Biz burs ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Tıp-UNAM DGAPA IN201510 ve DGAPA IN216213 tarafından sağlanan mali destek kabul; Biyolojik malzeme ile yardım için Instituto Nacional de Perinatología Salvador Correa; Nukbone bağış ve Biocriss, SA de C. V. Ayrıca Ing teşekkür ederiz. IIM&#39;de, UNAM Héctor Martínez ve teknik yardım için CINVESTAV M tr C Fabiola Gonzalez.

Bu araştırma araştırma içeren insanların etik davranış konusunda Helsinki Dünya Tıp Birliği&#39;nin Deklarasyonu çerçevesinde yapıldı ve Facultad de Medicina, UNAM (proje numarası 101-2012) Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. İnsan Mezenkimal Kök Hücre 1. izolasyonu <ol><li> Reaktifin hazırlanması <ol><li> % 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) ve ek hazırlayın. </li><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı, yüksek glikoz (HG-DMEM) hazırlayın ve bir 0.2 mikron filtre içinden süzme ile,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik solution.Sterilize Bu kültür ortamı ilave edin. </li><li> FBS ya da antibiyotik-antimikotik çözelti olmadan HG-DMEM 100 U / ml bir kolajenaz II çözeltisi hazırlayın. </li><li> , Izolasyon için gerekli otoklav ile aşağıdaki cerrahi aletler, sterilize: Standart makass, basit kesme forseps, ince noktası ve dişli forseps ve neşter sapı (# 4). </li></ol></li><li> İnsan amniyon zarının mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu <ol><li> Tek elle göbek bağını tutun ve diğer elinizle, yaklaşık 5 cm 2 bir parçasını elde etmek için, bir saydam tabaka gibi görünüyor amniyotik membran (AM), ayırmak. Koryon kısmı numune içerisinde mevcut olması halinde koryon bölümü amniyon daha kalın olduğu için, el ile diseksiyon ile temel koryon ayırın. </li><li> PBS 5 ml üç yıkar ile artık kan çıkarın ve basit forseps ile pıhtıları çıkarın. Yaklaşık 0.5 cm 2 parçalarını üretmek için neşter ile AM küçük bir kesim olun. </li></ol></li><li> Amniyon zarının enzimatik sindirimi <ol><li> % 0.125 tripsin, 5 ml /% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 50 ml konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de 0.5 mM EDTA çözeltisi ile AM inkübe edin. 250 santrifüjxg ve 5 dakika için 25 ° C sıcaklığa getirilmiş ve süpernatan atarak tripsin uzaklaştırın. </li><li> Ara sıra Leyva ve ark göre çalkalanarak bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca kollajenaz tip 15 ml II solüsyonu eklenir ve inkübe edilir. 9 </li><li> Hemen kolajenaz II ile sindirmeden sonra 250 x g hızında 15 ml PBS ve santrifüj ilave edin ve 10 dakika boyunca 25 ° C. </li><li> Süpernatant atılır ve 250 x g hızında PBS çözeltisi ve santrifüj 15 ml ve 15 dakika için 25 ° C hücre pelet yıkayın. Süpernatantı atın. </li><li> Hafifçe sallayarak HG-DMEM 10 ml hücresel pelletini. </li></ol></li><li> Mezenkimal kök hücrelerin genişlemesi <ol><li> Tohum 2 kültür şişesi içinde hücre süspansiyonu (1 x 10 4 hücre / cm2) ml ve bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de hücreler HG-DMEM 2 ml ilave edilir ve inkübe edilir. 5-7 sonra kültür ortamı değiştirerek yapışmayan hücre ortadangün. </li><li> Bu süre sonunda,% 90 oranında hücresel izdiham elde etmek için ek 7-10 gün için kültür ortamı her 3 günde bir değiştirin. </li><li> Hücreleri yeniden elde etmek ve% 0.125 tripsin / EDTA solüsyonu (tripsinizasyon) bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe. </li><li> Hemen tripsinizasyondan sonra 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj bir pipet ve transferi hücreleri toplamak. </li><li> Süpernatantı atın ve HG-DMEM 10 ml hücresel pelletini. </li><li> Kültür hücre iki kez 75 cm2 kültür şişelerinde süspansiyonu (her bir şişeye 5 ml) ve% 90 birbirine karışana kadar kültürünü. </li><li> Tekrarlayın 1.4.3 adımları. 1.4.6 için, 9. geçit veya alt kültür kadar. </li><li> Flow sitometri veya diğer çalışmalar için 1.4.5 adımlar 1.4.3 gibi tripsinizasyon hücreleri kurtarın. </li></ol></li></ol> Gözenekli Kemik Matriks Disk 2. Hazırlık (NKB) <ol><li> NKB diskleri ıslak(Çap 12 mm, kalınlığı 2 mm)., Her disk inkübe gece boyunca ile Fassina ark.