This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. Hücre Kültürü <ol><li> Ters transkriptaz (hTERT) ölümsüzleştirdi retina pigment epitel hücreleri, insan telomeraz kullanın (hTERT-RPE1; RPE1 burada anılacaktır). Not: RPE1 hücrelerde bu centriole montaj ve ciliogenesis incelemek için kullanılır yakın-diploid, dönüştürülmemiş insan hücreleridir. Bu hücreler düzenlenmiş hücre döngüsü ile koordineli normal centriole çoğaltılması döngüsünü izleyin. </li><li> Geçiş 1 ile RPE1 hücrelerinin yakın bir birleşik, 100 mm&#39;lik bir hücre kültürü çanağı: 10 ml ihtiva eden bir taze 100 mm tabak için orijinal kültür 5 seyreltme DME / F-12 (1: 1) ortamı,% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş (FBS), 100 U / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin (tam bir ortam, DME / F-12 ortamı olarak adlandırılır). % 5 CO2 varlığında 37 ° C&#39;de hücreler büyür. <ol><li> Bir su banyosu veya inkübatör içinde 60 ° C&#39;de, çalkalanarak olmadan kapalı bir cam beher O / N HC1 50 ml 12 mm yuvarlak cam lamelleri inkübe edin. </li><li> Afasit çözeltisi atılması ter arada çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilerek lamelleri damıtılmış su, 100 ml, üç kez yıkayın. % 70 Etanol ve% 95 etanol ile benzer şekilde yıkama tekrarlayın. </li><li> Ayrı ayrı 60 dakika UV radyasyonu ile sterilizasyon ardından biyogüvenlik kabini içinde bir laboratuvar kurutma kağıdı, onları dışarı yayarak lamelleri kurulayın. </li></ol></li><li> Bir 35 mm hücre kültür çanağı 2-4 kuru lamelleri yerleştirin. Hücre kültürü, PBS içinde 25 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar işlenmiş polimerin (1 mg / ml stok konsantrasyonu) gibi fibronektin çözeltisi ya da fibronektin ile seyreltilir. <ol><li> Her lamel üzerine seyreltilmiş çözeltinin 80-100 ul yerleştirin ve kaplamak için 60 dakika lamel üst tarafı için kuluçkaya yatmaktadır. Tam orta eklemeden önce PBS ile üç kez lamelleri yıkayın. </li></ol></li></ol> 2. Büyüyen Hücreler ve Proteazom inhibitörleri ile tedavi Hücreler <ol><li> Passage 2 x 10 5 asenkron olarak büyümekHer 35 mm çanak ing RPE1 hücreleri lamelleri içeren ve 2 ml tam orta hücreleri büyür. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile her 24 saatte değiştirin. <ol><li> Test protein centrosomal düzeyde proteazom inhibisyonunun etkisini analiz etmek (burada VDAC3 veya γ-tubulin), 44 saat için iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek. Komple ortam ile kültür ortamı yerine sırasıyla 5 uM veya% 0.05&#39;lik bir nihai konsantrasyonda kontrol çözücü olarak MG115 veya DMSO ya da eklemek. Aynı zamanda, 4 saat süre ile hücreler 40 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyonda, hücrelere BrdU ekleme ve inkübe edilir. </li><li> 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel aktarın. Her bir oyuğa 500 ul soğutulmuş metanol eklenir ve 10 dakika lamelleri hücreleri düzeltmek için, -20 ° C &#39;de plaka inkübe edin. Hemen lamelleri 500 ul yıkama tamponu ile üç kez yıkayın (0.5 mM MgCI2 ve% 0.05 ihtiva eden 1x PBS, Triton-X-100). </li></ol></li><li> Artık Hasat35 mm tabak ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de hücrelerinden hücre. Western blotting (aşama 6), total protein analiz üzere hücre pelleti kullanın. </li></ol> 3. BrdU Darbe ve Chase Testi Farklı Hücre Döngüsü Evreleri Protein Düzeylerinin Analiz <ol><li> 44 saat lamelleri içeren iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek, hücre döngüsünün farklı aşamalarında sentrozomlarla bir proteinin (burada VDAC3, Sas6 veya Cep135) seviyesi değişimini analiz etmek. 40 uM BrdU içeren tam ortam maddesi ile kültür ortamı yerine ve hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 4 saat kuluçkalayın. </li><li> Bir tabak, Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi soğutulmuş metanol kullanılarak hücreleri gidermek için bir 24 oyuklu plaka lamelleri aktarın. </li><li> 4 saat BrdU puls sonrasında BrdU-içeren ortam maddesinin ayrılması bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve tam ortam maddesi ile bir kez çeşitli zamanlarda (tipik olarak bir 4 saat boyunca BrdU yokluğunda hücreleri taze ortam ilave ve daha sonra büyüyecekAdım 2.1.2 de açıklandığı gibi hücrelerin sabitleme önce RPE1 hücreleri) için. Not: RPE1 hücreleri için, BrdU-pozitif hücrelerin çoğu, bir 4 saat Chase sonra geç S ya da G2 faz içindedir. Bu, her bir hücre tipi için ayrı ayrı belirlenmelidir. </li></ol> 4. immün <ol><li> 30 dakika boyunca (1 x PBS içinde% 2 BSA ve% 0.1 Triton X-100), bloke edici tampon 200 ul lamelleri ile