私たちは、Facultadデ食事と-UNAM DGAPA IN201510とDGAPA IN216213、ConsejoナシオナルデCiencia yのテクノロジア（CONACyT No.49887）が提供する奨学金や財政支援を認める。セルバンテスナシオナル·デ·Perinatologíaのサルバドールコレア生物学的物質との助けのため。 Nukboneを供与するための、およびBiocriss、SA·デ·C. V。またイングに感謝。 IIM、UNAMのヘクター·マルティネスと技術支援のためのCINVESTAVのM EN Cファビオラ·ゴンザレス。

本研究は、人間が関与する研究の倫理的な行動に関するヘルシンキの世界医師会の宣言に従って行われたとFacultadデ食事と、UNAM（プロジェクト番号101から2012）の研究倫理委員会によって承認された。 ヒト間葉系幹細胞の単離<ol><li>試薬の調製<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製し、1％抗生物質 - 抗真菌溶液を補充する。 </li><li>ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（HG-DMEM）を調製し、0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質 - 抗真菌solution.Sterilizeこの培地を加える。 </li><li> FBSまたは抗生物質 - 抗真菌ソリューションなしでHG-DMEMで100 U / mlのコラゲナーゼII溶液を調製する。 </li><li>標準はさみ：オートクレーブ滅菌による単離のために必要とされる以下の手術器具を、滅菌sの、単純な切開鉗子、細かい点と歯鉗子およびメスハンドル（＃4）。 </li></ol></li><li>人間の羊膜の間葉系幹細胞の単離<ol><li>片手でへその緒を持ち、もう一方の手で、約5cm 2の断片を得るために、半透明のシートのように見える羊膜（AM）を、デタッチ。絨毛膜部が試料中に存在する場合には絨毛膜部が羊膜よりも厚いように、手動の切開によって、基礎となる絨毛膜を​​分離する。 </li><li> 5mlのPBSの3回の洗浄で残留血液を取り出し、簡単な鉗子で血栓を取り除く。約0.5cm 2の断片を生成するために、メスで午前中に小さなカットを行います。 </li></ol></li><li>羊膜の酵素消化<ol><li> 0.125％トリプシンを5ml / 5％CO 2雰囲気中で37℃で50mlの円錐管中で30分間37℃で0.5mMのEDTA溶液でAMをインキュベートする。 250での遠心機XGと25°Cで5分間、その後、上清を捨てることによってトリプシン溶液を除去。 </li><li>コラゲナーゼII型溶液15mlを加え、時折レイバらによると、振とうしながら、5％CO 2雰囲気中で37℃で2時間インキュベートする。9 </li><li>直ちにコラゲナーゼIIで消化した後、10分間、250×gで25℃で15 mlのPBSと遠心を追加する。 </li><li>上清を捨て、250×gでPBS溶液と遠心分離機の15ミリリットルと15分間、25℃で細胞のペレットを洗浄。上清を捨てる。 </li><li>軽く振りHG-DMEM 10ml中の細胞のペレットを再懸濁。 </li></ol></li><li>間葉系幹細胞の増殖<ol><li>培養フラスコ中の種子の細胞懸濁液2mlを（1×10 4細胞/ cm 2）、およびHG-DMEM 2 mlを追加し、5％CO 2雰囲気中37℃で細胞をインキュベートする。 5-7の後に培地を変更することにより、非接着細胞を除去する日。 </li><li>この時間の後、90％の細胞集密度を得るために、追加の7~10日間3日ごとに培地を変える。 </li><li>細胞を回収し、0.125％トリプシン/ EDTA溶液（トリプシン処理）で5％CO 2雰囲気中で37℃で5分間、それらをインキュベートする。 </li><li>すぐにトリプシン処理した後、5分間250×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にピペットと転送で細胞を集める。 </li><li>上清を捨て、HG-DMEM 10mlの細胞のペレットを再懸濁。 </li><li> 2 75cm 2の培養フラスコ（各フラスコ中の5ml）中の培養細胞懸濁液を、90％コンフルエンスになるまで培養を維持する。 </li><li>繰り返します1.4.3を繰り返します。 1.4.6に、第9の通路またはサブカルチャーまで、。 </li><li>フローサイトメトリーや他の研究のために1.4.5に1.4.3のステップのように、トリプシン処理により細胞を回収する。 </li></ol></li></ol>多孔質骨基質ディスク（NKB）の調製<ol><li> NKBディスクを濡らし（直径12mmで、厚さ2mm）を、Fassina らによると、37℃、5％CO 2の加湿雰囲気中FBSなしHG-DMEM 3mlの一晩各ディスクをインキュベートする5。 </li><li>湿潤処理後、過剰の培地を除去し、5分間250×gで50mlの円錐管とスピンディスクを置く。 24ウェル細胞培養プレートにディスクを置きます。 <ol><li> HG-DMEM500μlのを追加し、25℃で30分間インキュベートする。気泡が栄養素と細胞の正確な分布を優先するようにNKBのディスク上に存在していないことを確認してください。 </li><li>気泡がディスク上に認められた場合には、振ると培地300μlを添加し、37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で15分間インキュベートする。