&#39;nın patentine uygun olarak 3 ila 37 ° C &#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde FBS&#39;siz HG-DMEM mi, 5 </li><li> Islatma işleminden sonra, fazla kültür ortamı ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de 50 ml konik bir tüp ve bir dönüş diski yerleştirin. 24 gözlü bir hücre kültürü plakasının diski yerleştirin. <ol><li> HG-DMEM 500 ul ilave edin ve 25 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edin. Hiçbir kabarcıklar besin ve hücrelerin doğru dağılımını lehine NKB diskte mevcut olduğundan emin olun. </li><li> Kabarcıklar diskte gözlenirse, sarsıntı ve kültür ortamında 300 ul ekle ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, 15 dakika boyunca inkübe edin. Bu sürenin sonunda, hücre kültürü duvarından emme kültür ortamında 300 ul kaldırmak ve hava kabarcığı meydana olduğunu teyit etmektedir. </li></ol></li><li> Basit bir forseps kullanılarak yeni bir 24 oyuklu plaka diski yerleştirin. </li></ol><ol><li> Önceden ıslatılmış biyo materyal diskin yüzeyi üzerinde, üç alt kültürlerden (HG-DMEM 100 ul içinde 5 x 10 5:00-hMSCs) hücresel bir süspansiyon Seed ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, 30 dakika boyunca inkübe ° C. Hücreler tüm iskele topografya ile etkileşim sağlamak için biyomalzeme üst yüzünde yavaş yavaş ve sürekli bu adımı gerçekleştirin. Not: Bu prosedür, Tablo 1 &#39;de gösterilen biyo ekli hücrelerin% 60 elde edilir. </li><li> 37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde 3 gün için kültür, 37 ° C&#39;de HG-DMEM 1.5 ml ilave edilir, ve korumak. Kaçının kültür ortamının ilave türbülans oluşturmayan bu kültür plakası çanak alt hücre birikme. Bu ilk kez. </li></ol> Akış sitometride tarafından 4. Hücre Yüzey İşaretleyiciler karakterizasyonutrisi <ol><li> Matris diskte onları ekim önce 9. altkültür hücreleri ayırın. % 0.25 tripsin / 1 mM EDTA kullanarak ve buz gibi soğuk% 2 formaldehit 30 dakika boyunca sabitleyin. Tespit sonra,% 0.05 bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> Buz üzerinde 3 dakika boyunca% 20, insan bağışıklık, hücreler inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma bloke ve fikoeritrin (PerCP) 0.1 x 10 6 hücre alikotları inkübe CD73 FITC-konjüge Mab CD90, CD34 karşı PE-konjuge MAb karşı MAb ile konjüge edilmiş Karanlıkta 25 ° C &#39;de 1 saat süre ile, sonra ya FITC-konjüge Mab CD45 PE-konjuge Mab CD105. İzotip uyumlu FITC-konjüge Mab, PE-konjuge Mab andPerCP-konjuge Mab negatif kontroller olarak hizmet edecektir. </li><li> Bilgi kaydı ve analizi için yazılım kullanılarak yüzey markerlerinin ekspresyon seviyelerini hesaplar. </li></ol> Taramalı Elektron Mikroskobu 5. Hücre Adezyon Algılama <ol><li> PBS ile iki kez kültür 3 gün hücre disk örnekleri durulayınve 0.1 M Na-kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) solutionin% 4 (hacim / hacim), glutaraldehid ile fixthe örnekleri. </li><li> Daha önce Rivera-N ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi., Mikroskopik gözlem için 10 numune hazırlayın ve 15 kV arasında bir elektrik potansiyelinde ve 500X ve 2000X büyütülmüş bir tarama elektron mikroskobu kullanılarak dikkate alınmalıdır. </li></ol> 6. Hücre Proliferasyon Deneyi <ol><li> Kültür ortamı, 1.5 ml ihtiva eden hücre disk örnekleri için, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde hücreleri, üreticinin talimatlarına hayati renklendirici (AB) göre 150 ul ekle ve inkübe edilir. </li><li> Hemen AB (0 saat) ilavesi ve hücre kültürü 7 gün ulaşana kadar, her 24 saat sonra, 600 nm&#39;lik bir referans dalga boyu ile 570 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li></ol> 7. Koloni Oluşturma Birimi (CFU) 11 <ol><li> Kültür, 100, 100 mm doku kültürü Diskin HG-DMEM başına hücre ve 14 için inkübe37 ° C&#39;de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde gün. </li><li> Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca metanol içerisinde% 0.5 kristal mor ile PBS ile kültür ve leke yıkayın. </li><li> PBS ile iki kez yıkayın plakaları ve hemasitometre kullanarak görünür koloniler sayılır. </li></ol>

