This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. 세포 배양 <ol><li> 역전사 효소 (는 hTERT) 불후의 망막 색소 상피 세포 인간 텔로 머라 아제를 사용 (의 hTERT-RPE1하면, RPE1 여기 함). 주 : RPE1 세포 일반적 중심 소체 조립체와 ciliogenesis을 연구하는 데 사용되는 근거리 이배체 인간 형질 전환되지 않은 세포이다. 이 세포들은 규제 세포주기와 조정 정상적인 중심 소체 중복주기를 따르십시오. </li><li> 통로 1에서 RPE1 세포의 거의 합류 100mm 세포 배양 접시 : 10 ㎖를 함유하는 신선한 100mm 접시에 원래 배양 5 희석 DME / F-12 (1 : 1) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ml의 페니실린 G 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (전체 매체가 DME / F-12 매체로 함). 5 % CO 2 존재하에 37 ℃에서 세포를 성장한다. <ol><li> 물 목욕이나 인큐베이터에서 60 ° C에서 흔들림없이 덮여 유리 비커, O / N에서 1 N 염산 50ml에 12mm 라운드 커버 글라스를 품어. </li><li> AF산 용액을 폐기 터가 가끔 흔들어 15 분간 배양하여 커버 슬립을 증류수 100㎖를 세 번 씻는다. 70 % 에탄올 및 95 % 에탄올 중의 마찬가지로 세탁을 반복. </li><li> 개별적으로 60 분 동안 자외선으로 살균 다음에 생물 안전 캐비닛의 실험실 블로 팅 종이에 그들을 밖으로 확산으로 된 커버를 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 35mm 세포 배양 접시에 2-4 건조 된 커버를 놓습니다. 세포 배양 물에서 25 μg의 PBS / ㎖의 농도로 엔지니어링 중합체 (1 ㎎ / ㎖의 스톡 농도) 등 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 용액을 희석. <ol><li> 각 커버 슬립에 희석 된 용액의 80 ~ 100 μl를 놓고 코트에 60 분의 coverslip의 상단 동안 품어. 전체 매체를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 삼배 된 커버를 세척 할 것. </li></ol></li></ol> 2. 성장 세포와 프로 테아 좀 억제제 치료 세포 <ol><li> 항로 2 × 10 5 비동기 적으로 성장각 35mm 접시 ING RPE1 세포는 커버 슬립을 함유하는 2 ml의 완전 배지에서 세포를 성장한다. 배양액에게 신선한 미리 예열 완료 매체와 매 24 시간을 교체합니다. <ol><li> 시험 단백질의 수준에 centrosomal 테아 좀 억제의 효과를 분석하는 (여기 VDAC3 또는 튜 불린-γ)은 44 시간 동안 두 35mm 접시에서 세포를 성장한다. 완전 배지로 배지를 교체하고, 각각 5 μM 또는 0.05 %의 최종 농도 제어 MG115 또는 용매로서 DMSO를 추가한다. 동시에, 4 시간 동안 세포를 40 μM의 최종 농도로 세포를 BrdU의 추가 배양한다. </li><li> 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송합니다. 각 웰에 500 ㎕의 냉각 메탄올을 추가하고 10 분이 된 커버에 세포를 해결하기 위해 -20 ° C에서 접시를 품어. 즉시 된 커버 500 μL 세척 버퍼로 3 회 세척 (0.5 mM의의 MgCl 2와 0.05 %를 포함하는 1X PBS를 트리톤-X 100). </li></ol></li><li> 잔류를 수확35mm 접시 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에서 세포. 웨스턴 블롯 (단계 6)에 의해 전체 단백질을 분석하기 위해 세포 펠렛을 사용한다. </li></ol> 3. BrdU의 펄스 체이스 분석은 다른 세포주기 단계에서 단백질 수준을 분석하기 위해 <ol><li> 44 시간 동안 커버 슬립을 함유하는 두 개의 35mm 접시에서 세포 성장, 세포주기의 다른 단계에서의 중심체에서 단백질 (VDAC3 여기서, Sas6 또는 Cep135)의 레벨의 변화를 분석한다. 40 μm의 BrdU의를 포함하는 완전한 매체와 문화 매체를 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 한 접시에서, 단계 2.1.2에서 설명 된 바와 같이 냉각 된 메탄올을 사용하여 세포를 고정하는 24- 웰 플레이트로 커버 슬립을 전송. </li><li> 4 시간의 BrdU의 펄스 후, BrdU를 함유 배지를 제거 PBS로 한번 세포를 세척하고 완전 배지로 한번, 다양한 시간 (전형적으로 추가의 4 시간 동안의 BrdU의 부재 하에서 세포를 새로운 배지를 추가하고 성장할단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 고정하기 전에 RPE1 세포)에 대한. 주 : RPE1 전지, BrdU의 양성 세포의 대부분은 4 시간 후 체이스 늦은 S 또는 G2 상에있다. 