This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. Culture cellulaire <ol><li> Utilisez télomérase humaine transcriptase inverse (hTERT) cellules de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine immortalisées (hTERT-RPE1; appelle ici RPE1). REMARQUE: les cellules sont des cellules humaines RPE1 quasi-diploïdes, non transformées qui sont couramment utilisés pour étudier ensemble centriole et ciliogenèse. Ces cellules suivent un cycle de duplication normale centriole coordonné avec un cycle cellulaire régulée. </li><li> Passage d&#39;une boîte de 100 mm de culture cellulaire quasi-confluente de cellules RPE1 à 1: 5 dilution de la culture d&#39;origine dans une boîte fraîche de 100 mm contenant 10 ml de DME / F-12 (1: 1) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine (milieu complet est désignée sous le DME / F-12). Cultiver les cellules à 37 ° C en présence de 5% CO 2. <ol><li> Incuber 12 mm lamelles de verre rondes dans 50 ml de HCl 1 N dans un bécher de verre couverte, O / N sans agitation, à 60 ° C dans un bain-marie ou incubateur. </li><li> After jeter la solution acide, laver les lamelles trois fois dans 100 ml d&#39;eau distillée par incubation pendant 15 min en agitant de temps. Répéter le lavage de manière similaire dans 70% d&#39;éthanol et 95% d&#39;éthanol. </li><li> Sécher les lamelles couvre-objet en les étalant individuellement sur un papier buvard laboratoire dans une enceinte de sécurité biologique, suivi par une stérilisation avec un rayonnement UV pendant 60 min. </li></ol></li><li> 4.2 Placer les lamelles sec dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Diluer la solution de fibronectine ou de la fibronectine comme polymère d&#39;ingénierie (concentration stock de 1 mg / ml) jusqu&#39;à une concentration de 25 ug / ml dans une culture cellulaire PBS. <ol><li> Placez 80-100 ul de la solution diluée sur chaque lamelle et incuber pendant 60 min à enduire le côté haut de la lamelle. Laver les lamelles trois fois en utilisant du PBS avant d&#39;ajouter un milieu complet. </li></ol></li></ol> 2. la croissance de cellules et le traitement des cellules avec des inhibiteurs du protéasome <ol><li> Passage 2 x 10 5 croître de manière asynchroneING RPE1 cellules dans chaque boîte de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet et cultiver les cellules dans 2 ml de milieu complet. Remplacez le milieu de culture toutes les 24 heures avec un milieu complet frais préchauffé. <ol><li> Pour analyser l&#39;effet de l&#39;inhibition du protéasome au niveau centrosomale de la protéine de test (ici VDAC3 ou γ-tubuline), poussent les cellules dans deux boîtes de 35 mm pour 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet et ajouter soit MG115 ou le DMSO en tant que solvant témoin à une concentration finale de 5 uM ou 0,05%, respectivement. Dans le même temps, ajouter BrdU dans les cellules à une concentration finale de 40 uM et on incube les cellules pendant 4 heures. </li><li> Transférer chaque lamelle dans une plaque de 24 puits. Ajouter 500 ul de methanol refroidi dans chaque puits et incuber la plaque à 20 ° C pendant 10 min pour fixer les cellules sur des lamelles couvre-objet. Laver immédiatement les lamelles trois fois avec 500 pi de tampon de lavage (1x PBS contenant 0,5 mM MgCl 2 et 0,05% de Triton X-100). </li></ol></li><li> Récolter les résiduellecellules de la boîte de 35 mm et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min. Utiliser le culot de cellules à analyser la protéine totale par buvardage de Western (étape 6). </li></ol> 3. BrdU Pulse et Chase essai pour analyser les niveaux de protéines dans les différentes phases du cycle cellulaire <ol><li> Pour analyser la variation du niveau d&#39;une protéine (ici VDAC3, SAS6 ou Cep135) à centrosomes à différentes phases du cycle cellulaire, cultiver les cellules dans deux boîtes de 35 mm contenant des lamelles couvre-objet pendant 44 h. Remplacer le milieu de culture avec du milieu complet contenant 40 uM de BrdU et incuber les cellules pendant 4 heures dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> D&#39;un plat, transférer les lamelles à une plaque de 24 puits pour fixer les cellules à l&#39;aide de méthanol glacé comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. </li><li> Après l&#39;impulsion de BrdU 4 heures, retirer le milieu contenant BrdU, laver les cellules une fois avec du PBS et une fois avec du milieu complet, ajouter du milieu frais, puis les cellules croître en l&#39;absence de BrdU pendant divers