<ol>
	<li>Alviano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Term+amniotic+membrane+is+a+high+throughput+source+for+multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+the+ability+to+differentiate+into+endothelial+cells+in+vitro.">Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro.</a> BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).</li><li>Anker, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+or+maternal+origin+from+human+placenta.">Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.</a> Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).</li><li>Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+bone-graft+substitutes+regarding+to+cell+seeding+efficiency,+metabolism+and+growth+behaviour+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC)+in+vitro.">Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro.</a> Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).</li><li>Meseguer-Olmo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+kinematics+of+human+osteoblasts+on+porous+hydroxyapatite+ceramics.">In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics.</a> Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).</li><li>Fassina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-power+ultrasound+as+a+tool+to+culture+human+osteoblasts+inside+cancellous+hydroxyapatite.">Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite.</a> Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).</li><li>Fassina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+and+Electromagnetic+Enhancement+of+a+Culture+of+Human+SAOS-2+Osteoblasts+Seeded+onto+a+Titanium+Plasma-Spray+Surface.">Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).</li><li>Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+porosity+of+starch-based+fiber+mesh+scaffolds+on+the+proliferation+and+osteogenic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+cultured+in+a+flow+perfusion+bioreactor.">Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor.</a> Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).</li><li>Rodriguez-Fuentes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nukbone(R)+promotes+proliferation+and+osteoblastic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+amniotic+membrane.">Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).</li><li>Leyva-Leyva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesenchymal+stem+cell+subpopulations+from+human+amniotic+membrane+with+dissimilar+osteoblastic+potential.">Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential.</a> Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).</li><li>Rivera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blackwater+fever+like+in+murine+malaria.">Blackwater fever like in murine malaria.</a> Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).</li><li>Pochsmpally, R., Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Forming+Units+Assays+for+MSCs.">Colony Forming Units Assays for MSCs.</a> Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. , (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

amniotik membran (Şekil 1) elde edildi kök hücre bir fibroblast-benzeri morfolojisi, mezenkimal hücreler benzer (Şekil 2) gösteren ve esas olarak MSC&#39;ler idi. Buna ek olarak, akış sitometrisi analizleri, bu hücreler olmak üzere hematopoietik kökenli belirteçleri (CD34, CD45) (Şekil 3), mezenkimal hücre belirteçleri (CD73, CD90 ve CD105) için pozitif ve negatif olduğu saptandı. Ayrıca, bu işin izole AM-hMSCs CFU (Şekil 6) oluşturma yeteneğini sunmaktadır. Benzer şekilde, bu formda izole mezenkimal kök hücreler (Şekil 5) osteoinductor biomateryalin (Şekil 4) eklemek, ve iskele üzerinde çoğalmaya yeteneği korudu. Bu nedenlerden dolayı, bu çalışmada kullanılan gözenekli kemik biomateryalin AM-hMSCs kültür yöntemi yaralı kemik dokusu içinde hücreler eklemek ve differe ikna etmek için bir fırsat temsilosteoblastik soy ntiation. Bu kültür sistemi NKB bir osteokondüktif andosteoinductive malzeme 