We thank the Ligue contre le Cancer de C&#244;te d&#8217;Or and the Centre Georges-Fran&#231;ois Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

<ol>
	<li>Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+responsible+for+familial+breast+cancer.">Genes responsible for familial breast cancer.</a> Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).</li><li>Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+breast+cancer+risk+and+BRCA1/2+carrier+probability.">Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability.</a> Breast Dis. 27, 5-20 (2007).</li><li>Cox, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+variants+of+the+BRCA1+wild-type+allele+modify+the+risk+of+breast+cancer+in+BRCA1+mutation+carriers.">Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).</li><li>Maia, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BRCA2+cis-regulation+in+normal+breast+and+cancer+risk+amongst+BRCA2+mutation+carriers.">Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers.</a> Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).</li><li>Anczuk&#243;w, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2+deep+intronic+mutation+causing+activation+of+a+cryptic+exon:+opening+toward+a+new+preventive+therapeutic+strategy.">BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy.</a> Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).</li><li>Brewster, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fifteen+novel+germline+variants+in+the+BRCA1+3'UTR+reveals+a+variant+in+a+breast+cancer+case+that+introduces+a+functional+miR-103+target+site.">Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site.</a> Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).</li><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+and+BRCA2:+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection.">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).</li><li>Ma, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evidence+for+the+contribution+of+the+genetic+variations+of+BRCA1-interacting+protein+1+(BRIP1)+to+the+genetic+susceptibility+of+cervical+cancer.">First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer.</a> Gene. 524 (2), 208-213 (2013).</li><li>Haanp&#228;&#228;, M., Pylk&#228;s, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+need+for+routine+clinical+testing+of+PALB2+c.1592delT+mutation+in+BRCA+negative+Northern+Finnish+breast+cancer+families.">Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families.</a> BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).</li><li>Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PALB2+and+breast+cancer:+ready+for+clinical+translation.">PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation.</a> Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).</li><li>Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+and+implementation+issues+in+using+next-generation+sequencing+of+cancers+in+clinical+practice.">Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice.</a> Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).</li><li>Hernan, I., Borr&#224;s, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Ma&#241;&#233;, B., Llort, G., Ag&#250;ndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing.">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li><li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing.">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240 (2011).</li><li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borr&#224;s, E., Ma&#241;&#233;, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing.">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers.">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li><li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers.">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li><li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances:+a+kin-cohort+study+in+Ontario,+Canada.">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li><li>Slater, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PALB2+mutations+in+European+familial+pancreatic+cancer+families.">PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families.</a> Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).</li><li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA+and+pancreatic+cancer.">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to declare.

