Wir sind uns der Wissenschaft und von der Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 und DGAPA IN216213 finanzielle Unterstützung; Salvador Correa des Instituto Nacional de Perinatología um Hilfe mit dem biologischen Material; und Biocriss, SA de C. V für die Spende Nukbone. Danke auch an Ing. Héctor Martínez von IIM, UNAM und M en C Fabiola Gonzalez von CINVESTAV für die technische Unterstützung.

Diese Untersuchung wurde in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki des Weltärztebundes betreffend das ethische Verhalten der Forschung am Menschen durchgeführt und von der Forschung Ethik Board of Facultad de Medicina, UNAM (Projektnummer 101-2012) genehmigt. 1. Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen <ol><li> Herstellung von Reagenz <ol><li> Bereiten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Zuschlag mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung. </li><li> Bereiten Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, hoher Glucose (HG-DMEM), und gibt 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum-Antimykotikum solution.Sterilize dieses Kulturmedium durch Filtration durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Bereiten Sie eine Collagenase II Lösung bei 100 U / ml in HG-DMEM ohne FBS und Antibiotika-Antimykotika-Lösung. </li><li> Sterilisieren Sie die folgenden chirurgischen Instrumenten, die für die Isolierung benötigt werden, durch Autoklavieren: Standard-Scheres, einfache Dissektionszangen, feinPunkt und Zahnzange und eine Skalpellgriff (# 4). </li></ol></li><li> Isolierung von mesenchymalen Stammzellen humanen Amnionmembran <ol><li> Halten Sie die Nabelschnur mit einer Hand und mit der anderen Hand, nehmen Sie den Amnionmembran (AM), die wie eine durchlässige Scheibe aussieht, um ein Fragment von etwa 5 cm 2 zu erhalten. Wenn das Chorion Abschnitt in der Probe vorhanden ist, trennen Sie die zugrunde liegenden Chorion durch manuelle Dissektion als das Chorion Abschnitt ist dicker als die Fruchtblase. </li><li> Rückstände von Blut mit drei Wäschen von 5 ml PBS und Blutgerinnsel entfernen, mit den einfachen Zange. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Uhr mit dem Skalpell, um Fragmente von etwa 0,5 cm 2 zu erzeugen. </li></ol></li><li> Enzymatische Verdauung von Amnionmembran <ol><li> Inkubieren AM mit 5 ml 0,125% Trypsin / 0,5 mM EDTA-Lösung bei 37 ° C für 30 min in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Zentrifuge bei 250xg und 25 ° C für 5 Minuten und entfernen Sie die Trypsin-Lösung von der Überstand verworfen. </li><li> 15 ml Kollagenase Typ II-Lösung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Atmosphäre unter gelegentlichem Schütteln nach Leyva et al. 9 </li><li> Unmittelbar nach der Verdauung mit Collagenase II, 15 ml PBS und Zentrifugation bei 250 × g und 25 ° C für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie den Zellpellet mit 15 ml PBS-Lösung und Zentrifuge bei 250 xg und 25 ° C für 15 min. Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 10 ml HG-DMEM durch leichtes Schütteln. </li></ol></li><li> Expansion von mesenchymalen Stammzellen <ol><li> Seed 2 ml der Zellsuspension (1 x 10 4 Zellen / cm 2) in Kulturflasche, und 2 ml von HG-DMEM und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Die Beseitigung der nicht-adhärenten Zellen durch Änderung des Kulturmediums nach 5-7Tagen. </li><li> Nach dieser Zeit, ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage für weitere 7-10 Tage, um eine zelluläre Zusammenfluss von 90% zu erhalten. </li><li> Recover die Zellen und Inkubation sie für 5 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre mit 0,125% Trypsin / EDTA-Lösung (Trypsinierung). </li><li> Unmittelbar nach Trypsinisierung gesammelt Zellen mit einer Pipette und in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugiert bei 250 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 10 ml HG-DMEM. </li><li> Kulturzellsuspension in zwei 75 cm 2 Kulturflaschen (5 ml in jeden Kolben) und die Kultur bis zu 90% Zusammenfluss aufrechtzuerhalten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3. bis 1.4.6, bis zum 9. Durchgang oder Subkultur. </li><li> Recover Zellen durch Trypsinisierung wie in den Schritten 1.4.3 bis für die Durchflusszytometrie oder andere Studien 1.4.5. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der porösen Knochenmatrix Datenträger (NKB) <ol><li> Um die NKB Scheiben nass(Durchmesser 12 mm; Dicke 2 mm). Inkubieren jede Platte über Nacht mit 3 ml HG-DMEM ohne FBS in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C, nach Fassina et al 5 </li><li> Nach der Benetzungsprozess, setzen Sie die Festplatte in einem 50 ml konischen Rohr und Spin bei 250 xg für 5 min, um überschüssige Kulturmedium zu entfernen. Legen Sie die Festplatte in einer 24-Well-Zellkulturplatte. <ol><li> Gib 500 ul der HG-DMEM und Inkubation für 30 min bei 25 ° C. Darauf achten, dass keine Luftblasen auf der NKB Platte, um die richtige Verteilung der Nährstoffe und Zellen begünstigen vorhanden sind. </li><li> Wenn sich Blasen an der Platte festgestellt, schütteln und 300 ul Kulturmedium und Inkubation für 15 min in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Nach dieser Zeit entfernen 300 ul Kulturmedium, das Saugen durch die Wand des Zellkultur und bestätigen, dass sich keine Blasen bilden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Festplatte in einem neuen 24-Well-Platte mit einfachen Zange. </li></ol><ol><li> Saatgut eine Zellsuspension (5 x 10 &amp; sup5 AM-hMSCs in 100 ul DMEM-HG) von drei Subkulturen, die auf der Oberfläche des vorbenetzten Biomaterial Platte und Inkubation für 30 min in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Diesen Schritt langsam und kontinuierlich auf der oberen Fläche des Biomaterials, damit die Zellen mit der Topographie des gesamten Gerüsts zusammenwirken. Hinweis: Dieses Verfahren wird erreicht, 60% der Zellen auf der in der Tabelle 1 gezeigt Biomaterial gebunden. </li><li> 1,5 ml von HG-DMEM bei 37 ° C und halten die Kultur für 3 Tage in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Turbulenzen in der Zugabe von Kulturmedium für vermeiden erzeugen Sie nicht, dass die Ablagerung von Zellen auf dem Boden des Kulturplatte Gericht. Dies ist Anfangszeit. </li></ol> 4. Zelloberflächenmarker Charakterisierung von Flow Cytometrie <ol><li> Trennen Sie die Zellen aus 9. Subkultur vor der Aussaat sie auf der Matrix Platte. Verwenden Sie 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und befestigen Sie sie für 30 Minuten in eiskaltem 2% Formaldehyd. Nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS 0,05%. </li><li> Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation der Zellen mit 20% Human-Immunglobulin für 3 Minuten auf Eis inkubiert und 0,1 x 10 6 Zellen Aliquots mit Phycoerythrin (PerCP) -konjugiertem MAb gegen CD73, FITC-konjugierten monoklonalen CD90, PE-konjugierte MAb gegen CD34 FITC-konjugiertem MAb CD45 und PE-konjugiertem MAb CD105 für 1 h bei 25 ° C im Dunkeln. Isotyp-FITC-konjugiertem MAb, PE-konjugiertem MAb andPerCP konjugierten MAb wird als negative Kontrollen dienen. </li><li> Berechnung der Expressionsniveaus der Oberflächenmarkern unter Verwendung von Software für die Datenerfassung und -analyse. </li></ol> 5. Cell Adhesion Erkennung durch Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Zweimal mit PBS spülen zellScheibenProben bei 3 Tagen Kulturund fixthe Proben mit 4% (v / v) Glutaraldehyd solutionin einer 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,2). </li><li> Vorbereitung der Proben für die mikroskopische Beobachtung, wie zuvor von Rivera-N et al. 10 und Beobachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop bei einer elektrischen Spannung von 15 kV und bei einer Vergrößerung von 500X und 2000X. </li></ol> 6. Cell Proliferation Assay <ol><li> Zu den Zellplatten-Proben mit 1,5 ml Kulturmedium mit 150 &amp; mgr; l von Vitalfarbstoff (AB) nach Herstellervorgaben und Inkubieren der Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Sofort nach der Zugabe von AB (0 h) und jeweils 24 h bis zum Erreichen von 7 Tagen nach der Zellkultur wird die Extinktion bei 570 nm mit einer Referenzwellenlänge von 600 nm. </li></ol> 7. koloniebildende Einheit (CFU) 11 <ol><li> Kultur 100 Zellen pro 100 mm-Gewebekultur Diskin HG-DMEM und Inkubation für 14Tage in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Waschen der Kultur mit PBS und Fleck mit 0,5% Kristallviolett in Methanol für 5-10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zweimal Waschen Sie die Platten mit PBS und zählen Sie die sichtbaren Kolonien mit einer Zählkammer. </li></ol>

<ol>