이는 각각의 세포 유형에 대해 독립적으로 결정되어야한다. </li></ol> 4. 면역 염색 <ol><li> 30 분 동안 (1X PBS로 2 % BSA 및 0.1 % 트리톤-100)을 블로킹 완충액 200 μL의 고정 된 커버에 세포를 배양한다. <ol><li> 차 항체가 혼합 된 세포를 품어 가습 실에서 4 ° C에서 버퍼 O / N 차단에 희석 (일반적으로 한 토끼에서 제기하고 다른 마우스에서 제기). </li><li> 가습 실을하려면 빈 1,000 μL 피펫 팁 상자의 아래쪽에 젖은 종이 타월을 넣어. 랙 파라 필름의 표면 상에 스트립을 마련하고, 배양 될 각 커버 슬립에 대해 파라 필름 상에 항체 용액의 액적 (15 ~ 20 μL)을 더럽힐. 항체 용액의 방울에 커버 슬립을 반전 (세포 몰입되도록) 및 close팁 상자의 뚜껑. </li><li> 다시 된 커버 전환하고, 24 웰 접시에 그들을 다시 돌아갑니다. 된 커버를 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 (녹색 형광 염료 복합 항 - 토끼와 붉은 형광 염료 복합 항 - 마우스가 버퍼를 차단에 희석 여기) 150 μL 차 항체 혼합물에서 그들을 품어. 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 참고 : 형광 접합 차 항체 광 감응성. 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이, 10 분 동안 -20 ℃에서 500 ㎕의 냉각 된 메탄올로 다시 염색 RPE1 세포를 고정함으로써 방지 BrdU의 염색을 위해 준비한다. 세 번 된 커버를 세척 할 것. 주 :이 고정은 다음의 단계에서 산 가수 분해 과정에서 관심 단백질 (들)의 일차 및 이차 항체 표지를 고정. <ol><li> RT에서 30 분 동안 2 N 염산 200 μL에서 세포를 배양한다. 1 M 트리스 (CL)의 300 μL, pH를 8로 중화세포를 세척 완충제로 3 회 세척 좋아. </li><li> 다시 RT에서 30 분 동안 블로킹 완충액 200 μL를 사용하여 세포를 차단. </li><li> 가습 챔버 내에서 37 ° C에서 45 분 동안 (블로킹 완충액에 희석) 래트 항 BrdU의 항체로 세포를 배양한다. , 24 웰 접시에 다시 된 커버를 돌려 그들을 씻어 준 후 실온에서 1 시간 동안 24 잘 접시에 버퍼를 차단 150 μL에 희석 블루 형광 염료 복합 항 쥐 이차 항체 (에 품어. </li></ol></li><li> 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 유리 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 함유하는 용액의 장착 방울 (약 3-6 μL)를 스팟. 셀 측이 장착 솔루션에, 아래로 향하게하여, 커버 슬립을 반전. 부드럽게 부드러운 세정 티슈를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 눌러 물기를 닦아주십시오. 현미경 슬라이드에 그것을 밀봉 커버 슬립의 가장자리를 따라 투명 매니큐어를 적용합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 이미지 Acquisition 및 분석 <ol><li> 상온에서의 BrdU 양성 RPE1 세포의 이미지를 획득 (1.4 개구 수) 100X 계획 아포 오일 침지 목표를 사용합니다. <ol><li> 디지털 이미징 할 수있는 카메라에 부착 된 현미경 (장비 참조)에 슬라이드를 넣습니다. 각각의 형광의 경우, 수동으로 실험의 모든 샘플을 검사하여 (일반적으로 300 - 1,000 밀리 초 사이) 적절한 노출 시간을 결정합니다. 셀의 이미지를 획득하기 전에 수동으로 Z 축 (일반적으로 0.2 μm의 스텝 크기)에 따라 적절한 상단과 하단에 초점면을 결정합니다. 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 이용하여 Z 축을 따라 서로 다른 형광 물질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 분리 된 커버에 서로 다른 샘플의 이미지를 수집. </li></ol></li><li> Z 축을 따라 취득한 모든 화상 스택 (아니오 이웃 알고리즘을 사용하지 않고 이러한 경우) 디콘 볼 루션을 수행한다. <ol><li> 따라서 각 이미지 스택의 총 강도 투영을 구하는Z 축. </li></ol></li><li> 중심체가 (두 중심체 사이의 거리가 2㎛ 미만이다) 가까이있는 세포에서 두 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 20 ~ 30 픽셀)를 그리는 선택 영역을 표시합니다. <ol><li> 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 일반적으로 24 ~ 35 픽셀)를 그려 큰 사각형의 선택 영역을 표시합니다. </li><li> 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)을 얻었다 (S 작은 박스를 나타내고, L은 큰 상자를 나타낸다). </li><li> . 