This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer&#8217;s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

Tüm prosedürleri ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları Sağlık Rehberi National Institutes göre hayvanlarla ilgili protokolleri gerçekleştirin. Burada anlatılan prosedürleri gözden ve Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Baylor College tarafından kabul edildi. Kemirgen beyin transgen için replikasyon-yetersiz adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri Biyo güvenlik seviyesi 1 kullanım için onaylanmıştır. Uygun koruma ve virüs kullanım prosedürleri ile ilgili özel gereksinimler detayları &quot;Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarları (BMBL) Biyogüvenlik&quot; ABD Hükümeti yayın için CDC web sitesine bakın. Virüslerin kullanıldığı işlemleri için kurumsal özel gereksinimleri öğrenmek için yerel veteriner ve çevre güvenliği personeli ile kontrol edin. Prosedür odaları, karantina ve biyolojik tehlike kafesleri belirlenmesi ile ilgili yönetmelikler kurumlar arasında farklılık gösterebilir. 1. ÖnP0 Pups ve Foster Anneler pare <ol><li> Bütün hamile ve emziren dişiler üreme ve laktasyon enerji taleplerini desteklemek için yüksek yağ chow sağlayın. </li><li> Akşamları, bir tek yerleşik erkek kafesine bir veya iki sağlıklı kadın ekleyerek bir yetiştirme kafesi yukarı ayarlayın. Sonraki sabah, bir birleşme fiş kadın kontrol etmek ve bir fiş mevcut ise, erkek ve dişileri ayrı gelen. <ol><li> (Örneğin, C57BL / 6 veya C3HeJ) kötü anne özellikleri olan bir genetik geçmişe ikinci yavrular artırmak için koruyucu anneler kullanın. Transfer yavrular üvey annenin kendi çöp dört gün içinde doğmuş olması gerekir üvey anneler başka bir aileden gelen yavrular kabul. </li><li> Kadın iki kümesi yaklaşık olarak aynı zamanda uygulanması ve böylece deneysel yetiştiriciler yanında ICR veya FVB kadın kullanarak ayrı bir birleşme kafes kadar ayarlayın. </li></ol></li><li> Dişiler plan suşu bağlı olarak, fiş tarihinden itibaren 19 ± 1 gün içinde teslim edecek. Üç gün önce d(16 gün fiş tarihinden sonra) elivery, taze iç içe malzeme ve kapalı barınak ile temiz bir kafese hamile kadın yerleştirin. </li><li> Günde iki kez, beklenen doğum tarihinden 2 gün önce (17 gün fiş tarihinden sonra) başlayan yenidoğan yavrular için kontrol edin. Pembe yenidoğan varlığı için alt atmayı ile annelere minimum stresle kafes inceleyin. Fareler genellikle öğleden sonra teslim edecek Sabah, ancak nadir durumlarda yavrular teslim. </li><li> Yavrular, ya da hangisi önce doğum 6 saat, içinde (görünür süt noktalar belirgin olacaktır) hemşirelik gibi kısa sürede enjeksiyonları gerçekleştirmeyi planlıyoruz. </li></ol> 2. Enjeksiyon için donatım hazırlayın <ol><li> Genel P0 yenidoğanlar için 32 G iğne ile 10 ul enjeksiyon şırınga hazırlayın. Steryotaksik enjeksiyon performans ise, manipülatör kolunun üzerine şırınga monte. </li><li> Enjeksiyonlar için bir stereotaksik çerçeve kullanılıyorsa,% 100 Ethan ekleyerek 4-8 ​​° C&#39;ye kadar soğutulması aşamasını yenidoğanol ve bloğun ön ucunda hazneye kuru buz. Yavruların donmaya önlemek için 1 ° C üstünde bir sıcaklığa koruyun. </li></ol> 3. Enjeksiyon için viral seyreltilerde hazırlayın <ol><li> ,% 1 tripan mavi boya solüsyonu (20x stok) hazırlayın. </li><li> Sınıf 2 biyogüvenlik kabini içinde adeno-ilişkili virüs (AAV) stokunun 5-25 ul alikotları hazırlayın. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de bu alikotları yerleştirin. Bu iletim etkinliğini kaybedecek virüs neden olur gibi ek donma-erime döngülerinden kaçınmak. </li><li> Çözülmesi için buz üzerine -80 ° C dondurucu ve yerden AAV bir numuneyi çıkarın. </li><li> Buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içine virüs seyreltilmesi ile enjeksiyon için viral çözelti hazırlayın. Transdüksiyon modeli ilk optimizasyonu için bir on kat seri seyreltme (10 10 8 10, viral partikül / yarıküre) ile başlar. </li><li> % 0.05 kadar bir son konsantrasyon elde etmek için, AAV çözeltiye 20x tripan mavisi ekleyin. </li></ol><psınıf = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Enjeksiyon için Yenidoğan Pups evreleme <ol><li> Soğutmak için buz üzerinde küçük bir alüminyum levha yerleştirin. Kuru görev soğuk metal yavrunun cildi korumak için levhanın üstüne silin yerleştirin. Bu yavrular anestezi ve enjekte edilmesi için düz bir soğuk bir yüzey olarak görev yapar. </li><li> Sıcak önce ve enjeksiyondan sonra neonatal fareler tutmak için uygun bir ısınma dolgusunu hazırlayın. </li><li> Yenidoğan yavrular hemşire başladı sonra, kafesin bunların yaklaşık yarısının kaldırmak ve anneleri ile diğer yarısını bırakın. Enjeksiyonu beklerken ısınma pad üzerinde toplanan yavrular yerleştirin. NOT: biyolojik anne yavrular için umurumda değil, derhal kafesten tüm çöp kaldırmak ve enjeksiyon beklenmeye bir ısınma pad üzerine yavrular yerleştirin. Bu durum C57BL / 6 kadın veya zayıf üreme özelliklerine sahip diğer kendilenmiş suşları ile doğan ilk yavru ile ortaya çıkabilir. Bu durumda, süt noktalar yenidoğan yavrular görünür olmayacaktır. </li><li>Hipotermi anestezi sağlamak, soğuk metal plakanın üzerine ısınma pad itibaren bir yavru aktarın. Yavru tamamen anestezi olmak için 2-3 dk bekleyin. Çok nazikçe bir pençe sıkarak anestezi onaylayın ve hareket ya da solunum eksikliği izlemek. </li></ol> Yenidoğan Farelerde içine AAV&#39;nin 5. Enjeksiyon <ol><li> Ücretsiz el yenidoğan farelere AAV&#39;nin içi enjeksiyon: <ol><li> Yük enjeksiyon şırınga içine% 0.05 tripan mavisi ile seyreltilmiş AAV&#39;nin 5 ul. </li><li> Yavaşça% 70 etanol batırılmış bir pamuklu çubukla anestezi yavru başını silin. </li><li> Her göze lambda dikişine gelen mesafe 2/5 enjeksiyon siteleri belirlemek. Alternatif bir enjeksiyon sitesi yaklaşık 0,8-1 mm yarım lambda ve bregmadan arasındaki, sagital sütür gelen yanal yer almaktadır. Bu görülecek P0 deri yoluyla görebilir. </li><li> Toksik olmayan bir laboratuar kalem ile enjeksiyon yerinde işaretleyin. </li><li> Monitörler için görünür skala ile şırınga tutunçözeltinin hacmini toring dağıtılır. </li><li> Başparmak pistonun üst ulaşmak emin olun. Virüs dağıtım yanlışlıkla önlemek için iğne konumlandırma ederken Sonra pistonu başparmak çıkarın. </li><li> Buz kovası kol bankta dirsek koyarak ve eğilerek enjeksiyon için kol brace rahat bir pozisyon bulun. </li><li> Doğrudan şırınga altında kafası ile yan yavru yatıyordu. İşaretli enjeksiyon sitesi yukarı bakacak şekilde yavrunun kafasını çevirin ve yavaşça ama sıkıca açık bir elinizle bu konumda tutun. </li><li> Kafatasının yüzeyine dikey enjektörü ve yaklaşık 3 mm&#39;lik bir derinliğe kadar işaretli enjeksiyon yerinde iğneyi. Direnç iğne yanal ventrikül içine nüfuz ettiğini göstermektedir, hafifçe düşer kadar iğne enjekte edilir. Referans ihtiyaç varsa, toksik olmayan makinesi iğnesinin ucu 3 mm işaretleyin. Boya t dayalı yavru boyutu ve suş için enjeksiyon derinliğini ayarlayınventriküllerin argeting. </li><li> Piston beyne uzak iğne hareket olmayan depresif olabilir, böylece katı bir şırınga tutun. Enjeksiyon talamus itildiğinde, ağız yoluyla dağıtımı ciddi sınırlı olacaktır. </li><li> Şırınga dağıtılan