I. NanoDrop 2000c Spektrofotometre NanoDrop teknolojisi Küvet veya kapiler kullanmadan microvolume örnekleri iki optik kaideleri arasında tutun ve ölçmek için yüzey gerilimi kullanan yenilikçi bir örnek tutma sistemi dayanmaktadır. NanoDrop 2000c spektrofotometre proteinlerin 0.5-2 mcL damlacıkları, DNA, RNA ve diğer biyomoleküllerin hızlı ve kolay bir şekilde ölçmek için bu teknolojiyi kullanır. Moleküler teknikler sürekli analiz için küçük miktarlarda malzeme kullanmak geliştikçe bu yeteneği giderek daha önemli hale gelmiştir. Microvolume spektrofotometre örnek sınırlı olduğu koşullar için idealdir. Bol miktarda örnek mevcuttur Ancak, kullanım kolaylığı, hızlı ölçüm döngüsü ve ve geniş konsantrasyon aralığında spektrofotometre uygun hale getirmek. Ölçüm döngüsü de büyük ölçüde bilim adamlarının kendi iş akışı boyunca verimliliği artırmak yardımcı azalır. Microsample doğrudan algılama yüzey üstüne yerleştirilir ve yüzey gerilimi, fiber optik uçları arasında bir sıvı sütunu oluşturulur. Bu sıvı sütunu dikey bir optik yol oluşturur. Xenon flaş lambası, ışık kaynağı ve lineer bir CCD dizi örnek geçer ışığında analiz etmek için kullanılır kullanan bir spektrometre sağlar. Sistemi gibi küvetler gibi geleneksel çevreleme cihazlar kaldırma birçok avantajı vardır: çok küçük miktarda numune ölçüm için gerekli olan temizleme sadece bir laboratuvar beziyle optik yüzeyleri silerek gerektirir ve yol uzunluğu ölçümü sırasında gerçek zamanlı olarak değiştirilebilir. NanoDrop 2000c dilüsyonları olmadan, olası protein konsantrasyonu ölçümleri en geniş yelpazesi sunmaktadır (1 mm ile 0.05 mm) otomatik olarak en uygun yol uzunluğunu belirler. Yol uzunluğu kısaltarak, daha yüksek protein konsantrasyonları ölçülebilir. Bu etkili, çok protein örnekleri için dilüsyonları gerçekleştirmek için gereksinimini ortadan kaldırır. Örneğin, NanoDrop 2000c BSA konsantrasyonlarının 400 mg / ml gibi yüksek ölçebilirsiniz. NanoDrop 2000c Spektrofotometre, DNA, RNA, protein, ve diğer biyomoleküllerin absorbans ölçmek için tam bir spektrum spektrofotometre. Bu video protokolü proteinlerin ölçümü üzerinde durulacak. II. A280 Absorbans Ölçümler kullanarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini a. A280 Ölçümler Prensibi Triptofan, 280 nm Tirozin, fenilalanin kalıntı veya Sistein-Sistein disülfit bağları ve sergi absorbans içeren saflaştırılmış proteinler Protein A280 yöntemi uygulanabilir. Bu yöntem, saflaştırılmış protein konsantrasyonu hesaplamak için kitlesel yok katsayısı veya molar sönüm katsayısı ile birlikte A280 absorbans değeri kullanır. Doğrudan A280 ölçümleri avantajı bir standart eğri nesil protein konsantrasyonu belirlemek için gerekli değildir. Örnek bir uncharacterized protein solüsyonu, hücre lizatı, ya da ham protein ekstresi ise, daha sonra, BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry testleri gibi NanoDrop 2000/2000c önceden yapılandırılmış kolorimetrik yöntemler kullanarak önerilir. b. Microvolume Protein A280 Ölçümler - Başlangıç <ol><li> Protein A280 uygulama ana menüden seçin. </li><li> Açılan listeden ölçülecek numune türü seçin. En bilinmeyen protein karışımları 1 Abs = 1 mg / ml. Varsayılan ayarı için tavsiye edilir Eğer önceden karakterize saflaştırılmış protein ölçümü, daha sonra kitlesel