sabitleştirilmiş hücreler inkübe edin. <ol><li> Birincil antikor karışımı ile inkübe hücreleri nemlendirilmiş bir bölmede 4 ° C&#39;de tampon O / N engelleme seyreltilmiş (tipik olarak bir tavşan içinde yetiştirilmiş ve bir fare arttırılmış). </li><li> Nemlendirilmiş bir odasını yapmak için, boş bir 1.000 ul pipet kutusunun alt yarısında ıslak kağıt havlu koymak. Raf yüzeyinde Parafilm bir şerit yatıyordu, ve inkübe her lamel için Parafilm üzerine antikor çözümün bir damlacık (15-20 ul) nokta. Antikor çözeltisi bir damlacık üzerine bir lamel haricindekileri (hücre dalmış böylece) ve yakınucu kutusunun kapağı. </li><li> Yine lamelleri ters çevirin ve 24 kuyu çanak onları geri dönün. Lamelleri yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca (yeşil flüoresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan ve kırmızı flüoresan boya konjuge edilmiş anti-fare, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş burada) 150 ul ikinci antikor karışımı içinde inkübe. Lamelleri üç kez yıkayın. NOT: florofor-konjuge İkincil antikorlar duyarlı hafif. Adım sırasında ışıktan koruyunuz örnekleri 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi, 10 dakika boyunca -20 ° C &#39;de 500 ul soğutulmuş metanol ile tekrar boyanmış RPE1 hücrelerin tespit anti-BrdU boyama için hazırlayın. Üç kez lamelleri yıkayın. Not: Bu tespit, takip eden basamakta asit hidroliz işlemi sırasında ilgili protein (ler), primer ve sekonder antikor etiketleme korur. <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 N HCI, 200 ul hücreleri inkübe edin. 1 M Tris-Cl, 300 ul, pH 8, ile nötralizehücreleri yıkama tamponu kullanarak üç kez yıkayın d. </li><li> Tekrar, oda sıcaklığında 30 dakika blokaj tamponunda 200 ul kullanarak hücreleri bloke eder. </li><li> Nemli bir bölmede 37 ° C &#39;de 45 dakika boyunca (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) sıçan anti-BrdU antikoru ile inkübe hücreleri. 24 oyuklu tabağa geri lamelleri Dönüş yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 24-çukurlu tabak bloklama tamponu 150 ul seyreltilmiş mavi floresan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikoru (kuluçkalayın. </li></ol></li><li> Lamelleri üç kez yıkayın. Bir cam mikroskop lamı üzerine antifade reaktif içeren bir montaj çözümün bir damlacık (kabaca 3-6 ul) Nokta. Hücre tarafı montaj çözümü üzerine, aşağı bakacak şekilde, bir lamel haricindekileri. Yavaşça yumuşak doku temizleme kullanarak slayt karşı lamel basarak fazla sıvıyı silin. Mikroskop lamı üzerine mühür lamel kenarında şeffaf oje sürün. </li></ol> 5. Immünofloresan Görüntü EdinimEdinim ve Analizi <ol><li> Ortam sıcaklığında BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinin görüntüler elde etmek için (1.4 sayısal diyafram ile) 100X Planı Apo immersiyon yağı hedefi kullanın. <ol><li> Dijital görüntüleme yapabilen bir kamera ile mikroskop ekli (donanım bakınız) bir slayt koyun. Her fluorofor için, manuel bir deney tüm örnekleri inceleyerek (tipik 300-1,000 msn arasında) uygun pozlama süresini belirler. Bir hücrenin görüntüleri almadan önce, elle Z-ekseni (genellikle 0.2 mikron adım boyutu) boyunca uygun üst ve alt odak düzlemi belirler. Bir dijital mikroskopi görüntüleme yazılımı paketi kullanarak Z-ekseni boyunca farklı floroforlar için aynı pozlama süresi ile ayrı lamelleri farklı örneklerin görüntüleri edinin. </li></ol></li><li> Z-ekseni boyunca elde edilen tüm resim yığınlarının (Yok komşu algoritması kullanarak bu durumlarda) dekonvulasyon gerçekleştirin. <ol><li> Boyunca her görüntü yığını toplam yoğunluk projeksiyonu eldeZ-ekseni. </li></ol></li><li> Sentrozomlar (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe en az 2 mikron) yakın hücrelerde, hem sentrozomlarla etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 20-30 piksel) çizmek ve seçilen alanı işaretleyin. <ol><li> İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına tipik 24-35 piksel) çizin ve büyük kare seçili alanı işaretleyin. </li><li> Alan (A) ve her kutuya her floroforun toplam floresan yoğunluğu (F) elde (S küçük kutu gösterir ve L büyük kutu gösterir). </li><li> . Howell ve ark 29 tarafından açıklanan formülü kullanarak her floroforun arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğu analiz: F = F S - [(F L - F S) S / (A L - A S) x]. </li><li> Bunu fl artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgi (burada VDAC3 veya Sas6) proteinin normalize edilmiş floresan yoğunluğu elde edilir(Burada γ-tubulin, Sas6 veya Cep135) seçilen iç standart için kullanılan floroforun