NGS cihazların ve teknolojilerin yaygın kullanımı kanser ve genetik bozuklukların çalışmada yeni fırsatlar sunmuştur. Tüm genom sekanslaması ya da RNA sıralamasına ek olarak, çok sayıda hasta için seçilen gDNA dizilerinin büyük bir miktarda analizi aynı anda tan büyük potansiyel sunmaktadır. Burada, bir orta verim sıralama cihazı (Malzeme / Ekipman Tablo) ile eş zamanlı olarak 24 hastada 11 tam genlerin çalışma NextEra teknolojisini kullanarak (talep üzerine mevcuttur) belirli bir tasarım geliştirdi. Bu protokol hata riski düşük olan hastaların kaygılarına hızlı bir yanıt sağlayan veri hızlı üretimi sağlar. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, Sanger dizileme ile tespit edilen tüm genetik varyasyonları da transposaz tabanlı hazırlama kiti kullanılarak tespit edildi. Bu yöntem özellikle direkt olarak analiz karmaşık indel değişiklikler için, güvenilir ve yorumlamak kolaydır. Yine de, bu önemlieksi iplikçik bulunan genler için, nucleotidlerin (ters olmadan) tamamlamak için gerekli olduğunu unutmayın. Bu çalışma, 11 tam genlerin analizi için bir tasarım ile gerçekleştirilmektedir, ancak protokol tasarım tercih ne olursa olsun aynıdır edildi. Transposaz bazlı teknoloji, aynı zamanda, uzun menzilli PCR ürünlerinin 12 kütüphane hazırlanması için kullanılabilir. Nitekim, (üretici tarafından geliştirilen) algoritma tasarımı için kullanılan özel olarak bu protokol için adamıştır (üretici et aracı, Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler). Ayrıca teknoloji transposase tabanlı, ayrıca mevcut kütüphane hazırlanmasından önce DNA parçalanmasının diğer iki mekanizma: mekanik parçalanma ve enzimatik parçalanma. Mekanik DNA fragmantasyonu yeniden üretilebilir ancak ultrasonikatör ihtiyacı ve kütüphane hazırlanması daha pahalı ve zaman alıcıdır. Enzimatik DNA fragmantasyonu, genellikle elde edilen, bağlı bir kısıtlama enzim yerle DNA yakalama sorunları indüklerHedef dizi kapsama eksikliği. Bununla birlikte, DNA parçalanması için her strateji avantajları ve dezavantajları vardır ama en azından uzun menzilli PCR ürünü parçalanma 13, oldukça benzer sonuçlar verecek gibi görünüyor. Yeni bir enzim kokteyli kullanımı, mekanik, DNA parçalanması 14 ile elde edilen ile aynı sonuçları temin gibiydi. Transposase tabanlı teknoloji, yüksek kalitede DNA (FFPE dokulardan çıkarılan DNA için geçerli değil) ihtiyacı var. Ayrıca, transpozazın aktivitesi ilgi fragmanları bu uzunluğundan daha uzun olması gerektiğini göstermektedir, 300&#39;den bp parçalarını gerektirir. Bu özgüllük yüksek kaliteli, un parçalanmış DNA için ihtiyaç açıklar. Şimdiye kadar, BRCA1 ve BRCA2 genetik varyasyonlar, ailesel meme ve yumurtalık kanserlerinde çalışılmıştır. Ancak, BRCA genleri ve özellikle BRCA2 tutulumu, şimdi özellikle pankreas 15, prostat içinde, diğer kanserlerde şüphesi16 ve testis kanserleri 17. PALB2, BRCA gen bir ortağı, bir genetik değişim pankreas kanseri 18 ile bağlantılıdır. Ayrıca, son zamanlarda hasta BRCA mutasyonları barındıran, ve bir dereceye PALB2 mutasyonlara, PARP inhibitörleri 19 kendi pankreas kanseri daha iyi bir yanıt göstermiştir ortaya çıktı. BRCA1, BRCA2 ve PALB2 kanseri ailesel riski ile ilişkili, ve muhtemelen özel tedaviler yatkınlıkla ilişkili gibi, ailesel kanser riski ve kanser tedaviye yanıt taramasında taramasında BRCA1 ve BRCA2 ortakları keşfetmek için önemli görünmektedir. Bu verilerden, bir DNA kırık onarımı ile ilgili genlerin analizi duyarlılık elenmesi için değil, aynı zamanda tedaviye yanıt farazi bir gösterge için sadece önemli olduğu görülmektedir. Ayrıca bu protokol ile önerilen tam gen analizi yapıl olabilirBu yükselticisinde mutasyonu, birleştirme bölgelerinin ya da intronlar bulunan düzenleyici birleştirme bölgelerinin olarak doğuştan mevcut olan (ve kanser hücrelerinde bulunan) olabilir er tüm iyileştirmeleri,. Bugüne kadar, genlerin kodlamayan sekanslar değişiklikler derinlemesine çalışılmamıştır, ancak genom dernek çalışmaları gelişme bu dizilerin önemli işlevleri vurgulamak olabilir. Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen transposaz-tabanlı tasarım DNA hasarı tamir katılan kansere yatkınlık genleri genetik anormallikler keşfetmek için ilginç bir yoldur. 24 hasta için 11 tam genleri sıralamak için olasılık aynı anda tarama için oldukça zor bir tekniktir Sanger dizileme yöntemi ile karşılaştırıldığında önemli bir avantajdır.

