Fare beynindeki yaklaşık 100 milyon hücre ve terabayt ölçeğine yaklaşan tüm beyin hücresel çözünürlüklü görüntülerin boyutlarıyla, hücreleri doğru bir şekilde ölçmek için gelişmiş görüntü analiz araçlarına ihtiyaç vardır. Hesaplamalı işlem hattımız, hücre algılama doğruluğu, görüntüleme süresi ve hesaplama kaynakları arasında makul bir uzlaşmayı korurken görüntüleri önceden işleyebilir ve fare korteksi içindeki çekirdekleri ölçebilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri Felix Kyere ve Ian Curtin olacak.
Başlamak için, numuneyi doğru numune büyüklüğü tutucusuna monte edin, böylece numune, UltraMicroscope II mikroskobunun nominal çalışma mesafesi nedeniyle en fazla 5,2 milimetre derinlikte z-boyutu ile yönlendirilecektir. Ardından, tutucuyu, tutucunun vidası kızağın desteklerine 45 derecelik açıyla olacak şekilde numune yuvasına yerleştirin. Ardından, beşiği numune ışık yoluna dik olarak yönlendirilecek şekilde bir konuma getirin.
Daha sonra, mikroskoptaki yakınlaştırma gövdesini 4x büyütme veya daha yüksek bir değere ayarlayarak piksel başına 0,75 mikrometre üretin. Inspector Pro yazılımında, sayısal diyafram açıklığı değeri yaklaşık 0,08 olan tek bir ışık sayfası seçin. Eksenel çözünürlüğün görüntünün genişliği boyunca korunmasını sağlamak için Yatay Dinamik Odaklama'yı seçin ve lazer dalga boyuna bağlı olarak önerilen adım sayısını uygulayın.
Ardından, kayıt kanalına göre her kanal için ince odağı ve kanal özelliklerine göre kanal başına lazer gücünü ayarlayın. Ardından, levha gücünün numune boyutu için y boyutunda en uygun şekilde dağıtıldığından emin olmak için ışık tabakası genişliğini yaklaşık% 50'ye ayarlayın. Daha sonra, kutucuk sayısını numunenin boyutuna göre karolar arasında önerilen %15'lik bir örtüşme ile ayarlayın ve belirli bir döşeme konumundaki her yığın için sırayla her kanal için görüntüler yakalayın.
İlk olarak, Linux ve NuMorph görüntü işleme araçları için Conda ortam yöneticisini indirin ve yükleyin. Komut satırında matlab ve NM_setup çalıştırın. Analiz için gerekli görüntü analizi yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NuMorph'tan m.
Ardından, NM_samples dosyayı düzenleyerek örnek adlarını, giriş ve çıkış dizinlerini, kanal bilgilerini ve ışık sayfası görüntüleme parametrelerini belirtin. Yoğunluk ayarı için, NMp_template bölümünde, yeni bir görüntü kümesiyle çalışırken yoğun ayarı true ve use_processed_images false olarak ayarlayın. Ardından, save_images ve save_samples true olarak ayarlayın.
Ardından, temel algoritmayı kullanarak gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için karo gölgelendirmesini temel olarak ayarlayın veya UltraMicroscope II'den belirli ışık tabakası genişliklerinde ölçümleri kullanarak karo gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için manuel olarak ayarlayın. Görüntü kanalı hizalaması için NMp_template true olarak ayarlayın ve kanal channel_alignment çeviri veya elastik olarak alignment_method. Ardından, görüntüleme sırasında kutucuk çakışmalarını eşleştirmek için sift_refinement true ve örtüşme değerini 0,15 olarak ayarlayın.
MATLAB'de ön işleme adımlarını çalıştırmak için örnek adını belirtin ve yapılandırmayı NM_config işlem örneği olarak ayarlayın. Ardından, yoğunluk, hizalama veya dikiş kullanarak sahne alanını belirtirken NM_process yapılandırma dikişi belirterek ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırın ve aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini denetleyin. Bir 3B Atlas görüntüsü ve her vokseli belirli bir yapıya atayan ilişkili bir ek açıklama görüntüsüyle başlayın.
Atlas görüntüsünün ve ek açıklama dosyasının doğru yönde doğru şekilde eşleştiğinden emin olmak için hem Atlas görüntüsünü hem de ek açıklama dosyasını hizalayın. Hizalamadan sonra, komutu yürüterek girişleri makalede açıklandığı gibi belirtmek için NuMorph'taki dosyaları işleyin. NMa_template'de, resample_images true ve resample_resolution Atlas'la eşleşecek şekilde ayarlayın.