buna uorophore. </li></ol></li><li> Sentrozomlar iyi ayrılmış nerede hücreleri analiz durumunda, kutuların iki ayrı set çizerek ayrı ayrı centrosome analiz (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe büyük 2 um daha). Her centrosome etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 15-25 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin. İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına 20-30 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin. <ol><li> Alanı (A) ve her kutuya her fluorofor toplam floresan yoğunluğu (F) elde edilir, ve adım 5.3.3 tarif edildiği gibi, her bir sentrozom için ayrı ayrı her bir fluorofor arka düzeltilmiş floresan yoğunlukları hesaplamak. </li><li> Bu hücredeki bu proteinin toplam centrosomal seviyesi elde etmek için, iki sentrozom her proteinin arka plan düzeltilmiş floresan şiddetleri birleştirin. </li><li> Elde etmekİç standart toplam centrosomal yoğunluğu toplam centrosomal yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgili proteine ​​normalize şiddeti. </li></ol></li><li> Her deneysel koşul için en az 15-25 hücreleri analiz ve bir tablo grafiği çizmek. </li></ol> 6. Western Blot kullanma Toplam Protein Analizi <ol><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl,% 1 Nonidet P-40,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren (RIPA) tamponu radyoimmünopresipitasyon deneyinde hücreler yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe hücreleri lize etmek için. <ol><li> 10 dakika için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin Karışımı topak fraksiyonundan lizat ayrılması ve bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kiti kullanılarak her bir lizattan toplam protein konsantrasyonunun ölçülmesi. </li></ol></li><li> 4x SDS-PAGE yükleme tamponu (50 mM Tris-Cl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol, 100 mM ditiyotireitol,% 0.1 Brom ile lizat 40 ug karıştırın) Mavi ophenol. <ol><li> 10 dakika boyunca numune kaynatılır ve 200 V sabit gerilimde, SDS-PAGE, denatüre edici bir% 12.5 ile örnekleri çalıştırmak </li></ol></li><li> (Soğukta 1 saat süre ile 90 V sabit gerilim) Western lekeleme tekniği kullanılarak bir nitroselüloz zar üzerine, SDS-PAGE üzerinde ayrılmış proteinler aktarın. <ol><li> 1x PBS içinde% 3 yağsız süt ile bloke membran ve daha sonra 1 için (bu durumda, tavşan anti-VDAC3, tavşan anti-γ-tübülin ve fare anti-α-tübülin bağında absorbe edilmemesi) ile seyreltildi birincil antikor çözeltileri ile membran inkübe oda sıcaklığında bir saat. </li><li> Membrana PBS-T tamponu kullanılarak üç kez (çalkalama altında, her 5 dakika inkübasyon) yıkandıktan sonra (1x PBS ve% 0.2 Tween-20), yakın kızılötesi (IR), floresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan oluşan bir karışım içinde membran inkübe ve 1 saat boyunca (PBS-T içinde seyreltilmiş) IR florasan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikorlar. </li><li> Membranı üç kez yıkayın ve sonra kızılötesi f kullanarak bantları analiz membran taramaimmünoblot tespiti için uygun luorescence görüntüleme sistemi olmaktadır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body.">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li><li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+centriole.">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li><li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle.">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li><li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry.">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li><li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1:+defensible+or+dispensable.">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9 (2011).</li><li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components.">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976 (2009).</li><li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling.">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li><li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP+proteins:+the+knights+of+centrosome+dynasty.">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase.">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li><li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods.">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li><li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways.">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li><li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome.">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