Bu yöntemi kullanarak ayrışma sabiti için verilen değerler, genel olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi ve yüzey plazmon rezonansı gibi yöntemler tarafından sağlananlar gibi aynı mertebededir. Ancak, gözlenen mutlak değerleri, bu yöntemler kullanılarak gözlemlenen daha sıklıkla yüksektir. Bu, en azından kısmen ayrışma sabiti ligandı ile proteinin erime sıcaklığında görülmektedir gerçeğinin bir sonucudur. Bu Kd fizyolojik sıcaklıklarda daha yüksektir. Dissociation, sabit denklemler ile reaksiyonun sıcaklığı ile ilgili olup: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (C θ standart referans konsantrasyonunu, Δ G reaksiyonun Gibbs serbest enerjisi değişim r, R, molar gaz sabitidir, Δ H reaksiyonda entalpi değişimi ve Δ S reaksiyonunda değişim entropi .) Bu yöntemin ölçülebilir aralığında ayrışma sabitleri ile reaksiyonları, genellikle olumsuz bir Δ Rg sahip olacak ve bu nedenle denkleme sıcaklığındaki bir artışın etkisi [1] ayrışma sabiti arttırılması olacaktır. Her iki Gibbs serbest enerjisini oluşturan Δ H ve Δ S terimler (denklemi [2]) sıcaklık vardıre göre 27 ve ayrışma sabitinin üzerindeki etki, bu sıcaklık bağımlılıkları büyüklüğü ve işareti bağlıdır ve zorunlu olarak etkileşim bağlı olacaktır. Sonuç olarak, bu yöntemle belirlenen ayrılma sabitleri oda sıcaklığında çalışmasına yöntemlerle belirlenen zaman daha yüksek olduğu beklenmedik bir durum değildir. Sıcaklık bağımlılık da, tabii ki, fizyolojik sıcaklıkta daha düşük sıcaklıklarda ayrışma sabiti temin etme eğilimindedir birçok yöntem, bir sorun teşkil etmektedir. Bu ITC farklı olarak, etiketlenmiş bir yöntem olduğu DSF yöntemin diğer bir sorun teşkil etmektedir. (SYPRO Turuncu) kullanılan flüoresan etiket hidrofobiktir ve bu nedenle bazı durumlarda proteinlerin hidrofobik ligandlan ile rekabet edebilir. Sonuç olarak, bazı durumlarda, elde edilen ayrışma sabiti yapay bağlı etiket ile rekabete yükseltilecek muhtemeldir. Bununla birlikte, çeşitli ligandların karşılaştırma (birincil kullanım içinDSF), afinite ile fark bileşiklerin sıralamasını etkiler için yeterince büyük olması olası değildir. Bu yöntemin olası bir dezavantajı, elde edilebilir tespit sınırıdır. Prensip olarak, doğru protein konsantrasyonunun% 50&#39;den daha düşük olduğu, ve bu aralıkta daha değerleri şüpheli doğruluk olması muhtemeldir için Kd değerini ölçmek mümkün olmamalıdır. Aralığın bu sonunda algılama sınırı protein ve boya konsantrasyonlarının azaltılması ile biraz uzatılabilir iken, cihazın, söz konusu protein konsantrasyonundaki azalma daha da engeller. Benzer şekilde, duyarlılık üst ucu ligandın çözünürlükleri tarafından belirlenir. Kd için matematiksel olarak sağlam bir tahmininin elde edilmesi için, yaklaşık olarak bir ligand konsantrasyonu gerektirmektedir ligand-bağlı biçimde de mevcut olan protein,% 90 veri elde edilmesi için çok önemlidirly on kat K d (hayır birliktelik varsayarak). Saptama sınırı bu sebeple, ilgili tampon içinde ligandın çözünürlüğüne onda biri olacaktır. Bu yöntem algılama sınırları tipik olarak protein ve ligand bağlı mM 1 uM ila yaklaşık 1 ila 100 arasında olacağı anlamına gelir. Sonuç olarak, diferansiyel tarama fluorimetry proteinlerin geniş bir aralığına uygulanabilirdir çok yönlü bir tekniktir. Burada yer alan yöntem kullanılarak, hızla ve ucuz bir şekilde farklı ligandlar için bir proteinin afinitesini belirlemek mümkündür. Bu durum özellikle küçük laboratuvarlarda, protein saflaştırma ve istikrar uygulama, metagenomes enzimlerin işlevini veya spesifisitesini ortaya çıkması için büyük bir potansiyele sahiptir ve ilaç keşfi.