2010 yılında, (esas kadın) yaklaşık 1.5 milyon kişi meme kanseri gelişmiş. Bu vakaların% 5-10 kalıtsal olduğu tahmin edilmektedir. Kalıtsal meme ve yumurtalık kanserlerinde 1 katılan neredeyse 20 yıl önce, BRCA1 ve BRCA2 tespit edilmiştir. 15 yıl öncesine kadar, BRCA1 ve BRCA2 kodlama bölgeleri, meme ve yumurtalık kanseri genetik yatkınlık belirlemek için dizilenmiştir. BRCA1 ve BRCA2 değişiklikler, bu bölgelerin yapılan analiz, etkin taraması için yeterli olmadığını göstermektedir seçilen ailesine 2&#39;nin 10-20% olarak tespit edilir. Son zamanlarda, BRCA1 ve BRCA2 olmayan kodlama dizileri (promotör, intronlu 3-&#39;UTR) analizi yeni mutasyonlar / çeşitleri meme kanseri 3-6 daha yüksek bir risk ile bağlantılı olabileceğini vurguladı. BRCA1 ve BRCA2 proteinleri (homolog rekombinasyon tamir katılmaktadırlarSayısız partnerle 7 tamamlanır HHR). BRCA1 veya BRCA2 değişiklikler DNA onarımı kusurları neden olurken, diğer ortaklar da meme kanseri riskini etkileyebilir. Bu hipotez BRIP1 beri 8 valide edilmiş görünüyor ve PALB2 9 sırasıyla, serviks ve meme kanseri üzerinde kanıtlanmış bir etkisi var. Buna ek olarak, diğer iki &quot;orta riskli&quot; meme kanseri yatkınlık genleri, ATM ve CHEK2, ayrıca rutin 10 incelenebilir. Bu çalışmalardan elde ardından, biz aynı anda nispeten çok kolay ve kullanan 24 hastada 11 genleri (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 ve TP53) analiz etmek için bir protokol geliştirmeye karar verdi orta çıktı aygıtında zenginleştirme ve sıralama ile transposaz teknolojisine dayalı hızlı protokol,. TeşekkürlerBu teknik için, 2500 bp&#39;lik bir intronik bölgeleri dahil verildiği RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5) hariç olmak üzere, 3&#39;-UTR sonuna promotörün başlangıç ​​aşamasında tam genleri dizildi. Bu 2.734 problar ile çalışıldı yaklaşık 1.000.300 bp toplam temsil eder. Genellikle, BRCA1 ve BRCA2 egzonik dizileri az 20 hasta için 1.5 ay ihtiyaç Sanger dizileme ile analiz edilmektedir. Mevcut protokol (Şekil 1) ile, aynı zamanda, fazla 75 hasta için 11 tam genler analiz edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1001</td>
			<td>Sequencing/medium throughput device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera Enrichment kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-123-1208</td>
			<td>Transposase based technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 cycle cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15033624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Alpaqua</td>
			<td>A32782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDI 96-well plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>AB0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal A</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MSA-5001</td>
			<td>This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Provided with the sequencing device 
			Experiment Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new&#62; 
			Manufacturer website tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gdna enrichment by a transposase-based technology for ngs analysis of the whole sequence of brca1, brca2, and 9 genes involved in dna damage repair

Yeni Nesil dizileme yaygın kullanımı kanser araştırmaları ve tanı için yeni yollar açtı. NGS büyük kanser yeni miktarlarda veri ve özellikle kanser genetiğini getirecektir. Mevcut bilgi ve gelecekteki keşifler gerekli kansere genetik yatkınlık rol olabilir genlerin büyük bir dizi çalışma yapacak. Bu amaçla, DNA hasarı tamir katılan 11 komple genlerin çalışma NextEra bir tasarım geliştirildi. Bu protokol güvenle, aynı anda 24 hastada 11 genler (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 ve TP53) promoterinden 3&#39;-UTRsine incelemek için geliştirilmiştir. Transposaz teknoloji ve gDNA zenginleştirme dayanan bu protokol, çoklama, örnek genetik tanı sayesinde zaman açısından büyük bir avantaj sağlar. Bu protokol, güvenli bir şekilde, kan gDNA kullanılabilir.