li><li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes.">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li><li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation.">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li><li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle.">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li><li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells.">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li><li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes.">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li><li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication.">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li><li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program.">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li><li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells.">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287 (2002).</li><li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A.">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291 (2011).</li><li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes.">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li><li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels.">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li><li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened:+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process.">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li><li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis.">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li><li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores,+along+spindle+fibers,+and+at+spindle+poles+in+living+cells.">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li><li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hücre biyolojisinde Kantitatif mikroskopi yaygın sabit farklı nicel mikroskopi deneyleri gelişmekte hücre biyologları artan örnekler vardır, vb Ancak, (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra böyle Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), Floresan Kurtarma gibi canlı hücre görüntüleme deneyleri ile ilişkilidir Son yıllarda 27,34-36 hücreler. Önemlisi, sentrozom biyoloji anlamada ilerleme genellikle centrosomal havuzları diğer havuzlar daha farklı düzenlenebilir proteinlerin cen...

Sentrozom pericentriolar malzeme (PCM) &#39;çevrili Sentriyoller bir çift oluşur. Memeli hücrelerinde büyük mikrotübül organize merkezleri (MTOCs) olmak, sentrozomlar bölünen hücrelerde mitotik iğ iki kutup olarak hizmet, ve böylece genomik bütünlüğünü 1 korumamıza yardımcı olur. (G0 aşamasında örneğin) hareketsiz hücrelerde, sentrozom, yani ana sentriolden iki Sentriyoller biri, primer kirpik, hücre yüzeyi 2 dışarı doğru çıkıntı yapan bir duyusal organel birleştirmek için bir taban gövdesi içine transforme edilir. Hücreler bir kez hücre döngüsü yeniden girmek primer kirpikler parçalarına ve her centriole yavaş yavaş olgun centriole 3 oluşturmak üzere uzar proksimal ucunda bir procentriole montajını yönlendirmektedir. S-fazı başlangıcında, sentriolden 9-katlı bir simetriye sağlayan bir çember benzeri bir yapı olan her sentriolden yüzeyi üzerinde oluşturulmuş olan ve her procentriole baz olacaktır. Sas6 tcentriole montaj cartwheel 4-6 hub oluşturmak için işe edilir için şapka vazgeçilmezdir. Diğer centriolar proteinler daha sonra uzak bir şekilde 7 derece düzenlenir, proksimal tekerin üzerine monte edilir. Tam centriole tekrarını tamamladıktan sonra, hücreler G2 fazı 8 yılı sonunda iki fonksiyonel sentrozomlar inşa ek pericentriolar malzemeleri bir araya getirin. Çekirdek centriolar bileşenler 9-11, kinaz, fosfataz, şaperonlar, iskele elemanları, zara bağlı proteinler ve bozunma makineler dahil olmak üzere birçok başka protein ek olarak hücre döngüsü 12-16 farklı zamanlarda Sentriyoller bazal gövde ve PCM ile ilişkilidir. Genellikle, bir çok proteinin centrosomal seviyeleri geçici olarak centrosomal hedefleme mekanizmalarının ve / veya sentrozom de proteozomal bozulması düzenlenir belirtilmelidir. Önemli bir şekilde, Plk4, Mps1, Sas6 ve CP110 a gibi çeşitli proteinlerin centrosomal düzeyinde dalgalanmalarhücre döngüsünün t farklı noktaları centriole düzeneğinin 5,17-22 düzenleyen önemli olduğu görülmektedir, ve bu centrosomal bozulması önlenir Mps1 durumunda fazla Sentriyoller 19 oluşumuna yol açar. Öte yandan, çeşitli proteinlerin centrosomal fraksiyonlar sitosolik havuzları ile karşılaştırıldığında