Bütün proteinler, diğer çok büyük moleküllerin basit iyon diğer moleküllerin çeşitli bir yelpazede değişen afinitelere sahip, bağlayacaktır. Birçok durumda, proteinler (örneğin, kinaz ATP bağlanma) normal fonksiyon parçası olarak küçük moleküllü ortaklara bağlanmaktadırlar. Diğer etkileşimleri fonksiyonu ile ilişkili olabilir, ancak araçları (kristalleşme başarısını yükseltir, veya çözelti içinde proteinlerin muhafazasına yardımcı olacak şekilde proteinleri stabilize örneğin küçük molekül) deneysel olarak yararlıdırlar; önleyicileri olarak hareket eden ve böylece enzimin aktivitesini modüle edebilen aktif alanlarının ve proteinlerin allosterik sitelere bağlanan küçük moleküller iken. Ortak protein molekülleri için afinitesini belirlemek için kullanılabilecek teknikler, geniş bir yelpazede bulunmaktadır. Izotermal titrasyon kalorimetre 1 bu tepkiler üzerine zengin bilgiler sunmaktadır yaygın olarak etiket ücretsiz, bir &quot;altın standart&quot; olarak görülüyor ve fırsatları sınırlıdırDeney rtifacts. Ancak, enstrümantasyon ve deneysel set-up otomasyon duyarlılığı son gelişmelere rağmen, hala protein gereksinimi açısından nispeten pahalı en iyi düşük-orta verim olmasıdır, ve orta ile etkileşimleri en uygundur yüksek afinite (Kd 100 uM ila 10 nM) 2&#39;dir. Böyle kayn veya iki tabakalı enterforemetre 3 teklif daha throughputs ve hassasiyet elde etmiş gibi diğer etiket ücretsiz yöntemler 100 Da gibi düşük küçük moleküllerin tespit. Ancak, bu yöntemler için yüksek verimlilik araçları nispeten pahalı, ilgili projelerin sürekli bir verimlilik olacak, sadece nerede haklı, ve pek çok akademik laboratuvarlara erişilemez olması muhtemel olan. Diferansiyel tarama fluorimetry (DSF veya thermofluor) birinci ilaç keşfi için bir yöntem olarak 2001 4&#39;te tarif edilmiştir. Bu metho olarakd, proteinleri bir floresan boya ile kuluçkalanır (başlangıçta naftalen-sülfonik boyalar kullanılmıştır), proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanması üzerine flüoresanını değiştirir edilmektedir. Protein boya Numune daha sonra ısıtılır ve ısı arttıkça floresan izlenir. Proteinin, açılma ve proteinin hidrofobik parçaları maruz kalma sıcaklığı (Şekil 1A) bir fonksiyonu olarak floresansta bir karakteristik örneğini ortaya çıkarmaktadır. Deney, herhangi bir ticari kantitatif PCR cihazda küçük hacimlerde gerçekleştirilebilir ve bu nedenle tek bir deneyde, bir numune aynı anda çok sayıda (enstrüman modeline bağlı olarak, genellikle 48, 96 ya da 384 örnekleri,) test edilebilir. Deneyler genellikle örnekleri 5 yüksek kapasiteli analiz etme olanağı sağlayan bir saat civarında gerçekleştirilebilir. Metodolojiye daha fazla iyileştirmeler, daha iyi spektral özellikleri 6,7 ile boyaların benimsenmesini gördük </sup&gt;, genel veri analizi için araçlar ve ilk tarama 8,9 protokolleri önerdi. Yöntemin uygulama yelpazesi hazırlanması ve proteinlerin 10 depolanması için en iyi koşulları oluşturulması ve kristalleşme 11 yardım için potansiyel bağlanma ortakları belirlenmesi üzerine özel bir odaklanma ile, genişletilmiştir. Yöntemin, nispeten yüksek miktarda protein, görece düşük maliyetli bir (~ 2 reaksiyon başına ug) ve zayıf bağlanma molekülleri