temps (typiquement un autre 4 hpour les cellules RPE1) avant de fixer les cellules comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. NOTE: Pour les cellules RPE1, la majorité des cellules positives à la BrdU sont à la fin de S ou G2 phase après une poursuite de 4 heures. Cela doit être déterminé de façon indépendante pour chaque type de cellule. </li></ol> 4. Immunocoloration <ol><li> Incuber les cellules fixées sur des lamelles dans 200 ul de tampon de blocage (2% de BSA et 0,1% de Triton X-100 dans du PBS 1x) pendant 30 min. <ol><li> Incuber les cellules avec un mélange d&#39;anticorps primaires (typiquement chez le lapin a soulevé une et l&#39;autre soulevée dans une souris) dilué dans du tampon de blocage O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée. </li><li> Pour faire une chambre humidifiée, mettre une serviette en papier humide dans la moitié inférieure d&#39;un mille ul boîte de pointe de la pipette vide. Déposer une bande de Parafilm sur la surface de crémaillère, et repérer une gouttelette (15 à 20 pi) de la solution d&#39;anticorps sur le Parafilm pour chaque lamelle à incuber. Inverser une lamelle couvre-objet sur une gouttelette de solution d&#39;anticorps (de sorte que les cellules sont immergées) et à proximitéle couvercle de la boîte de pointe. </li><li> Inversez lamelles encore et les retourner à la boîte de 24 puits. Laver les lamelles couvre-objet, puis les incuber en mélange 150 ul de l&#39;anticorps secondaire (ici colorant anti-lapin conjugué fluorescent vert-rouge et un colorant fluorescent conjugué anti-souris dilué dans du tampon de blocage) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lamelles trois fois. NOTE: Les anticorps secondaires conjugués fluorophores sont sensibles à la lumière. Protéger les échantillons de la lumière pendant les étapes 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Préparation pour la coloration anti-BrdU en fixant les cellules colorées RPE1 de nouveau avec 500 ul de methanol refroidi à -20 ° C pendant 10 min, comme décrit dans l&#39;étape 2.1.2. Laver les lamelles trois fois. REMARQUE: Cette fixation fixe le primaire et le secondaire marquage de l&#39;anticorps de la protéine (s) d&#39;intérêt au cours du processus d&#39;hydrolyse acide dans l&#39;étape suivante. <ol><li> Incuber les cellules dans 200 ul de HCl 2 N pendant 30 minutes à température ambiante. Neutraliser avec 300 pi de 1 M Tris-Cl, pH 8 uneD laver les cellules trois fois avec le tampon de lavage. </li><li> Bloquer de nouveau les cellules en utilisant 200 ul de tampon de blocage pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps de rat anti-BrdU (dilué dans du tampon de blocage) pendant 45 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Retourner les lamelles de retour à l&#39;antenne de 24 puits, lavez-les et puis incuber avec un colorant bleu anticorps secondaire fluorescent conjugué anti-rat (dilué dans 150 pi de tampon de blocage dans un plat de 24 puits pendant 1 heure à température ambiante. </li></ol></li><li> Laver les lamelles trois fois. Repérer une goutte (environ 3-6 pi) d&#39;une solution de montage contenant antifade réactif sur une lame de microscope en verre. Inverser une lamelle couvre-objet, avec la cellule du côté orienté vers le bas, sur la solution de montage. Essuyez l&#39;excès de liquide en appuyant doucement la lamelle contre la diapositive en utilisant des tissus de nettoyage doux. Appliquer le vernis à ongles transparent le long du bord de la lamelle pour la sceller sur la lame de microscope. </li></ol> 5. immunofluorescence image Acquisition et Analyse <ol><li> Utilisez un objectif à immersion d&#39;huile plan 100X Apo (avec une ouverture numérique de 1,4) pour acquérir les images de cellules RPE1 BrdU-positifs à la température ambiante. <ol><li> Placer une lame sur le microscope (voir équipement) attaché avec une caméra capable de l&#39;imagerie numérique. Pour chaque fluorophore, déterminer le temps d&#39;exposition approprié (typiquement entre 300-1000 ms) en examinant manuellement tous les échantillons d&#39;une expérience. Avant l&#39;acquisition des images d&#39;une cellule, déterminer manuellement la partie supérieure appropriée et fond plan focal le long de l&#39;axe Z (en général 0,2 um taille de pas). Acquérir des images de différents échantillons qui sont sur des lamelles séparées en utilisant le temps d&#39;exposition identique pour différents fluorophores le long de l&#39;axe Z en utilisant un logiciel d&#39;imagerie par microscopie