seviyesini izlerken yavaş virüs enjekte başlayın. Her ventrikül içine 2 ul maksimum hacmi yönetmek. İğne doğru pozisyonda ise, boya ventrikül doldurmak yayılacak. </li><li> Yavaşça iğneyi çıkartın. </li><li> Ilk enjeksiyon sitesi diğer yarımkürede enjekte önce kapatmak için izin verin. NOT: Bir kez daha aynı site daha enjekte etmeyin. Zaten kaçak enjekte ve yavru yaralanma veya ölüme neden olmuştur iğne güçleri virüs reinserting. </li><li> Aynı prosedür kullanılarak, karşı ventrikül enjekte edilir. </li></ol></li><li> Yenidoğan farelere AAV&#39;nin stereotaksik enjeksiyonu: <ol><li> % 0.05 tripan mavisi int ile seyreltildi, AAV&#39;nin yük 5 ulstereotaksik manipülatör tarafından düzenlenen enjeksiyon şırınga o. </li><li> Yavaşça yenidoğan çerçevenin kulak çubukları arasında yavrunun kafasını yerleştirin. Emin baş lambda ve bregmadan arasındaki çizgi sahneye paralel olduğunu kontrol ederek Y-ekseninde seviyesi (önden arkaya) olduğundan emin olun. Emin kafa kulaklar, ya da gözleri arasında bir çizgi arasında bir hayal çizgi, sahneye paralel olduğunu kontrol ederek X-ekseninde seviyesi (yan yana) olduğundan emin olun. </li><li> Yavaşça% 70 etanol batırılmış bir pamuklu çubukla anestezi yavrunun kafasını silin. </li><li> Lambda Yukarıda şırınga konumlandırmak için stereotaksik manipülatör kullanın ve daha sonra X ve Y koordinatlarını sıfır. = (X, Y) stereotaksik kollarını hareket ettirin (0.8, 1.5) standart P0 yavrular için mm. NOT: Pup boyut ve stereotaksik koordinatlar zorlanma ve yaşa göre değişebilir. Lateral ventriküllerin hedef gerektiği gibi boya enjeksiyonu dayalı koordinatları ayarlayın. </li><li> Yavaş yavaş enjeksiyon yerinde içine iğne düşük. Kafatasının yüzeyi ind doyurmayaİğne cildi nüfuz sonra ent ve sonra serbest bırakın. Kafatası normal içbükey şeklini kurtarır kadar iğne geri çekin, ancak cilt altında iğne eğim tutun. Z bu noktada koordinat sıfır. </li><li> Z = -1.7 mm kadar iğne takın ve daha sonra -1.5 mm çekin. </li><li> Yavaş yavaş virüs enjekte. Her hemisfer çözüm 2 ul kadar kabul edebilir. </li><li> Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, 30-60 saniye yerinde tutmak ve şırınga daha sonra yavaş yavaş 1-2 dakika boyunca iğne geri çekilir. </li><li> Enjeksiyon bölgesinde için X-ekseninde negatif koordinatlarını kullanarak, Kontralateral hemisferde için tekrarlayın. Not: enjeksiyon için alternatif koordinatlar (X, Y, Z, (=), 0.8, 2.0, -1.5) mm (1.2, 1.0, -1.5) mm. (0.8, 2.0) ilk enjeksiyonu işlemi, son olarak da (0.8, 2.0), (1.2, 1.0) ve (1.2, -1.0) hareket ettirin. , Hemisfer başına 2 ml&#39;lik bir toplam her yerinde çözeltinin 1 ul enjekte edilir. Les yordamı tamamlamak için enjeksiyonlar arasında hızla hareket10 dakika daha lar. </li></ol></li></ol> 6. Post-enjeksiyon Bakımı <ol><li> Her iki yarımkürede içine enjeksiyon tamamladıktan sonra, normal vücut ısısı ve cilt rengi dönene kadar ısınma pad üzerinde yavru geri yerleştirin ve yavru hareket etmeye başlar. </li><li> Enjekte yenidoğanlar hemşire biyolojik anne kullanıyorsanız bunlar normal hareketini kurtarmak sonra, biyolojik anneye enjekte yavrular dönmek. Isınma pad üzerinde kalan Uninjected yavrular yerleştirin. Tüm farenin enjekte edilene kadar işlemi tekrarlayın. </li><li> Enjekte yenidoğanlar hemşire için üvey annen kullanıyorsanız bunlar normal hareketini kurtardıktan sonra, bakım için üvey annenin bütün enjekte yavrular aktarın. <ol><li> Enjekte edilen hayvanların başarısını sağlamak için çoğu veya kafesinden Üvey anneden ait yavruların tümünü kaldırmak. </li><li> Foster annenin yavruların ve enjekte