	<li>Alviano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Term+amniotic+membrane+is+a+high+throughput+source+for+multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+the+ability+to+differentiate+into+endothelial+cells+in+vitro.">Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro.</a> BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).</li><li>Anker, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+or+maternal+origin+from+human+placenta.">Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.</a> Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).</li><li>Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+bone-graft+substitutes+regarding+to+cell+seeding+efficiency,+metabolism+and+growth+behaviour+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC)+in+vitro.">Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro.</a> Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).</li><li>Meseguer-Olmo, L. 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J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Forming+Units+Assays+for+MSCs.">Colony Forming Units Assays for MSCs.</a> Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. , (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Stammzellen, die aus menschlichen amniotischen Membran (Figur 1) erhalten wurden, zeigten eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie, ähnlich mesenchymale Zellen (Abbildung 2) und waren hauptsächlich MSCs. Zusätzlich Durchflußzytometrie-Assays zeigten, dass diese Zellen waren positiv für mesenchymale Zellmarkern (CD73, CD90 und CD105) und negativen hämatopoetischen Linie Marker (CD34, CD45) (Abbildung 3). Auch die AM-hMSCs isoliert in dieser Arbeit präsentieren die Fähigkeit zur Bildung von KBE (Abbildung 6). Ebenso können die isolierten mesenchymalen Stammzellen in dieser Form behielt die Fähigkeit, sich an osteoinductor Biomaterials (4) zu befestigen, und vermehren sich auf dem Gerüst (5). Aus diesen Gründen wird das Kulturverfahren AM-hMSCs auf makroporösen Knochen Biomaterial, das in dieser Arbeit verwendet wurde, stellt eine Möglichkeit dar, um Zellen in verletzten Knochen Gewebeeinsatz und induzieren ihre differentiation auf die Osteoblasten-Linie. Dieses Kultursystem erfordert nicht die Zugabe von osteoblastischen Induktoren, um die Osteoblasten-Phänotyp und Osteoblastendifferenzierungsprozess aufrechtzuerhalten, da NKB eine osteokonduktive andosteoinductive Material 8. Die Verwendung von Abfall Geweben wie Plazenta, stellt eine einfache und ethischen alternative, um eine Population von Stammzellen, die das Potenzial Zugriff in MSCs differenzieren, im Vergleich mit anderen Quellen, die umfassen häufig invasive Methoden oder geringe Zellausbeute. Die vorgeschlagene Kulturverfahren könnte in vivo Systemen extrapolieren, da die Zellen in Mikromasse auf der Oberseite Material ausgesät und die Zellen zu besiedeln und sich an die gesamte Biomaterial-Oberfläche nach dem entsprechenden Inkubationszeiten. Des Weiteren werden anspruchsvolle Reagenzien, Geräte und Verfahren nicht erforderlich, im Gegensatz zu bestehenden Methoden bei der Durchführung dieser Technik sind die Mikromassen cultureas sowie dielangsame und stetige Abscheidung des zellulären Aliquot vom Material, um sicherzustellen, dass die Zellen bevorzugt mit dem Biomaterial zu kommunizieren, und nicht mit der Unterseite der Platte. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Verwendung von vorbenetzten Material vor dem Kultivieren der Zellen, da dies gewährleistet, dass die Zellen die notwendigen Nährstoffe aus dem Kulturmedium, wenn sie unabhängig in das Material integriert ist, wenn sie auf der Oberfläche oder in den Poren sind. Schließlich ist die Verwendung eines osteoinduktiven Biomaterials für diesen Prozess, weil es das Hinzufügen von externen Faktoren zu induzieren und aufrechtzuerhalten osteoblastische Differenzierung verhindert. Die Einschränkung der Technik ist, dass es auf der osteoinduktiven Potential des Rindermatrix basiert; Allerdings kann das vorgeschlagene Kultursystem einem porösen Material mit einem Porenverteilung von 20 bis 200 &amp; mgr; m hochgerechnet werden. Daher ist die in dieser Arbeit vorgestellten Verfahren eine alternative Methode zur Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus verschiedenen Materialien that sich für das Tissue Engineering zur Anwendung, insbesondere zur Knochenregeneration.