yok katsayısı veya molar sönüm katsayısı ve molekül ağırlığı da daha doğrusu protein konsantrasyonu belirlemek için girmiş olabilir. </li><li> Konsantrasyon birimleri açılan listeden seçin. </li></ol> c. Microvolume Protein A280 Ölçümleri - Körleme <ol><li> Uygun bir tampon kullanarak boş bir kurun. Protein asılı olduğu tampon kullanmak önemlidir. Kullanılan tampon aynı pH ve örnek çözüm olarak benzer bir iyonik gücü olmalıdır. Not: RIPA tamponlar, 280 nm&#39;de çok absorbans katkıda bulunan ve bu nedenle doğrudan A280 protein ölçümleri ile uyumsuz. RIPA tamponunda askıya proteinler, protein konsantrasyonu RIPA tampon uyumlu kolorimetrik assay kullanılarak belirlenecek tavsiye edilir. </li><li> Pipet 2 alt kaide üzerine uygun bir kararma çözüm mcL, kol alt ve Boş tıklayın. </li><li> Boş bir çözüm kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri silin. </li></ol> d. Ölçüm Microvolume Protein A280 Ölçümleri Son derece önemli noktalar: örnek homojenlik.Böyle bir küçük hacimli bu yana önemli ölçülen. Yavaşça örnekleri homojen olduğundan emin ama iyice ölçümü için bir kısım alınarak hemen önce örnekleri bir arada. Karıştırma ve pipetleme sırasında kabarcıklar tanıtan kaçının. Farklı proteinler arasındaki yüzey gerilimi değişkenliği nedeniyle, uygun sütun oluşumunu sağlamak için numune 2 mcL yükleme öneririz. Her zaman düşük tutma pipet uçları kullanın. Pipet ucu dışarıda kalarak çözüm önlemek için çözüm sınır dışı bir örnek yüklemek için, optik alt kaide yüzeye pipet ucu dokunun. Blowout ve örnek kabarcıkları giriş önlemek için, numunenin tam bir miktardan daha az boşaltınız. <ol><li> Uygun alan bir örnek kimliğini girin, 2 boş ve tıklama ölçün açıklandığı gibi ilk örnek mcL yükleyin. Her bir ölçüm için, örnek bir taze 2μL kısım kullanılmalıdır. </li><li> Kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri örnek çıkarın. </li></ol> e. Temizleme Microvolume Protein A280 Ölçümler Sıradan bir, tüy bırakmayan bir laboratuar silin genellikle ölçümler arasındaki optik kaideleri temizlik için yeterlidir. f. Yenileme Protein A280 ölçümler yapma Yüzey içeren çözeltiler ve reaktifler formu için örnek sıvı sütunu önlenmesi, zaman içinde ölçüm kaide yüzeyleri uncondition olabilir. Düzleşme alt kaide üzerinde damlacık bir optik yüzey şarta bağlı olma göstergesidir. Yüzey özellikleri tehlikeye varsa, kaideleri yenileme örnek sütun oluşumu sağlamak önemlidir. Eğer bu olursa, devetüyü şiddetle laboratuar silin ya da yönetmen olarak (PR-1) NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik kullanarak optik yüzeyler. III. Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini Kolorimetrik Tahliller a. Kolorimetrik algılama ilkesi NanoDrop 2000c spektrofotometre kolorimetrik testleri kullanarak uncharacterized protein çözümleri, cep lizatları, ve ham protein ekstreleri de ölçmek için kullanılan olabilir. Kolorimetrik yöntemleri boya, görünür dalga boyu aralığında ışığı emer yeni bir kompleks üretmek için örnek protein bileşeni ile etkileşim gerektiren dolaylı yöntemler. NanoDrop 2000c spektrofotometre BCA, Bradford, Pierce 660 ve Lowry yöntemleri de dahil olmak üzere birçok önceden yapılandırılmış kolorimetrik testleri vardır. BCA testi kolorimetrik tahlil microvolume spektrofotometre kullanarak bir