yavrular aynı göz ve cilt rengi varsa onlar olabilir böylece, bir laboratuar kalem ile beslemek anneden yavrular işaretlemekDaha sonra ayırt. </li><li> Foster annenin yavrularını ve enjekte yavrular ile birlikte onların yatak bazı yerleştirin. Enjekte yavrular yeni yavruların kabul iyileştirmek için onun biyolojik yavruların kokusunu elde emin olun. </li><li> Geri foster annenin kafesine içine sadece enjekte yavrular yerleştirin. Üvey anneden kalan yavrular itlaf. </li></ol></li><li> Anne katılıyor ve kafesin içine yerleştirerek 10 dakika içinde enjekte yavrular hemşirelik emin olun. Anne, bu süre içinde yavrular toplamak değilse, başka bir bakıcı anneye yavrular transfer. </li><li> Bu viral-enjekte hayvanları içerdiğini göstermek için bir biohazard kartı ile kafesi etiketleyin. Ev 72 saat boyunca onaylı bir bölgede kafes. </li><li> 72 saat karantina döneminden sonra, temiz bir kafes anne ve yavrular (ancak hiçbir yatak veya diğer kafes öğeler) aktarın. Herhangi bir viral-kontamine yatak maruz kalmasını önlemek için bir Düzey 2 biyogüvenlik kabini içinde bu transferi gerçekleştirin. Rnormal fare tesisine enjekte edilmiş hayvanlardan olan temiz bir kafes eturn. </li><li> , Biyolojik olarak tehlikeli torba içine kirli kafes yerleştirin otoklavlanarak sterilize edilir ve daha sonra vivaryum için kafes döner. </li></ol> 7. Temizleme <ol><li> Ileride kullanılmak üzere 4 ° C &#39;de, geri kalan virüs çözümü yerleştirin. 4 ° C&#39;de 8 arasında saklandığında en az bir virüs, 2 ay boyunca transdüksiyon etkinliğinin muhafaza eder. </li><li> Iyonu giderilmiş su içinde tekrar kez durulanır ve ardından% 2 ağartıcı ile bir iğne ve şırınga dezenfekte. </li><li> % 70 etanol ile takip% 2 çamaşır suyu ile çalışma alanı temizleyin. </li><li> Plastik biyolojik tehlike torba içinde pipet uçları, tüpler, maske, ve eldivenler dahil tüm tek öğeleri toplamak. Yerel yasalar ve kurumsal politikalar (yani otoklav veya yakmayın) gerektirdiği atık malzemelerin imha ediniz. </li></ol> 8. Görüntüleme Fare Brain hazırlayın <ol><li> 3- bir karbon dioksit ötenazi odasına enjekte fare yerleştirin4 hafta sonrası enjeksiyon. Uygun ötanazi uygulamaları için kurumsal kurallarına uyun. Bu floresan etiketi gidermek olacak gibi paraformaldehitle hayvanları serpmek etmeyin. </li><li> Kafatası bütün beyinleri çıkarın ve 4 ° C de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde 3-12 saat boyunca düzeltin. </li><li> Donmaya karşı koruma sağlamak için,% 30 sakaroza sabit beyin aktarın. Beyin dibine batar kadar 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Ince ufalanmış kuru buz bir kova toplayın. Orta hatta aşağı yarısında beyin kesin. Dondurmak için kuru buz içinde beyin yarıyı sakla. </li><li> Kuru buz ve% 100 etanol eklenerek mikrotom sahne soğutun. </li><li> PBS kullanarak aşağı orta çizgisi ile sahneye beyin Güvenli ve donmasına izin. </li><li> Bir donma-kayar mikrotomu kullanılarak 30-45 mikron kalınlığında beyin aracılığıyla Bölüm. </li><li> Antifriz solüsyonu (250 mi, gliserol, 300 ml etilen glikol, 500 ml 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4) içeren 24 oyuklu plakalar içinde yer bölümleri. Kapak plakaları wigelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de inci kalay folyo ve saklayın. </li><li> 1-4 kuyulardan bölümleri toplayın ve PBS içinde 3x yıkayın. </li><li> Mikroskop slaytlar ve kapak üzerine Dağı bölümleri. Slaytlar karanlık bir konuma kurumasını bekleyin. </li><li> Yerli YFP veya tdTomato uygun filtreleri kullanarak görüntü slaytlar virüs transdüksiyon desen kontrol etmek. </li></ol>