numérique. </li></ol></li><li> Effectuer déconvolution (dans ces cas en utilisant l&#39;algorithme Pas de voisin) de toutes les piles d&#39;images acquises le long de l&#39;axe-Z. <ol><li> Obtenir la projection totale de l&#39;intensité de chaque pile d&#39;images le longl&#39;axe-Z. </li></ol></li><li> Dans les cellules où centrosomes sont proches (distance entre deux centrosomes est inférieure à 2 um), dessiner un petit carré (généralement 20 à 30 pixels par côté) autour des deux centrosomes et marquer la zone sélectionnée. <ol><li> Dessinez un carré plus grand (en général de 24 à 35 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée de la grande place. </li><li> Obtenir la zone (A) et l&#39;intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte (S désigne petite boîte et L désigne grande boîte). </li><li> Analyser le fond corrigé intensité de fluorescence de chaque fluorophore en utilisant la formule décrite par Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x S A / (A L - A S)]. </li><li> Obtenir l&#39;intensité de fluorescence normalisée de la protéine d&#39;intérêt (ici ou VDAC3 SAS6) en calculant le rapport de l&#39;intensité de fluorescence d&#39;arrière-plan corrigé de ses fluorophore à celle du fluorophore utilisé pour le standard interne choisi (ici γ-tubuline, ou SAS6 Cep135). </li></ol></li><li> Dans le cas de l&#39;analyse de cellules où centrosomes sont bien séparées (distance entre deux centrosomes est supérieure à 2 um), analyser séparément chaque centrosome en traçant deux ensembles distincts de boîtes. Dessinez un petit carré (généralement 15 à 25 pixels par côté) autour de chaque centrosome et marquer la zone sélectionnée. Dessinez un carré plus grand (20 à 30 pixels par côté) entourant la première place et marquer la zone sélectionnée. <ol><li> Obtenir la zone (A) et l&#39;intensité de fluorescence totale (F) de chaque fluorophore dans chaque boîte, et de calculer les intensités de fluorescence corrigée fond de chaque fluorophore, séparément pour chaque centrosome, comme décrit à l&#39;étape 5.3.3. </li><li> Combiner les intensités de fluorescence de fond corrigé de chaque protéine à partir des deux centrosomes pour obtenir le niveau centrosomale totale de cette protéine dans cette cellule. </li><li> Obtenir leintensité normalisée pour la protéine d&#39;intérêt en calculant le rapport de son intensité totale centrosomale à l&#39;intensité centrosomale totale de l&#39;étalon interne. </li></ol></li><li> Analyser au moins 15 à 25 cellules pour chaque condition expérimentale et tracer le graphique dans une feuille de calcul. </li></ol> 6. Analyse de la protéine totale Utilisant Western Blot <ol><li> Resuspendre les cellules dans radioimmunoprecipitation dosage (RIPA) un tampon contenant 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium à 1%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) et incuber pendant 10 min sur de la glace à lyser les cellules. <ol><li> Centrifuger le mélange à 10 000 xg pendant 10 minutes, séparer le lysat provenant de la fraction de culot et de mesurer la concentration totale en protéines de chaque lysat en utilisant un acide bicinchoninique (BCA) trousse de dosage. </li></ol></li><li> Mélanger 40 pg de lysat avec SDS-PAGE 4x tampon de chargement (50 mM de Tris-Cl, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glycerol, 100 mM de dithiothréitol, 0,1% Bromophenol bleu). <ol><li> Faire bouillir les échantillons pendant 10 min et exécuter les échantillons sur un 12,5% de dénaturation SDS-PAGE à une tension constante de 200 V. </li></ol></li><li> Transférer les protéines séparées sur SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose en utilisant la technique du Western blot (à une tension constante de 90 V pendant 1 heure à froid). <ol><li> Bloquer la membrane avec 3% de lait écrémé dans du PBS 1x, puis incuber la membrane avec des solutions d&#39;anticorps primaire dilué (dans ce cas de lapin anti-VDAC3, lapin anti-γ-tubuline et de souris anti-α-tubuline) pour une heure à température ambiante. </li><li> Après avoir lavé la membrane trois fois (chaque 5 minutes d&#39;incubation sous agitation) à l&#39;aide du tampon PBS-T (PBS 1x et 0,2% de Tween-20), incuber la membrane dans un mélange de proche infrarouge (IR) colorant fluorescent conjugué anti-lapin et Anticorps de colorant fluorescent IR anti-souris conjuguée secondaires (dilué dans du PBS-T) pendant 1 heure. </li><li> Laver la membrane trois fois, puis balayer la membrane d&#39;analyser les bandes en utilisant un f infrarougeSystème d&#39;imagerie par luorescence approprié pour la détection par immunotransfert. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis.">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li><li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores,+along+spindle+fibers,+and+at+spindle+poles+in+living+cells.">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li><li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La microscopie quantitative en biologie cellulaire est souvent associée à des tests d&#39;imagerie cellules vivantes telles que Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), etc. Cependant, il ya des exemples croissants de biologistes cellulaires développement différents tests de microscopie quantitative pour fixe cellules au cours des dernières années 27,34-36. Fait important, les progrès dans la compréhension de la biologie cen...

Centrosomes sont constitués d&#39;une paire de centrioles entourées par un matériau péricentriolaire (PCM). Étant les principaux centres d&#39;organisation des microtubules (de MTOCs) dans les cellules de mammifères, centrosomes servent les deux pôles de fuseau mitotique dans les cellules en division, et contribuent ainsi à maintenir l&#39;intégrité du génome 1. Dans les cellules au repos (par exemple, pendant la phase G0), l&#39;un des deux centrioles du centrosome, à savoir le centriole mère, est transformé en un corps de base pour assembler le cil primaire, un organite sensoriel faisant saillie de la surface de la cellule 2. Une fois les cellules re-entrer dans le cycle cellulaire, les cils primaires sont démonté et chaque centriole dirige l&#39;assemblage d&#39;un procentriole à son extrémité proximale qui se allonge progressivement pour former un centriole maturité 3. Au début de la phase S, une structure de roue en forme qui assure la symétrie neuf fois au centriole est formée sur la surface de chaque centriole existant et deviendra la base de chaque procentriole. SAS6 tchapeau est indispensable pour l&#39;assemblage de centriole est recruté pour former le moyeu de la roue 4-6. D&#39;autres protéines centriolaires sont ensuite assemblés sur la roue dans un très réglementé, de manière proximale à distale 7. Après avoir terminé précisément duplication centriole, les cellules se assemblent matériaux péricentriolaire supplémentaires pour construire deux centrosomes fonctionnels d&#39;ici la fin de la phase G2 8. En plus des composants principaux centriolaires 9-11, plusieurs autres protéines kinases, y compris, les phosphatases, chaperons, des composants d&#39;échafaudage, protéines associées à membrane et des machines de dégradation sont associés à des centrioles, les organismes de base et PCM à différents moments du cycle cellulaire 12-16. Il est souvent noté que les niveaux centrosomales de nombreuses protéines sont temporellement régulées par des mécanismes de ciblage centrosomales et / ou dégradation par le protéasome au centrosome. Fait important, les fluctuations du niveau centrosomale de plusieurs protéines telles que PLK4, Mps1, SAS6, et un CP110t différents points du cycle cellulaire semble être cruciale pour réguler ensemble de centriole 5,17-22, et dans le cas de Mps1 empêcher cette dégradation centrosomale conduit à la formation d&#39;excès centrioles 19. D&#39;autre part, les fractions centrosomales de plusieurs protéines sont moins labiles par rapport aux piscines cytosoliques. Par exemple siRNA médiée par régulation à la baisse de Centrin 2 (Cetn2) ne conduit à une diminution modérée de la teneur en protéines dans les centrioles malgré une grande réduction dans les niveaux de cellules entières 23. Il est donc crucial pour mesurer les changements dans le niveau de protéines centrosomales au centrosome plutôt que de mesurer l&#39;ensemble des niveaux de protéines de la cellule lors de l&#39;évaluation de leurs fonctions spécifiques centrosome. Dans cette étude, nous avons développé un test par immunofluorescence indirecte (IFI) pour quantifier le niveau relatif d&#39;une protéine au centrosome. Cet essai a été développé en particulier pour analyser les cellules qui sont de différents échantillonset ainsi ne peut pas être imagée en même temps. Ces échantillons peuvent être des cellules qui ont été traitées avec différents réactifs (ce est à dire, un médicament par rapport au témoin), recueillies à différents points dans le temps (ce est à dire, le pouls contre la chasse), ou sont dans différentes phases du cycle cellulaire. Le principe de ce test