この時間の後だけでなく、細胞培養の壁を通って吸引培養液300μlのを削除し、気泡が形成されないことを確認してください。 </li></ol></li><li>シンプルな鉗子を使用して、新しい24ウェルプレートにディスクを置きます。 </li></ol><ol><li>予め湿らせた生体材料ディスクの表面上の3つのサブカルチャーからの細胞懸濁液（5×10 5 AM-hMSCのHG-DMEM100μl中）に播種し、37℃で5％のCO 2の加湿雰囲気中で30分間インキュベートする°C。細胞はすべての足場の地形と対話できるように生体材料の上面にゆっくりと継続的にこの手順を実行します。注：この手順は、 表1に示した生体材料に付着した細胞の60％を達成する。 </li><li> 37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で3日間培養して、37℃でHG-DMEMの1.5ミリリットルを追加し、維持する。その培養プレート皿の底上の細胞の堆積回避のための培養培地の添加で乱流を生成しません。これは最初の時間です。 </li></ol>フローCytom 4.細胞表面マーカーのキャラクタリゼーションetry <ol><li>行列のディスク上に播種する前に9 番目のサブカルチャーから細胞を切り離します。 0.25％トリプシン/ 1mM EDTAを使用し、氷冷2％ホルムアルデヒド中で30分間それらを修正。固定後、0.05％PBSで細胞を1回洗浄します。 </li><li>氷上で3分間20％のヒト免疫グロブリンで細胞をインキュベートすることによって非特異的結合をブロックし、フィコエリトリン（PerCP標識）で0.1×10 6細胞のアリコートをインキュベートは、CD73、FITC結合mAb CD90、CD34に対するPE結合mAbに対するmAb -結合暗闇の中で25℃で1時間、FITC結合mAb CD45およびPE結合mAb CD105。アイソタイプが一致したFITC結合mAb、PE結合mAb andPerCP結合mAbを陰性対照にサービスを提供する。 </li><li>データ収集と分析のためのソフトウエアを用いて表面マーカーの発現レベルを計算する。 </li></ol>走査型電子顕微鏡5.細胞接着の検出<ol><li> PBSで2回3日間の培養における細胞のディスクのサンプルをリンス0.1 MのNa-カコジル酸緩衝液（pH7.2）solutionin 4％（v / v）のグルタルアルデヒドfixtheサンプル。 </li><li> 10。以前らリベラ-Nによって報告されるように、顕微鏡観察のための試料を調製し、15kVでの電位にし、500X及び2000Xの倍率で走査型電子顕微鏡を用いて観察する。 </li></ol> 6.細胞増殖アッセイ<ol><li>培地1.5 mlを含有する細胞のディスクのサンプルを、製造業者のガイドラインに従ってバイタル色素（AB）の150μlを添加し、37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で細胞をインキュベートする。 </li><li>すぐに、細胞培養の7日に達するまでAB（0時間）、各24時間の添加後、600nmの参照波長で570nmで吸光度を測定する。 </li></ol> 7コロニー形成単位（CFU）11 <ol><li>培養100mmの組織培養diskin HG-DMEM当たり100細胞および14インキュベート37℃、5％CO 2の加湿雰囲気中日。 </li><li>室温で5〜10分間、メタノール中0.5％クリスタルバイオレットで染色し、PBSで培養物を洗浄する。 </li><li>二回PBSでプレートを洗浄し、血球計数器を使用して目に見えるコロニーを数える。 </li></ol>

<ol>
	<li>Alviano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Term+amniotic+membrane+is+a+high+throughput+source+for+multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+the+ability+to+differentiate+into+endothelial+cells+in+vitro.">Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro.</a> BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).</li><li>Anker, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+or+maternal+origin+from+human+placenta.">Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.</a> Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).</li><li>Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+bone-graft+substitutes+regarding+to+cell+seeding+efficiency,+metabolism+and+growth+behaviour+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC)+in+vitro.">Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro.</a> Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).</li><li>Meseguer-Olmo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+kinematics+of+human+osteoblasts+on+porous+hydroxyapatite+ceramics.">In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics.</a> Rev. Ortop. 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J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Forming+Units+Assays+for+MSCs.">Colony Forming Units Assays for MSCs.</a> Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. , (2008).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

ヒト羊膜（ 図1）から得られた幹細胞は、線維芽細胞様の形態、間葉系細胞に類似した（ 図2）を示し、主にMSCをした。また、フローサイトメトリーアッセイは、これらの細胞が造血マーカー（CD34、CD45）（ 図3）のための間葉細胞マーカー（CD73、CD90、およびCD105）は、正および負であることが明らかになった。また、AM-たhMSCは、CFUの（ 図6）を形成する能力を提示し、この作業中に単離した。同様に、この形で単離された間葉系幹細胞（ 図5）osteoinductor生体材料（ 図4）に付着し、足場に増殖する能力を保持した。 これらの理由から、本研究で使用したマクロ多孔性骨生体材料上のAM-hMSCの培養方法は、負傷した骨組織内の細胞に挿入して、そのdi​​ffereを誘発する機会を表す骨芽細胞系統へntiation。 NKBは骨伝導andosteoinductive材8であるため、この培養系は、骨芽細胞の表現型および骨芽細胞分化プロセスを維持するために、骨芽インダクタの添加を必要としない。例えば、ヒト胎盤などの廃棄組織の使用は、しばしば侵襲的方法または低い細胞収率を伴う他のソースと比較して、MSCが分化する可能性を有する幹細胞の集団にアクセスするためのシンプルかつ倫理的な代替手段を表す。 細胞を上部表面材料にマイクロマスに播種し、細胞がコロニーを形成し、適切なインキュベーション時間の後に全体の生体材料の表面に付着しているため、提案培養方法は、 インビボ系に外挿することができる。この技術を実装する際にさらに洗練された試薬、機器や手順も同様に既存の方法とは異なり、マイクロマスcultureasをしている必要はありません細胞が優先的に生体材料とではなく、プレートの底と相互作用することを確実にする材料上の細胞のアリコートのゆっくりと着実な堆積。これは、それらが表面または細孔内にある場合、それらは関係なく、材料に組み込まれたとき、細胞が培養培地から必要な栄養を持っていることを保証するように、別の重要な点は、細胞を培養する前に予め湿潤材料の使用である。それは骨芽細胞分化を誘導し、維持するために、外部因子の添加を回避するので、最終的に、骨誘導生体材料の使用は、このプロセスにとって重要である。技術の制限は、ウシマトリックスの骨誘導可能性に基づいていることである。しかしながら、提案された培養系は、20〜200μmでの細孔分布を有する任意の多孔質材料に外挿することができる。したがって、この研究で提示手順は、様々な材料tの間葉系幹細胞を培養するための代替方法がある帽子は、特に骨再生のために、組織工学のために使用される。

そこにペアリングおよび組織ororganで病変が身体の自由を奪うことと、いくつかのケースでは、致命的なことができるので、医学のthemain目的のtissuesis 1の再生。コンテキストでは、医療従事者や研究者は常に損傷組織のそこペア再生プロセスを促進する新たな治療alternativestoを提供するために、技術、方法およびツールを探している。この細胞系統により、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化するその潜在的に、組織再生プロセスを研究するための理想的なモデルを表しているので、したがって、生物医学科学は、間葉系幹細胞（MSC）、特に成体幹細胞の研究に集中している細胞系統は、しかし、MSCSを現実に治療を行うために、MSCのthetherapeutic可能性の特徴付けは生体材料と宿主組織にMSCの目的の動作を保証するものでは細胞の足場を使用して、新しい細胞培養技術の実装を添付しなければならない。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;骨再生中のMSCと培養の実施に克服する主要な課題は、一般的に採用されているマイクロメートルからミリメートルの範囲の細孔のadistribution有する多孔質構造を提示し、選択可能な生体材料上での細胞接着を確保するためであるしかし頻繁に洗練された試薬、機器、および細胞の挙動を変更する手続きが必要です。これらの手順は、 インビトロ評価のためではなく、ヒトなどのアッセイまたはインビボアッセイにおける複雑なオープンシステム内挿および実装するのに適している。