Es koppeln und Regeneration tissuesis einem themain Ziele der Medizin wegen einer Läsion in einem Gewebe ororgan kann kampfunfähig sein, und in manchen Fällen tödlich ist. In Zusammenhang werden die Gesundheit der Arbeitnehmer und Forscher ständig auf der Suche Techniken, Methoden und Werkzeuge, um neue therapeutische Alternativenzu fördern dort paarRegenerationsProzess von beschädigtem Gewebe. Daher haben Biomedizin auf die Untersuchung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs), insbesondere adulten Stammzellen konzentriert, da diese Zelllinie stellt ein ideales Modell für die Geweberegenerationsprozess zu studieren, aufgrund seines Potenzials an ektodermale, mesodermale und endodermale differen Zelllinien jedoch die Therapie mit MSCs Wirklichkeit werden zu lassen, muss die Charakterisierung thetherapeutic Potential von MSCs durch die Umsetzung neuer Zellkulturtechniken unter Verwendung von Biomaterialien und Zellgerüste, die das gewünschte Verhalten der MSCs in das Wirtsgewebe garantieren begleitet werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Hauptherausforderung bei der Durchführung einer Kultur mit MSCs in Knochenregeneration zu überwinden ist, die Zelladhäsion auf der ausgewählten Biomaterial, das im Allgemeinen stellt eine poröse Struktur mit adistribution der Poren im Bereich von Mikrometern bis Millimetern eingesetzt worden sichern jedoch erfordern oft anspruchsvollen Reagenzien, Ausrüstungen und Verfahren, die das Verhalten der Zellen zu verändern. Diese Verfahren eignen sich für die in vitro Bestimmung, aber nicht für die Extrapolation und Umsetzung in komplexen offenen Systemen, wie beispielsweise Menschen oder in vivo-Assays. Techniken, die auf die Gewährleistung Zelladhäsion an Zufalls Topographien wie poröse Knochenmaterialien zu konzentrieren, wurden von der Haftung des Materials auf den Boden des Kulturvertiefungen sucht und eingesetzt Kollagene und Agarose-Polymere. Für diese Verfahren wurden die Zellen, die auf der Oberfläche angeimpft wurden in den Poren und auf der Oberfläche zurückgehalten. Allerdings kann dieser Aspekt nicht in einem in vivo gewährleistet werdenSystem, in dem die Körperflüssigkeiten umgebenden das Biomaterial könnte die Zellen von der gewünschten Stelle auf porösen Gerüsten ziehen, ist die Verwendung von Ultraschall-Stimulation, die anspruchsvolle Ausrüstung erfordert, sondern fördert die Expression von Osteoblastenmarkern in in vitro-Assays 5. Die Verwendung von Dauerkulturen erfordert Bioreaktoren, die eine homogene Verteilung der Nährstoffe im Kulturmedium zu gewährleisten; Allerdings wird ein erheblicher Anteil der kultivierten Zellen beim Ersetzen des Kulturmediums durch die Durchflussrate, die in dieser Technik und dem Medium anhaftet an den Wänden der Geräte verwendet wird, verloren. Diese Probleme erhöhen die Zellmasse, die für diese Art der Kultur und der Zeit, um eine ausreichende Anzahl von Zellen 7 notwendig ist. Somit ist die Methode in dieser Arbeit vorge stellt eine Technik, bei der in vivo-Systemen extrapoliert sollte, weil die Zellen in Mikromasse auf einer oberen Oberflächenmaterial ausgesät wird, und nach dem entspreInkubationszeiten aß, wird 60% der ursprünglichen Zellmasse eingehalten werden. Außerdem erfordert diese Technik keine Zugabe von osteoblastischen Induktoren (zB Dexamethason, Ascorbinsäure, oder beta-Glycerophosphat) oder Ultraschallreize osteoblastischen Differenzierung und Erhaltung des Osteoblasten-Phänotyp zu induzieren, weil NKB eine osteokonduktive und osteoinduktive Gerüste 8, wobei das Verfahren für die Kultur von MSCs aus dem menschlichen Amnion (AM-hMSCs) an dem makroporösen Knochen Biomaterial in dieser Arbeit representsapossibility präsentiert, um