réside dans la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région et pour normaliser la valeur contre le même pour une autre protéine dont le niveau ne varie pas dans les conditions expérimentales choisies. Plusieurs études de la biologie des centrosomes ont récemment utilisé diverses techniques de microscopie quantitative, dans les deux cellules vivantes ou fixées, afin de déterminer la fonction spécifique du centrosome de protéines candidates 24-27. Similaires à ceux des essais, la présente technique mesure aussi l&#39;arrière-plan corrigé intensité de fluorescence de la protéine d&#39;essai. Toutefois, l&#39;inclusion de la normalisation en utilisant un standard interne dans cet essai aurait probablement offrir une plus grandela précision et la confiance dans l&#39;analyse de deux échantillons différents qui sont sur deux lamelles différentes. En outre, en plus de l&#39;examen de la protéine au niveau de centrosomes, avec des ajustements mineurs ce procédé peut être appliqué à un ensemble diversifié de conditions expérimentales ou à d&#39;autres sites cellulaires. Ici, nous combinons notre analyse quantitative de microscopie avec une stratégie pulse-chase BrdU de comparer les cellules à différents stades du cycle cellulaire. Au lieu d&#39;utiliser des techniques d&#39;arrêt du cycle cellulaire standard et libération d&#39;étudier divers moments du cycle cellulaire, les cellules en croissance de manière asynchrone sont incubées avec BrdU pour marquer les cellules en phase S, et les cellules marquées sont chassés pendant divers temps (typiquement 4-6 heures). La plupart des cellules marquées seront en phase S immédiatement après l&#39;impulsion. La longueur de la chasse est choisi de manière que, après la chasse, cellules marquées seront à la fin de S, G2, ou mitose, qui peut être vérifié par des caractéristiques morphologiques telles de position as- du centrosome par rapport à nuclei, la distance entre les centrosomes, la condensation des chromosomes, etc. Ainsi, la longueur de la chasse dépend de la durée moyenne de S, G2 et M phase d&#39;un type cellulaire particulier. Étant donné que cette approche évite les inhibiteurs du cycle cellulaire tels que l&#39;hydroxyurée, l&#39;aphidicoline, nocodazole, etc., il permet une analyse plus physiologiquement pertinente du cycle cellulaire. Ainsi, nous démontrons ici que le dosage quantitatif de la microscopie par fluorescence seul, ou en combinaison avec BrdU test pulse-chase, est une technique simple mais puissant pour mesurer avec précision les changements relatifs dans le niveau centrosomale d&#39;une protéine de candidat pendant une cycle cellulaire imperturbable. Nous avons mesuré le niveau de centrosomale VDAC3, une protéine que nous avons récemment identifié au centrosomes en plus de mitochondries 16,28, l&#39;utilisation de ces tests. Les résultats obtenus ici vérifier notre observation précédente que la piscine centrosomale de VDAC3 est régulée par la dégradation, et varie également en un dependen du cycle cellulairet 16 manière, la validation outre l&#39;applicabilité de cette méthode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Name&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Catalog number</td>
			<td style="width:195px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">F8141</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">DMSO</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">D2650</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">MG115</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">SCP0005</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:179px;">BrdU</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">B5002</td>
			<td style="width:195px;">Stock of 10 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T 6557</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aviva Systems Biology</td>
			<td style="width:99px;">ARP35180-P050</td>
			<td style="width:195px;">1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Santa cruz biotechnology</td>
			<td style="width:99px;">sc-81431</td>
			<td style="width:195px;">1:100 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab-75005</td>
			<td style="width:195px;">1:500 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-BrdU (rat monoclonal)&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Abcam</td>
			<td style="width:99px;">ab6326</td>
			<td style="width:195px;">1:250 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21093</td>