このような多孔質骨材としてランダムトポグラフィに細胞接着性を確保するに焦点を当てる技術は、培養ウェルの底に材料が付着して研究し、コラーゲンおよびアガロースポリマーが使用されてきた。これらのメソッドについては、表面に播種した細胞は細孔内に、上部表面上に保持された。しかし、この態様は、 インビボで確保することができない生体材料の周囲の体液は多孔質足場上の所望の部位から細胞をドラッグすることができているシステムは、精巧な装置を必要とするが、 インビトロアッセイ5に骨芽細胞マーカーの発現を促進する超音波刺激の使用である。連続培養の使用は、培養培地中の栄養分の均一な分布を保証するバイオリアクターを、必要とによるこの技術及び設備の壁に付着媒体に使用される流量に培地を交換するときしかし、培養細胞のかなりの割合が失われる。これらの問題は、培養物のこのタイプの細胞7の十分な数を得るために時間が必要である細胞の量を増加させる。したがって、この研究で提示方法は、細胞を、頂面材上にマイクロマスに播種するための生体内システムに外挿されるべき技術を表し、appropri後インキュベーション時間を食べた、初期の細胞質量の60％が接着されている。 NKBは、骨伝導性および骨誘導性足場8、方法であるため、また、この技術は、骨芽インダクタ（ 例えば、デキサメタゾン、アスコルビン酸、またはβ-グリセロリン酸）または骨芽細胞分化及び骨芽細胞表現型の維持を誘導する超音波刺激の添加を必要としない損傷した骨組織に細胞を挿入し、骨芽細胞系統への分化を誘導するために、この作業representsapossibilityで提示マクロポーラス骨生体材料上にヒト羊膜（AM-hMSCが）からMSCの培養のために。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>sterile phosphate buffered saline</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10010023</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10378016</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>26140111</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11965118</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type II</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>17101015</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mM calcium chloride</td>
			<td>SIGMA_ALDRICH</td>
			<td>C5670</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/0.5mM EDTA solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>R001100</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC- CD90,</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD34</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD45</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD105</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BD FACSCalibur</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue (AB)</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUNRISE-reader</td>
			<td>TECAN, Germany</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human mesenchymal stem cells and their cultivation on the porous bone matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