daha az dayanıksız. Örneğin aşağı doğru düzenlenmesi fotoseli 2 (Cetn2) siRNA aracılı olan bütün hücre seviyeleri 23 büyük azalmaya rağmen Sentriyoller protein düzeyinde yalnızca orta derecede bir azalma sağladı. Oldukça onların centrosome özel fonksiyonları değerlendirilirken tüm hücre protein seviyelerini ölçmek daha centrosome de centrosomal proteinlerin düzeyindeki değişiklikleri ölçmek için bu nedenle çok önemlidir. Bu çalışmada, sentrozom bir proteinin nispi seviyesini ölçmek için dolaylı immünoflüoresans (IIF) kullanan bir analiz geliştirdik. Bu deney, çeşitli örneklerden olan hücreleri analiz etmek için özellikle geliştirilmiştirve bu nedenle, aynı zamanda görüntülü edilemez. Numuneler farklı zaman noktalarında toplandı farklı reaktifler (örneğin, ilaç kontrole karşı) ile muamele edilmiş olan hücreler olabilir (yani, Chase karşı darbe), ya da hücre döngüsünün farklı aşamalarında bulunmaktadır. Bu deneyde ilkesi arka düzeltilmiş floresan yoğunluğu küçük bir bölgede bir proteine ​​karşılık gelen ve, seviyeleri seçilen deney koşulları altında değişmeyen bir başka protein aynı karşı değer normalleştirmek için ölçüm yatmaktadır. Centrosome biyoloji çeşitli çalışmalar son zamanlarda aday proteinlerin 24-27 arasında centrosome özgü fonksiyonunu belirlemek için, hem canlı ya da sabit hücrelerde çeşitli kantitatif mikroskopi teknikleri, kullanılan var. Bu deneylere benzer şekilde, bu teknik, aynı zamanda test proteinin arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk ölçer. Bununla birlikte, bu tahlilde, bir dahili standart olarak normalleştirme dahil büyük ihtimalle daha teklifdoğruluk ve iki farklı lamelleri üzerinde iki farklı örnekleri analiz güven. Ayrıca, sentrozom protein seviyesinin incelenmesine ek olarak, küçük ayarlamalar ile bu yöntem, deney şartlarının farklı ayarlamak için ya da diğer hücresel sitlerde uygulanabilir. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarında hücreleri karşılaştırmak için BrdU darbe-kovalamaca stratejisi ile kantitatif mikroskopi tahlil birleştirir. Bunun yerine, hücre döngüsünün farklı zaman noktalarında çalışma zaman uyumsuz büyüyen hücreler standart hücre döngüsü tutuklama ve serbest bırakma teknikleri kullanılarak S-fazında hücreleri etiketlemek için BrdU ile inkübe edilir, ve etiketlenmiş hücreler, çeşitli zamanlarda (tipik olarak 4-6 saat) boyunca takip edilir. Etiketli hücrelerin çoğu hemen darbesinden sonra S-faz olacaktır. Chase sonra işaretli hücrelerin morfolojik özellikleri nuc göre sentrozom gibi maddelerle pozisyonu tarafından kontrol edilebilir geç S, G2 veya mitoz içinde olacak şekilde Chase uzunluğu seçilirLei, sentrozom arasındaki mesafe, vb kromozom kondansasyon Böylece, kovalama uzunluk S, G2 ve belirli bir hücre tipinin M fazında ortalama süresine bağlıdır. Bu yaklaşım, vb hidroksiüre, afidikolin, nokodazol, hücre döngüsü inhibitörleri önler olduğundan, fizyolojik olarak daha uygun hücre döngüsü analizi sağlar. Bu yüzden, tek başına nicel floresan mikroskobu deneyi veya BrdU Darbe kovalayıcı tahlilinde ile kombinasyon halinde, doğru bir soğukkanlı hücre döngüsü sırasında aday protein centrosomal seviyesinde göreli değişiklikleri ölçmek için basit ama etkili bir yöntem olduğu burada ortaya koymaktadır. Biz, bu deneyler kullanılarak, VDAC3, son zamanlarda 16,28 mitokondri ek olarak sentrozom de tanımlanan bir protein centrosomal düzeyleri ölçüldü. Burada elde edilen sonuçlar VDAC3 arasında centrosomal havuz bozulması ile düzenlenir bizim daha önceki bir gözlem doğrulamak, ve aynı zamanda bir hücre döngüsü bağımlı hazırlık değişirt şekilde 16, ayrıca bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrulanması.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Name&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Catalog number</td>
			<td style="width:195px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">F8141</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">DMSO</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">D2650</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">MG115</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">SCP0005</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">BrdU</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">B5002</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T 6557</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aviva Systems Biology</td>
			<td style="width:99px;">ARP35180-P050</td>
			<td style="width:195px;">1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Santa cruz biotechnology</td>