8, çünkü, osteoblast fenotip ve Osteoblastik farklılaşma işlemin muhafaza edilmesi için osteoblastik endüktör eklenmesini gerektirmez. İnsan plasentasından atık dokuların kullanımı sıklıkla invazif yöntemler ya da düşük hücre verimi içeren diğer kaynakları ile karşılaştırıldığında, MSC içine ayırt etmek için potansiyeli olan, kök hücrelerin bir popülasyonu ulaşmak için basit ve etik bir alternatiftir. Hücreler üst yüzey malzemesi mikro-kütle numaralı seribaşı çünkü önerilen kültür yöntemi in vivo sistemlere varılıp varılamayacağı, ve hücreler kolonize ve uygun inkübasyon süreleri sonrasında tüm biyomalzeme yüzeyine yapışır. Bu tekniği uygularken Ayrıca, gelişmiş reaktifler, ekipman ve prosedürler de mevcut yöntemlerin aksine, mikro-kütle cultureas olan gerekli değildirmateryal hücresel alikotundan yavaş ve istikrarlı birikim hücreleri tercihen plaka alt ile biyomateryal ile etkileşim değil, emin olmak için. Bu yüzey üzerinde veya gözeneklerin içinde ise ne olursa olsun malzemeye bağlandıktan sonra, hücreler, kültür ortamından gerekli besinleri olmasını sağlar Diğer bir önemli nokta, hücrelerin kültürlenmesi önce, önceden ıslatılmış malzemenin kullanılmasıdır. Uyarılması ve osteoblast farklılaşmasını sağlamak için dış faktörlerin ilave önler çünkü Son olarak, osteoindüktif bir biyo materyalin kullanılması, bu süreç için önemlidir. tekniğin sınırlama sığır matris osteoendüktif potansiyele dayalı olmasıdır; Bununla birlikte, önerilen kültür sistemi 200 um, 20 bir gözenek dağılımına sahip bir gözenekli malzemeye uyarlanabilir. Bu nedenle, bu çalışmada sunulan prosedür çeşitli malzemeler t mezenkimal kök hücrelerin kültürü için alternatif bir yöntemdirşapka, özellikle kemik rejenerasyonu için, doku mühendisliği için kullanılmaktadır.

Orada çift oluşturan ve doku ororgan bir lezyon etkisiz hale olabilir ve bazı durumlarda, öldürücü çünkü tıp bilimi Themain hedeflerinin tissuesis bir rejenerasyonu. Bağlamda, sağlık çalışanları ve araştırmacılar sürekli yeni tedavi alternativesto hasarlı doku orada çifti-rejenerasyon süreci teşvik sağlamak için teknikler, yöntemler ve araçlar arıyorsunuz. Bu hücre soyu, doku rejenerasyon sürecini incelemek için ideal bir model temsil nedenle, biyomedikal bilimler ektodermal, mezodermal ve endodermal için ayırt nedeniyle potansiyeli, mezenkimal kök hücrelerin (MKH), özellikle erişkin kök hücrelerin çalışmasında odaklanmıştır hücre soyları Ancak, MSC ile bir gerçeklik terapisi yapmak, MKH thetherapeutic potansiyelinin karakterizasyonu konak dokusunda MKH istenen davranışı garanti biomateryaller ve hücresel iskeleleri kullanarak yeni hücre kültürü teknikleri uygulanması eşlik etmelidir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; kemik rejenerasyonu MKH ile bir kültürün uygulanmasında üstesinden gelmek için temel zorluk, genel istihdam edilmiştir mikrometre milimetre arasında değişen gözenek adistribution ile gözenekli bir yapı arz seçilen biyomalzeme, hücre yapışmasını sağlamak için bir ancak sık sık hücrelerin davranışını değiştiren gelişmiş reaktifler, ekipman, ve prosedürleri gerektirir. Bu prosedürler, ancak insan gibi ya da in vivo tahliller kompleks açık sistemlerde ekstrapolasyon ve uygulanması için, in vitro olarak tahmin etmek için de uygundur. Bu tür gözenekli kemik malzemesi olarak rasgele topografyalarının, hücre yapışmasını odaklanmaya teknikleri, kültür kuyularının alt malzemenin yapışması ile incelenmiştir ve kolajenleri ve agaroz polimerler kullanılmıştır. Bu yöntem için, yüzey üzerinde tohumlandı hücre gözeneklerine ve üst yüzeyi üzerinde muhafaza edildi. Ancak, bu boyut, bir in vivo olarak temin edilemezbiyo materyal çevreleyen vücut sıvıları gözenekli iskelelerde istenen bölgeye hücrelerin sürükleyebilir olan sistem, karmaşık ekipman gerektirir, ancak in vitro deneylerde 5 osteoblastik markerlerin ifadesi teşvik ultrasonik uyarılması, kullanılmasıdır. Sürekli kültür kullanımı kültür ortamı içinde bir besin homojen bir dağılım garanti biyoreaktörler gerektirir; bağlı olarak, bu teknik ve cihaz duvarına orta yapıştırma