Ardından, resample_channels kullanılarak yeniden örneklenecek kanal numarasını belirtin. Daha sonra, register_images true olarak ayarlayın, Atlas dizinindeki dosyayla eşleşmesi için atlas_file belirtin ve registration_parameters varsayılan olarak ayarlayın. Ardından save_registered_images true olarak ayarlayın.
Çekirdek algılama, hücre sayımı ve sınıflandırma için hem count_nuclei hem de classify_cells doğru olarak ayarlayın. Ardından, algılanan nesneler için minimum yoğunluk eşiği tanımlamak üzere count_method 3dunet ve min_intensity ayarlayın. Ardından, classify_method merkezcil konumlarda denetlenmeyen bir floresan yoğunluğuna dayanan eşiğe veya denetimli bir doğrusal destek vektör makinesi sınıflandırıcısını modelleyen SVM'ye ayarlayın.
MATLAB'da çözümleme adımlarını gerçekleştirmek için örnek adını belirtin ve yapılandırmayı NM_config çözümleme örneği olarak ayarlayın. Ardından, yeniden örnekleme, kaydetme, sayma veya sınıflandırma kullanarak aşamayı belirtirken NM_analyze yapılandırma aşaması belirterek analiz adımlarından herhangi birini çalıştırın ve aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini denetleyin. NMe_template'de, güncellemeyi true olarak ayarlayın ve dizinlerden birine compare_structures_by ayarlayın.
Ardından, hücre sayımını ve hücre türü sınıflandırmasını belirtirken değerlendirilecek tüm olası yapı dizinlerini ve yapılarını belirten şablon dosyasını ve yapı tablosunu ayarlayın. iDISCO + protokolü ve nöronal tabakaya özgü çekirdek belirteçleri kullanılarak doku temizleme, izokortekste üst ve alt tabaka nöronlarının açıkça tanımlanmış hücre gruplarıyla sonuçlandı. NuMorph kullanarak hücre sayımı, yoğunluk ayarı, kanal hizalaması ve dikiş içeren başarılı ön işleme adımlarına bağlıydı.
Bununla birlikte, ön işleme adımlarındaki hatalar yanlış dikişlere neden olabilir, bu da yanlış hizalama ve dikişlere yol açabilir ve bu nedenle odak içi ve odak dışı desene sahip görüntülerle sonuçlanabilir. Belirli beyin bölgelerindeki çekirdekleri saymak için, dikişli görüntülere Atlas kullanılarak açıklama eklenecek ve ek açıklamaların beyin bölgelerine bindirilmesine izin verilecektir. Çekirdeklerin sentroidleri, NuMorph'ta eğitimli bir 3D U-Net modeli ile tespit edildi ve yaklaşık 2.6 milyon beyin-iki-pozitif ve 1.6 milyon CTIP2-pozitif çekirdek ile izokortekste TO-PRO-3-pozitif olan yaklaşık 12 milyon toplam çekirdek vardı.
Bazal gangliyon ve hipokampal allokortekste sırasıyla yaklaşık 3.7 ve 2.9 milyon TO-PRO-3-pozitif toplam çekirdek tespit edildi. Bununla birlikte, bu iki beyin bölgesinde tespit edilen beyin-iki-pozitif hücreler ihmal edilebilir düzeydeydi ve bazal gangliyonlar ve hipokampal allokortekste her biri bir milyondan az CTIP2-pozitif hücrede sadece 1.5 civarında tespit edildi. İyi bir segmentasyon elde etmek için edinme sırasında görsel kalite kontrolleri yapın.
Ayrıca, aşağı akış analizinde hiçbir hatayla karşılaşılmamasını sağlamak için Conda ortamını doğru şekilde ayarlayın. Hücre sayımına ek olarak, bu işlem hattı, hücre boyutunu ve şeklini ölçen ve daha sonra genotip grupları arasında karşılaştırılabilen diğer segmentasyon araçlarıyla entegrasyona izin verir. Boru hattımızla, beyin anatomisinin hücresel çözünürlükte nasıl değiştiğini tanımlayabiliriz, bu da hastalık riski için önemli olan hücre tiplerinin ve beyin bölgelerinin tanımlanmasına yol açar.