örnek olarak gösterilebilir. (Ekran görüntüsü) BCA (Bicinchoninic Asit) testi genellikle seyreltik protein çözümleri ve proteinlerin varlığında önemli UV (280 nm) absorbans bileşenler için kullanılan ortak bir kolorimetrik yöntemle. Protein A280 yönteminin aksine, Protein BCA yöntemi örnek protein konsantrasyonu ölçülebilir önce bir standart eğri oluşturulur olmasını gerektirir. Bu yöntem algılama reaktif bicinchoninic asit (BCA) kullanır. Protein varlığında oluşan Cu-BCA şelat 562 nm&#39;de ölçülür ve 750 nm dalga boyunda normalize edilir. b. Microvolume BCA Testi Ölçümleri BCA Testi Hazırlık <ol><li> BCA reaktif A, B BCA reaktif, Uyumluluk reaktif, Sulandırma tampon ve Albumin (BSA) standartlarına: Gerekli reaktifler indirgen uyumlu kiti (Thermo Scientific Pierce kedi hayır 23250) bulunur. </li><li> Oda sıcaklığına kadar bilinmeyen tüm proteinler ve protein standartları dengelenmesi ve iyice karıştırın. </li><li> Standartları ve reaktif bir 50:1 oranı kullanılarak ölçülecek numune için yeterli taze çalışan reaktif hazırlayın: B </li><li> Mikro testi için örnek çalışma reaktifi 1:1 oranında kullanın. Tüm örnekler ve standartları karşılamak için yeterli tüpleri ile her tüp reaktif çalışan 10 mcL ekleyin. Yüksek oranda test için örnek çalışma reaktifi 20:01 oranı kullanın. Tüm örnekler ve standartları karşılamak için yeterli tüpleri ile her tüp reaktif çalışan 190 mcL ekleyin. Örnekler için uygun oranı belirlemek için Pierce BCA kiti edebiyatına bakın. </li><li> Her tüp içeren reaktif standart ya da numune 10 mcL ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız. </li><li> 37 tüpleri ° C&#39;de 30 dakika. </li><li> Reaksiyonların, oda sıcaklığında (~ 10 dakika) gelmesini sağlayın. </li></ol> c. Standart Eğri oluşturma Microvolume BCA Testi Ölçümleri <ol><li> Protein BCA yöntemi ana menüden seçin. Dalga boyu doğrulama penceresi belirirse, kol aşağı doğru olduğundan emin olun. </li><li> Sağ bölmede tabloda her bir standart konsantrasyon değerleri girin. Yazılım, referans ve en fazla 7 addit sağlarional standartları. Referans ve / veya standartlara çoğaltır ölçülmelidir. Not: standart eğri üretimi için minimum gereksinimi iki standartları ölçüm veya sıfır referans ve en azından tek bir standart ölçüm. Bu beklenen tahlil konsantrasyon aralığında karşılamak için gerekli ilave standartlar dahil olması tavsiye edilir. </li><li> Boş bir kurun. Kolorimetrik deneyleri için boş genellikle H 2 O. deiyonize </li><li> Pipet dH 2 O 2 mcL alt kaide üzerine, kol alt ve Boş tıklayın. Sadece boş bir sonraki tüm ölçümler, referans ve standartları karşılamak için gerekli. </li><li> Alt kaide üzerine herhangi bir protein ile sadece çalışan reaktif ve tampon içeren 2 mcL kısım pipetleme referans oluşturulması. Alt kol ve tıklama ölçün. </li><li> Standartları sekmesi altında, istenilen standart ve alt kaide üzerine istenen standart pipet 2 mcL vurgulayın. Alt kol ve tıklama ölçün. Tüm standartları için bu işlemi tekrarlayın. Önce tüm standartlara ölçme örnekleri ölçmek için emin olun. Standart Eğri standart eğri görüntülemek için Göster&#39;i tıklatın. </li></ol> d. Microvolume BCA Testi Ölçümleri 2 mcL Protein Ölçümleri <ol><li> Standartlarının tüm ölçülen sonra, Örnekleri düğmesini tıklatın. Örnek kimliğini girin. Örnek