<ol>
	<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).</li><li>Sun, B., Gan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+expression+in+the+central+nervous+system+with+lentiviral+vectors.">Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors.</a> Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).</li><li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector.">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J Virol. 75, 12382-12392 (2001).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+(AAV1)+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice.">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77, 7034-7040 (2003).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).</li><li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain.">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+formulations+that+enhance+physical+stability+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy.</a> Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).</li><li>Bauer, H. C., Bauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+of+the+blood-brain+barrier:+still+an+enigma.">Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma.</a> Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).</li><li>Cearley, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+repertoire+of+AAV+vector+serotypes+mediate+unique+patterns+of+transduction+in+mouse+brain.">Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses.">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yenidoğan fare beyin yaygın dağıtımı için bir araç olarak kullanılarak AAV nöronal gen ekspresyonunu kontrol etmek için bir çok yönlü bir prosedür tarif edilmiştir. Böyle utero elektroporasyon 1 veya sterotaksik intrakranial enjeksiyon 2,3 olarak nöronal transgenesis diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, yenidoğan viral enjeksiyon nispeten kolay ve basittir. Temel prosedür, sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga ile birkaç dakika içinde yapılabilir. O...

Nöral gen ifadesini değiştirerek geleneksel yöntemler zaman alıcı ve pahalı germlıne manipülasyonlar gerektirir. De novo Alternatif hızlı sonuçlar ve daha az maliyetlidir fakat karmaşık cerrahi müdahale 1-3 gerektiren bir dezavantajına sahip utero elektroporasyon veya steryotaksik Lentiviral enjeksiyon gibi yaklaşımlar. Ayrıca, transgen ifade bu yöntemler ile sınırlı mekansal yelpazesine sahiptir. Burada, neonatal fare beyin adeno-ilişkili virüs (AAV) intraventriküler enjeksiyon ile yaygın nöronal manipülasyon için bir hızlı, kolay ve ekonomik bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem ilk olarak, AAV, bu olgunlaşmamış ependim bariyerden ile beyin parankiması 4, lateral ventriküllere geçtiği gibi beyin omurilik sıvısı içinde dağılmasına izin onlar küçük bir parçacık boyutuna önerilen 2001, John Wolfe Marco Passini tarafından tanımlanmıştır 5. F içindeki AAV&#39;nin intraventriküler enjeksiyonuirst doğum verimleri bulbuslarında gelen beyin sapı 6,7 için, beynin her bölgesini kapsayan nöral altkümelerin yaygın viral transdüksiyon sonra 24 saat. Viral-teslim transgenler ifade ve enjeksiyon gün içinde aktif ve transdüksiyon sonra bir yıl kadar daha devam edilir. Dolayısıyla, bu çok yönlü manipülasyon erken doğum sonrası beyin gelişiminde gelen yetişkin yaşlanma ve dejenerasyon kadar çalışmaları sağlar. Bu nöronlar 6 transducing de en verimli olduğu için bizim özel deneysel ihtiyaçlarına tekniği adapte olarak, öncelikle AAV8 serotipinden odaklanmıştır. Viral titre genetik manipülasyon deneyler test hücre iç sonuçlardan transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için seyreltilmiş edilebileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, iki virüs için seçilen serotipler bağlı olarak, bu durum nöron ayrı veya üst üste gelen kümeler doğru bastırılmaktadır salgılanma modellerini üretmek için birlikte enjekte edilebilir olduğunu göstermektedirViral ambalaj. Çalışmalarımız deneysel nörobilim ayarları geniş bir yelpazede kullanım için bu tekniğin çok yönlülük genişler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="564">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">ICR outbred mice</td>
			<td style="width:89px;">Harlan</td>
			<td style="width:119px;">Hsd:ICR (CD-1)</td>
			<td style="width:167px;">This strain is also known as CD-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">FVB inbred mice</td>
			<td style="width:89px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">1800</td>
			<td style="width:167px;">5-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Nestlets</td>
			<td style="width:89px;">Lab Supply</td>
			<td style="width:119px;">NESTLETS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Shepherd shacks</td>
			<td style="width:89px;">Lab Supply</td>
			<td style="width:119px;">SS-mouse</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">High fat rodent chow</td>
			<td style="width:89px;">Purina Mills</td>
			<td style="width:119px;">PicoLab Mouse diet 20, #5058</td>
			<td style="width:167px;">This is our standard breeder chow</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:189px;">High fat rodent chow (alternative)</td>
			<td style="width:89px;">Harlan Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S</td>
			<td style="width:167px;">If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Injection syringe</td>
			<td style="width:89px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7653-01</td>
			<td style="width:167px;">10 ml syringe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Injection needles</td>
			<td style="width:89px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7803-04, RN 6PK PT4</td>
			<td style="width:167px;">32 gauge, for standard P0 injections</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:189px;">Metal plate for cryoanesthesia</td>
			<td style="width:89px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">8975K439</td>
			<td style="width:167px;">Raw aluminum plate, 6&#8221; x 12&#8221;, 0.25&#8221; thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Small animal stereotaxic device with digital readout</td>
			<td style="width:89px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 940</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Universal syringe holder with needle support foot</td>
			<td style="width:89px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 1772-F1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Neonatal frame</td>
			<td style="width:89px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51625</td>
			<td style="width:167px;">Officially called a mouse and neonatal rat adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:189px;">Biohazard disposal bags with sterile indicator</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14220-030</td>
			<td style="width:167px;">Important! &#8211; Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute&#8217;s protocol for biohazard waste disposal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction

Bilimsel gelişmeler hızlanarak ile, yeni yöntemler hızlı ve kolay fare beyninin gen ifadesini işlemek için deneysel nörobilim için gereklidir. Burada ilk yenidoğan fare beyninin içine viral olarak kodlanmış Transgenlerin doğrudan intrakranial teslimat için Passini ve Wolfe tarafından tanıtılan bir tekniği açıklar. En temel formunda, prosedür sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga gerektirir. Bununla birlikte, aynı zamanda, iletişim kuralı tekniğe yeni araştırmacı tutarlılığını arttırmak için sterotaksik çerçeveler ile birlikte kullanılmak üzere adapte edilebilir. Bir yöntem olup, astarlama ependim hala doğumdan sonraki ilk 12-24 saat içinde ise olgunlaşmamış beyin parankimasma içine serebral ventriküller serbestçe hareket adeno-ilişkili virüs (AAV) de yeteneklerine bağlıdır. Beyin boyunca nöronların yaygın iletiminde bu yaş sonuçlara AAV&#39;nin intraventriküler enjeksiyonu. İfade enjeksiyon gün içinde başlar ve lifetim için devamhayvan örn. Viral titresi floresan proteini ko-ekspresyonu kalıt aktarımlı hücrelerin önemli bir etiket sağlar iken, transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için ayarlanabilir. Hem off-the-raf, ambalajlı reaktifler ve özel viral hazırlanmasını sağlamak viral çekirdek tesislerin yükselen durumu ile, bu yaklaşım, hızlı, kolay ve çok daha az pahalı fare beyninin gen ifadesini değiştirmek için bir zamanında bir yöntem sunuyor Geleneksel germlıne mühendislik daha.