ヒト間葉系幹細胞の単離鈍的切開（ 図1）を使用して絨毛膜からAMの機械的分離の後、接着細胞集団を、トリプシンおよびコラゲナーゼII消化によって得られた。健康なドナーの母親から得た光学顕微鏡写真（ 図2A）及び走査型電子顕微鏡写真（ 図2B）、この研究で使用.theの胎盤に示すように、3日目に線維芽細胞様細胞の形態presenta培養皿に付着したこれらの細胞集団の単離を投稿インフォームドコンセントwithprevious。 フローサイトメトリーによる細胞の特徴付け AMから得られた細胞集団は、表面間葉系マーカーCD90 +（6.85±93.5％）およびCD73 +及びCD105 +（3.46±79％）に強く反応性であり、そのようなCD34-およびCD45などの造血マーカーに陰性反応を示した。このように、この作品で使用されるAM-たhMSCは、以前レイバらによって報告されたaccordancewith情報で、間葉だった。（ 図3）。さらに、この結果は、間葉系幹細胞のための細胞療法のための国際協会（ISCT）によって確立された免疫表現型特性と一致する。 骨基質上の細胞接着スキャン顕微鏡写真は7日NKB​​に重ねた後、AM-hMSCの挙動を示す。生体材料の表面は、球状細胞（初日）で覆われており、いくつかの拡散セルは、見かけ上七日目にウシマトリックス表面に付着させた。より高い倍率では、拡散セルはfilipodialプロセス（FL）（ 図4） を介して密着するように思われた。 骨基質上の細胞増殖 ABアッセイの結果は、相対的な吸光度のわずかな減少を示したのu<html>ニットウシマトリックス条件（+骨基質）の（RAU）インキュベーションの1日後、その後5日目に、足場の存在は、ウシの非存在下で行わ培養と比較して統計学的に有意な細胞増殖の増加を誘導するマトリックス（-boneマトリックス）（ 図5）。 コロニー形成単位 CFUは、幹細胞の伝統的アッセイである。この作品において単離さAM-たhMSCは、培養中の14日目の離散コロニーを形成するその能力を保存した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig1highres.jpg" /> 図1：羊膜の分離。 （A）、臍帯（UC）は、羊膜が得られる領域を同定するために片手で保持されている。（B）羊膜（AM）は、血液神経支配することなく、半透明膜に似ている。 常に &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページFO」ve_content <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig2highres.jpg" /> 図2：ヒト羊膜由来の幹細胞の形態学的特性 AM-hMSCの培養3日後の単離では、光学顕微鏡を用いて観察し、線維芽細胞様の形態を示した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig3highres.jpg" /> 図3：。（右のヒストグラムの変位により示されるように、彼らは、間葉系マーカー（CD73、CD90、CD105）陽性であったため、人間の羊膜から細胞は主に、間葉系細胞であった特性評価フローサイトメトリー 、および造血マーカーは陰性CD34およびCD45）、左にヒストグラムの変位によって確認されるように。 PEおよびFITC蛍光色素isotypesfor制御がで観察されている間の抗原は、赤のヒストグラムに示されている黒。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig4highres.jpg" /> 図4：ウシ骨マトリックス上での細胞接着生体材料の細孔内への細胞の付着を示すSEM画像列球状状態（CS）における生体材料に付着した複数のセルとNKB細孔の（A）のパノラマビジョン生体材料の表面に（CF）平坦化され、骨小腔がウシマトリックス上の培養3日目に（ラック）として示して鑑賞することも可能である。細胞の（B）の増幅の表面に適応させるプロセスでfilipodial予測を通る材料ウシマトリックスに付着し、平らに2セルの間の（C）の相互作用は、（C1、セル1;およびC2、セル2）。。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51999/51999fig4large.jpg" target="_blank">Vにはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版をIEW。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig5highres.jpg" /> 図5：ウシ骨マトリックス細胞増殖における細胞の増殖は、ABの減少によって評価培養の7日間に沿って相対的な吸光度単位で表した。結果は、陰性症状（-boneマトリックス）と比較して、静的に異なっていたAM-hMSCの増殖における骨基質（+骨基質）の影響を示している。た（* p &lt;0.05） <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig6highres.jpg" /> 図6：MSCのCFUアッセイは、最初に様々な密度でプレーティングし、14日間培養し（* /意味- SDを、N = 10）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td>細胞が付着した</td><td>細胞接着（％） </td></tr><tr><td>底の細胞</td><td> 1876​​67±1208 </td><td> 62.47 </td></tr><tr><td>足場上の細胞</td><td> 312333±1208 </td><td> 37.53 </td></tr></tbody></table> 表1：三重のための2つの独立した実験にウシのマトリックス上の接着の効率化プレート皿の底と足場に付着した細胞に付着した細胞は、表に示さtrypsinization.Theデータによって回復された後、血球計によりカウントした対応標準偏差は±

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

27.4K ビュー.  Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...