Zellen in beschädigten Knochengewebe einzusetzen und die Differenzierung zur Osteoblastlinie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>sterile phosphate buffered saline</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10010023</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10378016</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>26140111</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11965118</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type II</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>17101015</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mM calcium chloride</td>
			<td>SIGMA_ALDRICH</td>
			<td>C5670</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/0.5mM EDTA solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>R001100</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC- CD90,</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD34</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD45</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD105</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BD FACSCalibur</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue (AB)</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUNRISE-reader</td>
			<td>TECAN, Germany</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human mesenchymal stem cells and their cultivation on the porous bone matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Humane mesenchymale Stammzellen Isolation Nach der mechanischen Trennung der Uhr aus dem Chorion mit stumpf (Abbildung 1) wurde ein Anhänger Zellpopulation durch Trypsin und Collagenase II Verdauung erhalten. Diese Zellpopulationen in der Kulturschale presenta fibroblastenartige Zellmorphologie nach 3 Tagen nach der Isolierung befestigt ist, wie in der optischen Mikrographie (2A) und die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (2B) .Die Plazenten in dieser Arbeit verwendeten dargestellt wurden aus gesunden Spender erhalten Mütter withprevious informierte Zustimmung. Zellcharakterisierung mittels Durchflusszytometrie Die Zellpopulation, die von der Uhr erhaltene war fest an die Oberfläche mesenchymalen Marker CD90 + (93,5% ± 6,85) und CD73 + und CD105 + (79% ± 3,46) reaktiv und zeigte eine negative Reaktion auf hämatopoetischen Marker wie CD34 und CD45. SomitDie AM-hMSCs in dieser Arbeit verwendet wurden mesenchymalen, in der Accor Informationen zuvor von Leyva et al. (Abbildung 3) ausgewiesen. Zusätzlich diese Resultat deckt sich mit den Immunphänotyp Eigenschaften, die von der International Society for Cellular Therapy (ISCT) für mesenchymale Stammzellen etabliert wurden. Die Zelladhäsion an Knochenmatrix Die Scan-Aufnahmen zeigen das Verhalten der AM-hMSCs sieben Tage nach der Schichtung auf dem NKB. Die Oberfläche des Biomaterials mit sphärischen Zellen (Tag) und einige Streuzellen anscheinend mit der Rindermatrixoberfläche am siebenten Tag verknüpft sind. Bei höherer Vergrößerung erschienen die Verbreitung Zellen, in engem Kontakt über filipodial Prozesse (FL) (Abbildung 4) sein. Die Zellproliferation auf Knochenmatrix Die Ergebnisse der AB-Assay zeigte eine geringe Abnahme der relativen Extinktion u<html> Nissen (RAU) von Rinder-Matrix erhalten (+ Knochenmatrix) nach dem 1. Tag der Inkubation und dann am fünften Tag, das Vorhandensein des Gerüstes induziert eine Erhöhung der Zellproliferation im Vergleich mit der Kultur in der Abwesenheit von Rindergeführt statistisch signifikante Matrix (-bone Matrix) (Figur 5). Koloniebildende Einheit Die CFU-Assay ist ein traditionell von Stammzellen. Die AM-hMSCs isoliert in dieser Arbeit erhaltenen seine Fähigkeit, diskrete Kolonien nach 14 Tagen in Kultur bilden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Isolierung von Amnionmembran. (A) Die Nabelschnur (UC) ist mit einer Hand gehalten, um die Region, in der die Amnionmembran erhält identifizieren. (B) Die Amnionmembran (AM) ähnelt einem durchscheinenden Film ohne Blut Innervationen. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig2highres.jpg" /> Fig. 2: Morphologische Eigenschaften von Stammzellen aus dem menschlichen Amnion AM-hMSC Kulturen nach 3 Tagen nach der Trennung wurden mit einem optischen Mikroskop untersucht und gezeigt, die Fibroblasten-ähnliche Morphologie aufweist. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig3highres.jpg" /> Abb. 3: Die Durchflusszytometrie Charakterisierung der Zellen aus menschlichen Amnionmembran waren meist mesenchymalen Zellen, weil sie positiv für mesenchymalen Marker (CD73, CD90, CD105) waren, wie durch die Verschiebung des Histogramms auf der rechten Seite gezeigt, und negativ für hämatopoetischen Marker (CD34 und CD45), wie durch die Verschiebung des Histogramms links bestätigt. Die Antigene werden in rote Histogramme gezeigt, während die Steuer isotypesfor den PE und FITC Fluorochrome sind im beobachtetenschwarz. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig4highres.jpg" /> Fig. 4:. Zelladhäsion auf Rinderknochenmatrix Eine Reihe von REM-Aufnahmen, die die Befestigung der Zellen an Poren des Biomaterials (A) Panoramasicht eines NKB Poren mit mehreren Zellen, um das Biomaterial in der sphärischen Zustand (CS) geklebt und abgeflacht (CF) auf der Oberfläche des Biomaterials ist auch möglich, die Knochenlücke bezeichnet als (Lac) an drei Tag der Kultur auf dem Rinder-Matrix schätzen. (B) Die Amplifikation der Zelle in dem Prozess der Anpassung an der Oberfläche das Material durch filipodial Projektionen (C) Die Interaktion zwischen zwei Zellen eingehalten und auf der Rindermatrix abgeflacht (C1, Zelle 1 und C2, Zelle 2).. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51999/51999fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um v</a>IEW eine größere Version dieser Figur. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig5highres.jpg" /> Abb. 5: Die Proliferation von Zellen auf Rinder-Knochenmatrix Zellproliferation wurde durch AB Reduzierung ausgewertet und in relativen Absorptionseinheit an 7 Tagen nach der Kultivierung. Ergebnisse sind dargestellt der Einfluss von Knochenmatrix (+ Knochenmatrix) in AM-hMSCs Proliferation, die im Vergleich mit der negativen Bedingung (-bone Matrix) statisch war anders. (* P &lt;0,05) <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: CFU-Assay von MSCs zunächst mit unterschiedlicher Dichte plattiert und für 14 Tage inkubiert (Mittelwert * / - SD, n = 10). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Zellen eingehalten </td><td> Zelladhäsion (%) </td></tr><tr><td> Zellen auf dem Boden </td><td> 187.667 ± 1208 </td><td> 62,47 </td></tr><tr><td> Zellen auf dem Gerüst </td><td> 312.333 ± 1208 </td><td> 37,53 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Effizienz der Haftung auf Rindermatrix Die an der Unterseite der Plattenteller und die Zellen auf dem Gerüst haften adhärierten Zellen wurden mittels eines Hämocytometers nachdem sie durch trypsinization.The Daten in der Tabelle dargestellt gewonnen gezählt entsprechen zwei Experiment dreifach unabhängig ± Standardabweichung

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

27.4K Aufrufe.  Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Serie: Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

Vorbereitung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark Mesenchymale Stammzellen für potentielle Zytoplasma-Ersatztherapie

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...