kullanılan akış hızı, kültür ortamının değiştirilmesiyle ancak, kültürlenmiş hücrelerin önemli bir yüzdesi kaybolur. Bu sorunlar, bu kültür Çeşidi ve hücreler 7 yeterli sayıda elde etmek için bir süre için gerekli olan hücre kütlesini arttırmak. Bu nedenle, bu çalışmada sunulan yöntem hücrelerin bir üst yüzey malzemesi mikro kütle tohumlanır; in vivo olarak sistemlere ekstrapole edilmesi gereken bir tekniği temsil eder, ve olan Genel sonrainkübasyon kez yedik, ilk hücresel kütlesinin% 60 yapıştırılır. NKB bir osteokondüktif ve osteoindüktif iskeleleri 8, yöntem çünkü Ayrıca, bu teknik, osteoblastik indüktörler (örneğin, deksametazon, askorbik asit ya da p-gliserofosfat) veya osteoblast farklılaşmasını ve osteoblast fenotip bakım uyarılması için ultrasonik uyaranların eklenmesini gerektirmez hasarlı kemik dokusu içine hücreleri eklemek ve osteoblastik soy farklılaşmaya yol bu iş representsapossibility sunulan gözenekli kemik biomateryalin insan amniyotik membranın (AM-hMSCs) den MKH kültürü için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>sterile phosphate buffered saline</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10010023</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10378016</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>26140111</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11965118</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type II</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>17101015</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mM calcium chloride</td>
			<td>SIGMA_ALDRICH</td>
			<td>C5670</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/0.5mM EDTA solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>R001100</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC- CD90,</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD34</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD45</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD105</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BD FACSCalibur</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue (AB)</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUNRISE-reader</td>
			<td>TECAN, Germany</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human mesenchymal stem cells and their cultivation on the porous bone matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

İnsan mezenkimal kök hücre izolasyonu Künt diseksiyon (Şekil 1) kullanılarak koryon AM mekanik ayrılmasından sonra, yapışık hücre popülasyonu tripsin ve kolajenaz II sindirimi ile elde edildi. Sağlıklı donor anne elde edilmiştir, optik mikrografı (Şekil 2A) ve tarama elektron mikroskobu (Şekil 2B) bu çalışmada .Kullanılan plasenta gösterildiği gibi 3 gün fibroblast benzeri hücre morfolojisi tanıtımın kültür kabına bağlı Bu hücreler izole yayınlamak withprevious aydınlatılmış onam. Flow sitometri ile hücre karakterizasyonu AM elde edildi hücre popülasyonu (3,46 ± 79%) yüzey mezenkimal belirteçleri CD90 + (6,85 ± 93.5%) ve CD73 + ve CD105 + kuvvetle tepkisel ve böyle CD34 ve CD45 gibi hematopoetik belirteçler olumsuz tepki gösterdi. Bu durumda,Bu çalışmada kullanılan AM-hMSCs önce Leyva ve ark. (Şekil 3) tarafından bildirilen accordancewith bilgi, mezenkimal edildi. Ayrıca, bu sonuç mezenkimal kök hücreler için Hücresel Tedavi için Uluslararası Derneği (ISCT) tarafından kurulan immünofenotipi özellikleri ile çakışmaktadır. Kemik matrisinin Hücre yapışması Tarama mikrografları NKB üzerinde katman sonra AM-hMSCs yedi gün davranışını göstermektedir. biyo yüzeyi küresel hücrelerin (bir gün), ve görünüşe göre yedinci günde sığır matris yüzeyine bağlı bir yayılma hücrelerle kaplanmıştır. Daha yüksek bir büyütmede, yayılan hücrelerin filipodial süreçler (FL) (Şekil 4) ile yakın temas içinde olduğu ortaya çıktı. Kemik matrisinin Hücre çoğalması AB deneyinin sonuçları nispi absorbans az bir artış göstermiştir u<html> nit sığır matris durum (+ kemik matris) (RAU), inkübasyondan 1 gün sonra ve daha sonra beş gün, skafoldun varlığı, sığır yokluğunda yapılan kültür ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak önemli hücre çoğalmasında bir artışa neden olur Matris (-bone matris) (Şekil 5). Koloni Oluşturma Birimi CFU kök hücrelerin bir geleneksel deneyidir. Bu çalışmada izole AM-hMSCs kültürde 14 gün sonra ayrı ayrı koloniler oluşturmak için kabiliyetini korumuştur. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51999/51999fig1highres.jpg" /> Şekil 1: amniyotik membran izolasyonu. (A) göbek kordonu (UC) amniyotik zar elde edildiği bölgeyi tanımlamak için tek elle tutulur. (B) amniyotik membran (AM) kan inervasyonları olmadan saydam bir film benzer. Her zaman &quot;&gt;:&quot; tutmak-together.within-sayfa = fo &quot;ve_content <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51999/51999fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. İnsan amniyon zarı kök hücrelerin morfolojik özellikleri sonrası izolasyon 3 gün AM-hMSC kültürleri bir optik mikroskop kullanılarak gözlenen ve fibroblast-benzeri morfolojisi gösterildi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51999/51999fig3highres.jpg" /> Şekil 3:. Karakterizasyonu Akış sitometrisi insan amnion membrandan hücreler, mezenkimal belirteçleri (CD73, CD90, CD105) için pozitif olduğu için sağa histogram yer değiştirmesi ile gösterildiği gibi, en çok mezenkimal hücreler, ve (hematopoetik belirteçler için negatif CD34 ve CD45), sola histogram yerinden tarafından onaylandıktan. PE ve FITC florokromlar isotypesfor kontrol gözlenir ise antijenler kırmızı histogramlar gösterilmiştirSiyah. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/51999/51999fig4highres.jpg" /> Şekil 4:.. Sığır kemik matrisi üzerinde biyomalzemenin gözenekleri hücrelerin eki gösteren SEM görüntüleri bir dizi Hücre yapışma (A) küresel devletinin (CS) &#39;de biyomateryal yapışık çeşitli hücreleri ile bir NKB gözenek Panoramik vizyon ve Biyo materyalin yüzeyinde (CF), düzleştirilmiş, sığır matrisi üzerinde kültürün üç gün boşluk (Lac) halinde gösterir kemik takdir edilmesi de mümkündür. yüzeyinde uyum sürecinde hücresi (B) Amplifikasyon filipodial projeksiyonlar aracılığıyla malzeme sığır matris üzerinde yapıştırılır ve basık iki hücre arasındaki (C) Etkileşim (C1, hücre 1 ve C2, hücre 2).. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51999/51999fig4large.jpg" target="_blank">v için tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir sürümünü IEW. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/51999/51999fig5highres.jpg" /> Şekil 5:. Sığır kemik matris hücre çoğalması üzerinde hücrelerinin çoğalması AB azaltılması ile değerlendirildi ve yetiştirme 7 gün boyunca göreceli emme birimleri cinsinden ifade edildi. Sonuçlar negatif durum (-bone matris) ile karşılaştırıldığında statik farklı AM-hMSCs çoğalmasında, kemik matrisinin (+ kemik matrisi) etkisi gösterilmiştir. (* P &lt;0.05) <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/51999/51999fig6highres.jpg" /> Şekil 6: MSC CFU tahlili başlangıçta farklı yoğunluklarda kaplanmıştır ve 14 gün süre ile kuluçkaya yatırılır (- SD, n = 10 * /) alınmıştır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Hücreler yapıştırılır </td><td> Hücre yapışma (%) </td></tr><tr><td> Alt Hücreler </td><td> 187.667 ± 1.208 </td><td> 62.47 </td></tr><tr><td> Iskele üzerinde Hücreler </td><td> 312.333 ± 1.208 </td><td> 37,53 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Üç nüsha için iki deney bağımsız sığır matris üzerinde yapışma Verimlilik plaka çanak alt ve iskele üzerinde kalarak hücrelere yapışık hücreler tabloda sunulan trypsinization.The verileri tarafından kurtarıldı sonra hemasitometre tarafından sayıldı karşılık standart sapma ±

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix at JoVE.com

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

isolation-human-mesenchymal-stem-cells-their-cultivation-on-porous

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

27.4K Görüntüleme.  Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Video: Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...