하웰 등 (29)에 의해 설명 된 공식을 사용하여 각 형광의 배경 보정 형광 강도를 분석 : F = F S - [(F의 L - F S)는 S / (A L를 - S) ×]. </li><li> 그 FL의 배경 보정 형광 강도의 비를 계산함으로써 관심 (여기 VDAC3 또는 Sas6)의 단백질의 정규화 형광 강도를 구하는(여기에 γ-tubulin에, Sas6 또는 Cep135) 선택 내부 표준에 사용되는 형광의 그것과 uorophore. </li></ol></li><li> 중심체가 잘 분리되는 경우 세포 분석의 경우, 두 개의 분리 된 박스의 도면 세트를 각각 별도로 분석 중심체 (두 중심체 사이의 거리가 큰, 2㎛ 이상이다). 각 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 15 ~ 25 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 20 ~ 30 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. <ol><li> 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)를 얻어, 단계 5.3.3에서 설명 된 바와 같이, 각각의 중심체 별도로, 각 형광 물질의 배경 형광 농도 보정을 계산한다. </li><li> 그 셀에서 해당 단백질의 총 centrosomal 레벨을 얻기 위해 두 중심체에서 각 단백질의 배경 형광 농도 보정 수확기. </li><li> 취득내부 표준 물질의 총 centrosomal 강도 총 centrosomal 강도의 비율을 계산하여 관심 단백질 정규화 강도. </li></ol></li><li> 각 실험 조건에 대해 적어도 15-25 세포를 분석하여 스프레드 시트의 그래프를 플롯. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅을 사용하여 총 단백질 분석 <ol><li> 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 % Nonidet P-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함하는 (RIPA) 버퍼 radioimmunoprecipitation 분석에서 세포를 재현 탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션 용균. <ol><li> 10 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하여 펠릿 분획으로부터 해물을 분리 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 키트를 사용하여 각 분해물의 총 단백질 농도를 측정한다. </li></ol></li><li> 4X SDS-PAGE 로딩 완충액 (50 mM Tris-CL, pH가 6.8, 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 디티 오 트레이 톨, 0.1 % 브롬으로 40 μg의 해물 믹스) 블루 ophenol. <ol><li> 10 분 동안 샘플을 비등 200 V.의 정전압으로 SDS-PAGE 변성 12.5 %의 샘플을 실행할 </li></ol></li><li> (냉간에서 1 시간 90 V의 정전압) 웨스턴 블로 팅 기법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 상으로 SDS-PAGE상에서 분리 된 단백질을 전송. <ol><li> 1X PBS에서 3 % 무 지방 우유 멤브레인을 차단 한 다음 1 (이 경우 토끼 방지 VDAC3, 토끼 반 γ-tubulin에와 마우스 항-α-tubulin의)에 희석 차 항체의 솔루션을 막을 배양 실온에서 시간. </li><li> 멤브레인을 PBS-T 완충액 3 회 (진탕 각 5 분 인큐베이션) 세척 한 후 (1X PBS 및 0.2 %의 트윈 -20), 근적외선 (IR​​) 형광 염료 공액 항 - 토끼의 혼합물에 막을 부화 1 시간 동안 (PBS-T에 희석) IR 형광 염료 공액 항 - 마우스 이차 항체. </li><li> 막 세 번 세척 한 후 적외선 F를 사용하여 대역을 분석 막을 검색면역 검출에 적합한 luorescence 촬상 시스템. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis.">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li><li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores,+along+spindle+fibers,+and+at+spindle+poles+in+living+cells.">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li><li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특?...