Örnek QC Sonuçlar Hedef genlerin sekansları belirlemek için bu yöntemin özelliği gDNA (Şekil 2A) ve kalitesi tagmentation aşamasının kalitesine bağlıdır. Tagmentation (Şekil 2B, üst panel) yeterli değilse, sıralama tatmin edici olmayacaktır. Yukarıda zikredildiği gibi, tagmentation saflaştırmadan sonra, 300 bp civarında gDNA parçalarının çoğunluğu (Şekil 2B, alt panel) ile yaklaşık 1,000 bp&#39;ye kadar olan 150 bp parça halinde tagmented olmalıdır. Kütüphane oluşturma sonunda, kütüphane kalitesi BioAnalyser kullanılarak kontrol edilir. Elde edilen profil tagmentation sonrasında ancak parçalarının daha yüksek bir sayı (Şekil 2C) ile yaklaşık olarak aynı olmalıdır. Şekil 1C kütüphane kalitesi ile aynı değilse, sıralama yapılmamalıdır. Sıralama başlattı sonrasıralama cihazı, kümeleme skoru 9 devresinden sonra mevcuttur ve 800.000 ve 1.100.000 kümeler / mm ² (Şekil 3A) arasında olmalıdır. Bu sayı daha düşük ise, özellikle de sekanslama okuma derinliği, tatmin edici olmayacaktır. Eğer daha yüksek olursa, görüntü (Şekil 3B) bulanık olacaktır, ve hiçbir analiz nedeniyle kümeleri ayırt etmek imkansızlığı yapılacaktır. Çalışmasının sonunda, Kalite puanı kontrol etmek önemlidir. Yukarıda ayrıntılı protokolü takip ederek, koşmak kalite puanı Şekil 4&#39;e karşılık gelecek. Dizileme kalitesi Q-skoru (Q-30) tarafından temsil edilmektedir. Üstün ya da 30 eşit Q-puan olmalıdır, dizileri (kümeler) en az% 75 civarında deney doğrulamak için. Diziliş analizi sonuçlarından Bu deney anayasa genetik anormallikler incelemek için tasarlanmıştır. Bu durumda, genetik anormallikler prgenomuna% 50 ESENT. Bu nedenle, sıralama derinliği çok önemli değildir. Bu yazıda, hazırlanan ve 11 tam genleri için aynı anda 12 hastanın 2 kütüphaneleri sıralandı. Yüksek sekanslama derinliği elde etmek için, birden fazla mesaj göndermiş hasta sayısında azalma olması gerekir. GDNA zenginleştirme sondaları ile yakalama dayalı olarak, zenginleştirme homojen (Şekil 5) değildir. Bizim protokol ile yaklaşık 6 Gb 150 ortalama kapsama uyaran, okur 20 minimum ve 330 okur maksimum ile, her üs için okur oluşturdu. Bu okuma kalınlıkları klinik uygulamada 11 NGS kullanımı ile uyumludur. Muhtemelen yakalama tarafından gDNA zenginleştirme nedeniyle, genlerin değil, önemli yeniden düzenleme okuma derinliklerinde, çeşitliliğine rağmen, böylece sıralama doğrulayarak, Q-skoru 30 zaman (Şekil 5) üstün olduğunu not etmek önemlidir. Bununla birlikte, bu sonuç ile kıyaslanarak teknoloji doğrulamak için önemlidirSanger dizileme ile elde edilen elde s. Her iki Sanger sıralanması ile sıralanmıştır 17 hastada transposaz tabanlı teknoloji (BRCA1 ve BRCA2 dizileri kodlama), biz aynı 330 genetik varyasyonlar (SNP mutasyonlar) saptandı. Bir örnek olarak, BRCA1 geni içindeki bir nokta mutasyonu (sol Şekil 6) ve BRCA2 geninde 4 bazların (hakkı Şekil 6) bir silinme Sanger transposaz dayalı yöntemlerin her ikisi tarafından tespit edildi. BRCA1 kromozom 13 ters şeridi üzerinde olduğu gibi, bunun (sırasıyla düz dizi üzerinde) BRCA2 için, elde edilen dizi takviye edilmesi gerekmez, oysa dizisi elde güzelleştirmek (ancak ters olan) için gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir . Şekil 5&#39;te belirtildiği üzere, Sanger yöntemi yok ise, NGS teknolojisi, bir genetik varyasyon tahmini frekansı verir. Ayrıca, özellikle indel varyasyonları için, yorumlanması NG ile daha kolayS teknolojisi. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, doğru indel varyasyon ileri dizileri ihtiyaçları ve eklenen veya silinen sekansı deşifre etmek için sıralama ters karıştırılmış bir Elektroforegramda olarak görünür. NGS analizleri ile, eklenen veya silinen sekansı, doğrudan böylece yanlış yorumlama riskini azaltır belirlenir. Son olarak, transposaz tabanlı teknoloji hedef genlerin daha fazla sayıda analiz için bize izin ve biz Sanger dizileme yer almayan birçok yeni genetik varyasyon dizileri bulundu. Bu sonuçlar başka yayınlanacaktır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. prosedürünün şematik iş akışı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51902/51902fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2. kalite kontrolleri öncesi ve kütüphane hazırlandıktan sonra. Güvenle tagmentation için kullanılabilir gDNA A. spektrofotometrik profili. DNA verimi daha yüksek 5 ng / ml, 260/280 ve 260/230 oranı sırasıyla, 1.8 ve 2 üstün olmalıdır olmalıdır. Tagmented gDNA&#39;sından B. Fragment analizörü profilleri. Üst panelde, yetersiz gDNA tagmented temsil etmektedir. Alt paneli mükemmel tagmented örnek gösterir. Hazırlanan kütüphanede C. Fragment analizörü profilini sadece sıralama başlatılması önce. Fragman boyutu tagmented gDNA&#39;sından (B, alt panel) gibi ancak yükseltilmiş bir miktar ile aynıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51902/51902fig2large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &gt; <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3. Denetimi küme nesil. Çalışması sırasında sıralama cihazın A. Ekran Görüntüsü. K / mm ². B. Farklı görüntüleri düşük yoğunluklu (üst panel), yüksek yoğunluklu (alt panel) ve mükemmel yoğunluğu (orta panel). Karşılık 800 ila 1,000 küme yoğunluğu olmalıdır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51902/51902fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4. Q-skoru denetleniyor. Seferin sonunda, valide sıralama 30 üstün bir Q-puanı ile oluşturulan kümelerin en az% 75 olmalıdır.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5. Temsil kapsamı veriler ve bunlara karşılık gelen Q-skoru. Okuma derinliği tüm kaplı gen boyunca heterojen. Bununla birlikte, kapalı bölgelerin Q-skor Q-30 her zaman üstündür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51902/51902fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51902/51902fig6highres.jpg" width="600" /> Sanger dizileme ile transposaz tabanlı teknoloji ile elde edilen Şekil 6. Temsilcisi sonuçları. Sanger dizileme ile gözlenen tüm genetik varyasyonlar d edilditransposaz tabanlı teknoloji ile etected. Nokta mutasyonları yorumlamak kolay iken, indel değişiklikler bazen Sanger yöntemi ile çalışmak oldukça zordur. Orta çıktı aygıtı ile ilişkili transposaz tabanlı teknoloji ile, indel değişiklikler keşfetmek için basit. Bununla birlikte, hedef gen eksi iplikçik (burada BRCA1 geni) üzerinde bulunan zaman serileri elde tamamlayacak (ama ters değil) gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51902/51902fig6large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair at JoVE.co

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme<em&gt; BRCA1</em&gt;<em&gt; BRCA2</emDNA Hasarı Onarım ilgilendim&gt; ve 9 Genler

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

12.1K Görüntüleme.  Centre Georges-François Leclerc. gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair. 

Video: gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Mikroprotein Tanımlama ve Dizi Analizi için Entegre Bir Yaklaşım

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...