			<td style="width:99px;">sc-81431</td>
			<td style="width:195px;">1:100 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab-75005</td>
			<td style="width:195px;">1:500 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-BrdU (rat monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab6326</td>
			<td style="width:195px;">1:250 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21093</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21202</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21203</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21206</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21207</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T5192</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T9026</td>
			<td style="width:195px;">1:20000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A10043</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Mouse IgG (H&#38;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td>
			<td style="width:105px;">Rockland antibodies</td>
			<td style="width:99px;">610-731-002</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">SlowFade Gold Antifade Reagent&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">S36936</td>
			<td style="width:195px;">Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Round coverslips 12CIR.-1</td>
			<td style="width:105px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:99px;">12-545-80</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Olympus IX-81 microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td>
			<td style="width:105px;">QImaging&#160;</td>
			<td style="width:99px;">32-0082B-238</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">100X Plan Apo oil immersion objective</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;">1.4 numerical aperture</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Slidebook software package</td>
			<td style="width:105px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Odyssey IR Imaging System</td>
			<td style="width:105px;">Li-cor Biosciences</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Bicinchoninic acid (BCA) assay</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow UV cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M622</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Blue cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M643</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Green cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M663</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

Sentrozomlar genomik bütünlüğünü korumak veya hücrelerde duyusal işlevleri kolaylaştırmak için birincil kirpikler araya mitotik iğ direkleri olarak hizmet küçük ama önemli organellerdir. Bir protein seviyesi, diğer .cellular konumlarda daha sentrozom daha farklı düzenlenmiş olabilir, ve hücre döngüsünün farklı noktalarda çeşitli proteinlerin centrosomal seviyesindeki değişimin sentriol düzeneğinin doğru düzenlenmesi için önemli olduğu görülmektedir. Bu tür hücre döngüsünün farklı aşamalarında veya farklı reaktifler ile muamele edildikten sonra çeşitli örneklerden sabit hücrelerde sentrozom bir protein seviyesinde nispi değişiklik ölçen bir sayısal floresan mikroskobu bir deney geliştirildi. Bu deneyde ilkesi küçük bir bölgede bir proteine ​​karşılık gelen arka düzeltilmiş floresan yoğunluğunun ölçülmesi yer alır ve seçilen deney c değişiklik olmayan başka bir protein için aynı karşı ölçüm normalizeondition. BrdU nabız ve soğukkanlı hücre döngüleri incelemek için takip stratejisi ile birlikte bu testte kullanarak, kantitatif özellikle sentrozomlarla de proteazom aracılı bozulması ile muhtemel VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir bizim son gözlem, valide var.

Bizim son çalışmalar VDAC3, mitokondriyal porinlerini 16,28 birinin yeni centrosomal lokalizasyonu ve fonksiyonu tespit. Bir VDAC3 özel bir antikor kullanılarak RPE1 hücreleri dahil olmak üzere birçok memeli hücrelerinin immün belirgin centrosomal boyama ve nispeten zayıf mitokondriyal boyanma gösterdi. Ayrıca centrosomal VDAC3 tercihen ana sentriolden ve endojen hem de centrosomal havuzu ile ilişkili ve ektopik VDAC3 bozulma 16 düzenlenir ifade olduğunu göstermiştir. Kantitatif I...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Görüntüleme.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

Video: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biyoloji

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...