okuyan uygulanabilirliği Akademik bağlamda, özellikle 12-14, DSF parçası bazında ilaç tasarımı için değerli bir araç yaptı. Protein-ligand etkileşimleri okuyan DSF geniş uygulama olmasına rağmen, az sayıda çalışma bu çalışmalardan ayrılma sabitlerinin belirlenmesini tarif etmişlerdir. Ancak, bu seyrek veri veya bazı durumlarda e takılmalıdır birçok parametre ile, proteinin açılımı anlatan detaylı denklem üretmek eğilimi var7,15-17 stimated. Bu yöntemler, örneğin olağandışı geçişleri gösteren sıkı bağlayıcı bileşikler, ya da proteinler olarak, zor durumlarda özellikle önemlidir. Ancak, birçok laboratuvarlar için, bu ayrıntılı analizler rutin kullanım için çok zahmetlidir. Bu nedenle, farklı senaryolar için alternatif tedaviler öneriyoruz, ve bu farklı protein-ligand etkileşimleri kaynaklanan veri sığdırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bizim yöntem ısmarlama veri analiz yazılımı mevcut olduğu için StepOne QPCR enstrümanı kullanır; bu, veri analizi hızlandırır iken, diğer cihazlarla elde edilen sonuçlar, daha önce yayınlanmış yöntemler kullanılarak 9 işlenebilir ve aynı alt analizi gerçekleştirilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Yöntem çok çeşitli henüz protein arasındaki ayrışma sabiti belirlenmesi ve küçük molekülleri etkileşim için kullanılabilir. Ancak bunların çoğu uzman ekipmana ihtiyaç ve genellikle etkili güvenilir deneyler kurmak ve verileri analiz etmek için bir uzmanlık derecesi gerektirir. Diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) artan ya da fizyolojik ortakları belirlemek için ya da vurma çıkarılması için küçük moleküller için etkileşen proteinlerin başlangıç ​​taranması için güçlü bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, nicel PCR için uygun olan ve en enstrümantasyon kurumlarda kullanılabilir böylece uygun bir PCR makinesi sadece gerektirmesi avantajına sahiptir; protokollerin mükemmel bir aralık zaten mevcuttur; ve yöntemin birden fazla kullanım için literatürde güçlü örneği yoktur. Geçmiş çalışma DSF verilerinden ayrışma sabitleri hesaplarken çeşitli araçları önerdi, ancak bu matematiksel talep ediyorlar. Burada, demlenmeyeonstrate DSF deney verileri orta düzeyde bir miktarının sapma sabitlerini hesaplamak için bir yönteme ilişkindir. Bu veriler, tipik olarak toplanmış ve bir gün içerisinde analiz edilebilir. Biz basit bir bağlama olaylardan toplanan verileri sığdırmak için nasıl kullanılabileceğini farklı model göstermek ve kooperatif bağlanma veya bağlama bağımsız siteler mevcut nerede. Son olarak, biz standart modeller geçerli değildir bir durumda veri analizi bir örnek sunuyoruz. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen kontrol proteinleriyle ilgili toplanan verilerin, ve araştırma programı iki protein ile gösterilmiştir. Genel olarak, bizim yöntem araştırmacılar hızla DSF kullanarak protein-ligand etkileşimleri içine daha fazla fikir edinmek için basit bir yol sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry at JoVE.com

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.1K Görüntüleme.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Biyoloji

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...