Başarılı ventrikül içi enjeksiyon, viral verimleri ve yaygın nöronal sağlam ifade. Burada YFP veya tavuk beta aktin promoteri (CBA promotör) kontrolü altında tdTomato floresan genler kullanılarak viral transdüksiyon değerlendirildi. Bu yapılar AAV8 içine paketlenmiş ve neonatal (P0) ICR fındık fareleri lateral ventriküllere enjekte edildi. Yüksek virüs titerleri (hemisfer başına 10 10 parçacıklar) (sol, Şekil 1A) yoğun bir koku ampul etiketleme, striatum, serebral ...

Watch this Scientific Journal Video about Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction at JoVE.com

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

intracerebroventricular-viral-injection-neonatal-mouse-brain-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

57.8K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Video: Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Nörobilim

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Yenidoğan hipoksik-iskemik beyin hasarı, fare modeli neurobehavioral değerlendirmesi

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric spinal cord injuries (SCIs) compared to adult SCIs. In addition, reliably introducing therapies into the target cells of the central nervous system (CNS) can be challenging, and inaccuracies can compromise the efficacy of the study or therapy. This protocol combines viral vector technology with a novel surgical technique&#160;to accurately introduce gene therapies into neonatal rats at postnatal day 5. Here, a virus engineered for retrograde transport (retroAAV2) of Cre is introduced at the axon terminals of corticospinal neurons in the spinal cord, where it is subsequently transported to the cell bodies. A double-floxed&#160;inverted orientation (DIO) designer receptor exclusively activated by designer drug(s) (DREADD) virus is then injected into the somatomotor cortex of the brain. This double-infection technique promotes the expression of the DREADDs only in the co-infected corticospinal tract (CST) neurons.&#160;Thus, the simultaneous co-injection of the somatomotor cortex and cervical CST terminals is a valid method for studying the chemogenetic modulation of recovery following cervical SCI models in neonatal rats.

This protocol demonstrates a novel method for applying gene therapies to subpopulations of cells in neonatal rats at postnatal ages 5-10 days by injecting an anterograde chemogenetic modifier into the somatomotor cortex and a retrogradely transportable Cre recombinase into the cervical spinal cord.

Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and large-scale genomic and drug screening. Due to the self-organizing nature of cells in brain organoids and the growing range of available protocols for their generation, issues with heterogeneity and variability between organoids have been identified. In this protocol paper, we describe a robust and replicable protocol that largely overcomes these issues and generates cortical organoids from neuroectodermal progenitors within 1 month, and that can be maintained for more than 1 year. This highly reproducible protocol can be easily carried out in a standard tissue culture room and results in organoids with a rich diversity of cell types typically found in the developing human cortex. Despite their early developmental make-up, neurons and other human brain cell types will start to exhibit the typical signs of senescence in neuronal cells after prolonged in vitro culture, making them a valuable and useful platform for studying aging-related neuronal processes. This protocol also outlines a method for detecting such senescent cells in cortical brain organoids using senescence-associated beta-galactosidase staining.

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

In this study, we provide a detailed technique for a simple yet robust cortical organoid culture system using standard feeder-free hPSC cultures. This is a rapid, efficient, and reproducible protocol for generating organoids that model aspects of brain senescence in vitro.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...