중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 (2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 (3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 7 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 (8)의 단부가 두 기능 중심체를 구축하는 추가 물질 pericentriolar 조립한다. 핵심 centriolar 구성 요소 9-11, 키나제, 포스, 보호자, 비계 구성 요소, 멤브레인 관련 단백질 분해 기계 등 여러 가지 다른 단백질뿐만 아니라 세포주기 12-16의 서로 다른 시간에 중심 소체, 기저 기관 및 PCM과 연결되어 있습니다. 그것은 종종 많은 단백질의 centrosomal 레벨이 일시적으로 centrosomal 타겟팅 메커니즘 및 / 또는 중심체에서 프로 테오 저하에 의해 규제된다는 점에 유의한다. 중요한 것은, 이러한 PLK4, Mps1, Sas6 및 CP110의 여러 단백질의 centrosomal 수준의 변동세포주기 t의 상이한 점은 중심 소체 조립체 5,17-22을 조절하는 것이 중요 할 것처럼,이 열화를 방지 centrosomal Mps1의 경우에 과량의 중심 소체 (19)의 형성을 이끈다. 한편, 여러 가지 단백질의 세포질 분획 centrosomal 풀에 비해 덜 불안정하다. 예를 들어 하향 조절 Centrin 2 (Cetn2)의 매개 된 siRNA는 그 전체 셀 레벨 (23)에서 큰 감소에도 불구 중심 소체에서 단백질의 수준이 적당하게 감소되었다. 오히려 그들의 중심체 특정 기능을 평가할 때 전 세포 단백질 수준을 측정하는 것보다 중심체에서 centrosomal 단백질 수준에서의 변화를 측정하는 것이 중요하다. 본 연구에서 우리는 중심체에서 단백질의 상대적인 수준을 정량화하는 간접 면역 형광 (IIF)를 사용하여 분석을 개발 하였다. 이 분석은 다른 샘플로부터 아르 세포를 분석하는데 특히 개발따라서 동시에 묘화 될 수 없다. 이들 샘플은 상이한 시점에서 수집 된 다른 시약 (즉, 약물 대 제어) 처리 한 세포가 될 수있다 (즉, 체이스 대 펄스) 또는 세포주기의 상이한 위상에있다. 이 분석의 원리는 배경 형광 강도 보정 소 영역에서 단백질에 대응하고, 그 레벨 선택 실험 조건에서 변화하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 값이 정상화 측정에있다. 중심체 생물학의 여러 연구는 최근에 후보 단백질 24 ~ 27의 중심체 고유의 기능을 결정하기 위해, 모두 라이브 또는 고정 세포에서 다양한 정량적 현미경 기술을 활용했다. 이러한 분석과 유사하게, 본 기술은 또한 시험 단백질의 백그라운드 보정 된 형광 강도를 측정한다. 그러나,이 분석에서 내부 표준을 사용하여 정규화 포함될 가능성이 큰 것이라고 알려정확성과 커버 슬립 상에 두 개의 서로 다른 두 개의 서로 다른 시료를 분석의 신뢰도. 또한, 중심체의 단백질 수준을 조사 이외에 약간의 조정으로이 방법은 실험 조건의 다양한 세트 또는 다른 부위에서 세포에 적용될 수있다. 여기서 우리는 다른 세포주기 단계에서 세포를 비교하는 BrdU의 펄스 체이스 전략과 우리의 양적 현미경 분석을 결합한다. 대신에, 다양한 세포주기 시점 공부 비동기식 성장하는 세포를 표준 세포주기 정지 및 해제 방법을 사용하는 S 단계에서 세포를 라벨 BrdU를 배양하고, 표지화 된 세포는 다양한 시간 (전형적으로 4-6 시간) 미국 쫓기는. 표지 된 세포의 대부분은 즉시 펄스 후 S 상에있을 것입니다. 체이스 후, 표지 된 세포는 형태 학적 특성 NUC에 대한 중심체의 이러한 된 직후 위치하여 확인할 수 있습니다 늦게 S, G2, 또는 유사 분열에 될 수 있도록 체이스의 길이는 선택레이, 중심체 사이 거리 등의 염색체 축합 따라서, 추적의 길이를 S, G2 및 특정 세포 유형의 M상의 평균 지속 기간에 의존한다. 이 접근법 등 히드 록시, aphidicolin, nocodazole 같은 세포주기 억제제를 방지하기 때문에, 더욱 중요한 생리 학적 세포주기 분석을 허용한다. 따라서, 우리는 단독 정량적 형광 현미경 분석법 또는 BrdU의 펄스 - 체이스 분석과 조합하여, 정확하게 섭동 세포주기 동안 후보 단백질 centrosomal 수준의 상대적인 변화를 측정하기위한 간단하지만 강력한 방법 인 것은 여기에서 설명한다. 우리는이 어 세이를 이용하여, VDAC3, 우리가 최근 16, 28을 미토콘드리아에 부가 중심체에서 식별 centrosomal 단백질 수준을 측정 하였다. 여기에서 얻어진 결과 VDAC3의 centrosomal 풀 저하에 의해 규제되는 우리의 이전의 관찰을 확인하고 또한 세포주기 dependen에 변화t 방식 (16)은 또한이 방법의 적용 성을 검증.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Name&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Catalog number</td>
			<td style="width:195px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">F8141</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">DMSO</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">D2650</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">MG115</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">SCP0005</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">BrdU</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">B5002</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T 6557</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aviva Systems Biology</td>
			<td style="width:99px;">ARP35180-P050</td>
			<td style="width:195px;">1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Santa cruz biotechnology</td>