			<td style="width:195px;">1:200 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21202</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21203</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:179px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21206</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A21207</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in IIF blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T5192</td>
			<td style="width:195px;">1:1000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">T9026</td>
			<td style="width:195px;">1:20000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">A10043</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Mouse IgG (H&#38;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td>
			<td style="width:105px;">Rockland antibodies</td>
			<td style="width:99px;">610-731-002</td>
			<td style="width:195px;">1:10000 in WB blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">SlowFade Gold Antifade Reagent&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">S36936</td>
			<td style="width:195px;">Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Round coverslips 12CIR.-1</td>
			<td style="width:105px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:99px;">12-545-80</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Olympus IX-81 microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td>
			<td style="width:105px;">QImaging&#160;</td>
			<td style="width:99px;">32-0082B-238</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">100X Plan Apo oil immersion objective</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;">1.4 numerical aperture</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:179px;">Slidebook software package</td>
			<td style="width:105px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Odyssey IR Imaging System</td>
			<td style="width:105px;">Li-cor Biosciences</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:179px;">Bicinchoninic acid (BCA) assay</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow UV cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M622</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Blue cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M643</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-MNU2 Narrow Green cube</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td>U-M663</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

Centrosomes sont petits mais importants organites qui servent de pôles de fuseau mitotique pour maintenir l&#39;intégrité génomique ou assembler les cils primaires pour faciliter les fonctions sensorielles dans les cellules. Le niveau d&#39;une protéine peut être réglé différemment au centrosome que dans d&#39;autres endroits .cellular, et la variation du niveau centrosomale de plusieurs protéines à différents points du cycle cellulaire semble être crucial pour le bon régulation de l&#39;assemblage centriole. Nous avons développé un dosage quantitatif microscopie fluorescence qui mesure les changements relatifs dans le taux d&#39;une protéine dans des centrosomes dans des cellules fixées provenant de différents échantillons, comme à différentes phases du cycle cellulaire ou après le traitement avec divers réactifs. Le principe de ce test réside dans la mesure de l&#39;intensité de fluorescence de fond corrigé correspondant à une protéine à une petite région, et qui normalise la même mesure par rapport à une autre protéine qui ne varie pas dans le cadre du c expérimental choisiondition. Utilisant cet essai en combinaison avec impulsion de BrdU et la stratégie de la chasse à étudier cycles cellulaires non perturbés, nous avons quantitativement validé notre récente observation que la piscine centrosomale de VDAC3 est réglementée au centrosomes au cours du cycle cellulaire, vraisemblablement par la dégradation par le protéasome spécifiquement au centrosome.

Nos études récentes ont identifié roman localisation centrosomale et la fonction de VDAC3, l&#39;un des porines mitochondriales 16,28. Immunocoloration de plusieurs cellules de mammifères y compris les cellules RPE1 utilisant un anticorps spécifique VDAC3 a présenté une coloration centrosomale proéminent et relativement faible coloration mitochondriale. Nous avons également montré que VDAC3 centrosomale est préférentiellement associée à la centriole mère, et la piscine centrosomale à la fois e...

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K vues.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 