alt kaide üzerine 2 mcL Yük ve Ölçme tıklatın. Her bir ölçüm için örnek taze 2 mcL kısım kullanılmalıdır. </li><li> Kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri örnek silin. </li></ol> e. Microvolume BCA Testi Ölçümleri Temizleme ve Yenileme Temizlik ve yenileme doğrudan A280 absorbans ölçümleri açıklandığı gibi gerçekleştirin. Temsilcisi Sonuçlar: Microvolume A280 ölçüm doğrudan veya dolaylı bir kolorimetrik tahlil ya protein konsantrasyonu tayini yapılır. A280 ölçüm örnek protein ilgi yok katsayısı dayalı protein konsantrasyonu belirler. BCA kolorimetrik tahlil örneği bilinen protein konsantrasyonları, standart bir eğri tabanlı protein konsantrasyonu belirler.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler ve araçları üreten Thermo Fisher Scientific çalışanları.

Microvolume kantitatif iki ölçüm yüzeyleri arasında bir sıvı sütunu oluşturmak için bir örnek içsel yüzey gerilimi özellikleri kullanır. Çevreleme cihazın bulunmaması, yol uzunluğu aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırarak, gerçek zamanlı olarak değiştirmenize olanak sağlar. Bu özellik, protein konsantrasyonları dinamik aralık gibi ölçüm hızı önemli ölçüde artar. Örnek az miktarda kullanarak, örnekleri çok sayıda bilim adamları daha fazla ölçümleri almak ve daha iyi kalite kontrolü sağlamak için izin hızlı ve doğru bir şekilde analiz edilebilir. Buna ek olarak, ve gerekirse, değerli örnekleri bir ölçüm aldıktan sonra kurtarıldı olabilir. Böyle küçük hacimli ölçülen zaman, örnek homojenlik örnekleme hatalarını önlemek için son derece önemlidir. Düşük tutma pipet uçları her zaman yükleme örnekleri için kullanılan ve örnek çoğaltır arasındaki ipuçlarını değiştirilmesi gerekir. Kaide yüzeyleri düzgün bir şekilde temizlenmeli ve en doğru sonuçları elde etmek için klimalı olmalıdır. Son olarak, örnek sınırlı microvolume spektrofotometre ideal olmakla beraber, kullanım kolaylığı, hız ve geniş dinamik aralık spektrometre örnek bol olduğunda uygun hale.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Geleneksel spektrofotometri Küvet veya kapiler içine yerleştirerek örnekleri gerektirir. Bu genellikle, genellikle protein analizi için kullanılan sınırlı örnek hacmi nedeniyle pratik. Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrofotometre numune miktarının 0.5-2 mcL düşük hacim sağlayarak, sıvıların yüzey gerilimi özelliklerini kullanarak iki ölçüm yüzeyleri arasındaki microvolume örnekleri tutan yenilikçi bir örnek saklama sistemi ile bu sorunu çözer. Küvet veya kılcal damarların ortadan kaldırılması, dinamik aralık ölçülebilir protein konsantrasyonları önemli ölçüde artırırken ölçüm zamanını azaltır yol uzunluğu gerçek zamanlı değişiklikleri, sağlar. Dilüsyonları için ihtiyaç da ortadan kaldırılabilir ve ölçüm yüzeyleri sadece laboratuar silin ile silinebilir olarak numune ölçümü için hazırlıklar nispeten kolay. Bu video makale A280 absorbans okumaları veya BCA kolorimetrik tahlil kullanarak microvolume miktarda protein ölçümü için geleneksel protein konsantrasyonu tespiti yöntemlerine değişiklikler sunar.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

113.1K Görüntüleme.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Biyoloji

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...