			<td style="width:99px;">sc-81431</td>
			<td style="width:195px;">1:100 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab-75005</td>
			<td style="width:195px;">1:500 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-BrdU (rat monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab6326</td>
			<td style="width:195px;">1:250 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21093</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21202</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21203</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21206</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21207</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T5192</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T9026</td>
			<td style="width:195px;">1:20000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A10043</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Mouse IgG (H&#38;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td>
			<td style="width:105px;">Rockland antibodies</td>
			<td style="width:99px;">610-731-002</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">SlowFade Gold Antifade Reagent&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">S36936</td>
			<td style="width:195px;">Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Round coverslips 12CIR.-1</td>
			<td style="width:105px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:99px;">12-545-80</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Olympus IX-81 microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td>
			<td style="width:105px;">QImaging&#160;</td>
			<td style="width:99px;">32-0082B-238</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">100X Plan Apo oil immersion objective</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;">1.4 numerical aperture</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Slidebook software package</td>
			<td style="width:105px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Odyssey IR Imaging System</td>
			<td style="width:105px;">Li-cor Biosciences</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Bicinchoninic acid (BCA) assay</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow UV cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M622</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Blue cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M643</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Green cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M663</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요​​한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.

우리의 최근의 연구 VDAC3, 미토콘드리아 porins 16, 28 중 하나의 새로운 centrosomal 현지화 및 기능을 확인했다. VDAC3 특이 항체를 이용한 RPE1 세포를 포함한 여러 포유 동물 세포의 면역 염색 띄는 centrosomal 염색 비교적 약한 미토콘드리아 염색을 보여 주었다. 우리는 또한 centrosomal VDAC3이 우선적으로 어머니 중심 소체 및 내인성 모두의 centrosomal 풀과 연관된 및 ectopically VDAC3이 저하 (16)에</sup...

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K 조회수.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

비디오: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

연구

생물학

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

비행 고환에있는 영상 중심체

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...