Bu çalışma hibe CRUK 15.043 ve 14.251 CRUK tarafından desteklenmiştir. Biz teknik yardım ve yazının eleştirel okuma Daniel Wetterskog ve Ka Kei Ho teşekkür ederim.

Tepki markerleri 1. Deneysel Perturbation ve Hücre Etiketleme (Ters Transfeksiyon siRNA Ekran) <ol><li> Steril doku kültürü başlık pipet olarak steril, düz 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına 1x siRNA tampon maddesi içinde 200 nM siRNA 70 ul. Serumdan yoksun DMEM ortamı kullanılarak 40 hacim içine transfeksiyon lipid seyreltilir ve her bir oyuğa içeren siRNA içine 105 ul akıtın. Not: serumsuz DMEM 10.5 ml 262.5 ul lipid seyreltilmesi oyuk başına lipit 2.6 ul teslim siRNA bir bütün 96 oyuklu bir plaka için uygun olan bir ana karışımı elde edilir. Bu aşamada 200 nM siRNA başlangıç ​​konsantrasyonunun kullanımı adım 1.3 içinde 20 nM&#39;ye bir çalışma konsantrasyonunu sağlar, ancak prosedürler göre ayarlanır başlangıç ​​konsantrasyonu (yani 50 nM), 5 nM kadar konsantrasyonlarda çalışmak için çalışacaktır. Onlar-hedef yanıt büyüklüğünü azaltabilir, ancak alt çalışma konsantrasyonu üzerinde Kalkanı artmasına yol açan, hedef dışı yanlış pozitif puanları azaltabiliryanlış negatif oranları t. </li><li> Oda sıcaklığında on dakika boyunca hafif bir titreşim plakasına karıştırın. Üç adet 50 ul verecek şekilde 175 ul Alt bölme şeffaf bir baz ile, 96 kuyucuklu plak tedavi opak, doku kültürü üzerine hedef başına çoğaltır. </li><li> 50 ul lipid siRNA kompleksleri doğrudan% 10 serum ihtiva eden 150 | il DMEM içinde oyuk başına 8,000 hücre dağıtarak Arka transfeksiyonu. Kullanım HCT116 insan kolorektal hücreleri stabil CDK2 aktivitesinin 5,8 raporlama GFP-etiketli işaretleyici ifade. Daha başka bir karıştırma gereklidir. Nem kontrol etmek ve plakanın &#39;kenar etkileri önleyerek ve 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içine plaka yerleştirmek için steril, yapışkan nefes alabilen membran ile plaka kapatın. </li><li> Ortam küçük bir artık miktarı kuyu kalmasını ortamı, aspire. Her çukuruna% 4 tamponlu formaldehid 100 ul ekleyerek hücreleri saptamak ve oda t, 10 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde inkübeemperature. </li><li> Plaka aspire sabitleme çözüm çıkarın. Ya da bu noktada, plaka daha sonra 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkanarak deney durdurma bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta 100 ul PBS altında sızdırmaz kılınmış ya da devam depolamak hücre permeabilizasyon. NOT: Biz tespit sonrasında kısa sürede işleme tabak tavsiye ve genellikle tam işlenmiş plakalar depolama tercih. Örneğin timerosal, sodyum azit ya da ticari alternatif olarak biyosidal koruyucu micoroganismal büyümesini önlemek için eklenebilir. Fosfataz inhibitörleri ilave edilmesi, fosfo-epitoplar korumak için yardımcı olur, ve diğer yollarla ilgili deney bağlamlarda yararlı olabilir protein modifikasyonu durumlarını muhafaza </li><li> Plaka PBS çıkarın ve permeabilizasyon çözeltisi 100 ul ekleyerek hücreleri geçirgenliği. Çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir MultiCH kullanarak permeabilizasyon çözüm aspirefrekanslarını pipet. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 100 ul blok çözeltisi eklenerek hücrelerin bloke eder. Daha sonra, oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat süre ile blok çözeltisi içinde 500 kat sulandırılmış anti-p-S780 RB1 antikorun 50 ul prob, plaka aspire blok çözeltisini çıkarın. </li><li> 5 dakika her plaka üzerinde bir solüsyon, 100 ul plaka yıkama çözeltisi ile plaka üç kez yıkayın. Kromatin spesifik DNA boyası bisbenzimid 2 uM ile takviye edilmiş blok çözeltisi içinde 50 ul floresan etiketli ikincil antikor seyreltildi 1000 kat ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca karanlıkta plaka kontrol edin. 4 ° C&#39;de karanlıkta 100 ul PBS altında, önce ve mağaza sızdırmaz olarak plaka üç kez yıkayın. Görüntü iki hafta içinde plaka. </li></ol> 2. Görüntüleme ve Görüntü Segmentasyon <ol><li> Ayrı almak için 20X amacı ile bir konfokal veya eğirme disk floresan mikroskop kullanın 16-bit, DNA boya, GFP ve bağışıklık boyama floroforlar karşılık gelen üç kanalda gri tonlama TIFF görüntüleri. Örtüşmeyen görüntü setleri birçok oyuk başına görüntü, çerçeveler gibi burada yaklaşık 1,000-2,000 hücreleri sevk yakalayın. </li><li> Her dosya adı &#39;deney adı&#39;, &#39;iyi adresi&#39;, bu sırada &#39;çerçeve sayısı&#39; ve &#39;kanal tanımlayıcı&#39;, (Şekil 3) eşsiz bir birleşimi olduğunu, böylece sistematik görüntü dosyaları adlandırın. örnek veri seti &quot;Mavi&quot; (kromatin, DNA boyama) ya da &quot;Yeşil&quot; (GFP) ya da &quot;Kırmızı&quot; kanal belirleyicileri olarak (immün lekeli fluorofor) kullanır. kuyu adresi, çerçeve sayısı ve kanal tanımlayıcı ayrıca üzerinde görüntü meta olarak adlandırılır. Kafa karıştırıcı kuyu ve çerçeve meta önlemek için çizgi sembolünü kullanın. </li><li> Belirtilen sırayla bu meta elemanları ile dosyaları adlandırın. Bu sonraki yazılım adımları CORRE sağlamak için gereklianaliz için görüntülerin ctly grup setleri. </li><li> Ücretsiz Hücre Profiler indirin ve yükleyin, Aktif Perl Community Edition, R istatistik programlama ortamı ve RStudio. Kurulum sırasında tüm varsayılan seçenekleri kabul; Aktif Perl yükleme PC kullanıcıları istendiğinde nerede PATH, dosya uzantısı dernek ve komut dosyası eşlemesi ile ilgili tüm seçenekleri etkinleştirmeniz gerekir. Aktif Perl Mac kullanıcıları için isteğe bağlıdır, ama onlar başka türlü Terminal komut satırından adım 3.2 yerine simge tıklayarak kullanarak Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir. </li><li> &#39;Dosyasından&#39; &#39;Dosya&#39; sonra, &#39;İthalat Boru Hattı&#39; tıklayın, Hücre Profiler yazılımı açın ve dosya 3_channels_pipeline.cppipe (Şekil S1A &amp; S1B) seçin. Dosya açıklanan dosya adı kongre görüntü dosyası meta yorumlamak yazılımı için gerekli talimatları içerir. Hücre Profiler artık inci nükleer DNA ve antikor yoğunlukları ayıklar, görüntüleri ilgilidirese ve her hücrenin tespit (Şekil 4 ve 5) sitoplazma yoğunluğu karşı nükleer oranını hesaplamak için GFP kanalını kullanır. </li><li> Hücre Profiler penceresinin sol alt köşesindeki düğme &#39;isimli çıkış ayarlarını tıklayın. Yeni Ekranın üst kısmında &#39;Varsayılan Giriş Dosya&#39; ve &#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39; etiketli metin kutuları vardır. Bir kerede, bu kutuların sağındaki klasör-simgeleri tıklatın ve (S1C Şekil) sırasıyla ekstre veriler, analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve hedefi seçin. </li><li> Hücre Profiler sol alt köşesindeki &#39;Analiz Görüntüler&#39; düğmesine basarak görüntü analizi başlayın. Ekranın alt kısmında veri çıkarma, &#39;Dur Analizi&#39; ve &#39;Pause&#39; düğmeleri için kalan zaman gözlemlemek. Gerekirse yararlı herhangi bir zamanda, en &#39;Pause&#39; düğmesine seçerek analiz duraklatmakGörüntüleri izlerken analiz edilirken (adım 2.8 tarif). </li><li> İsteğe bağlı olarak, program penceresinin (Şekil s1d) sol uç panelde göz simgeleri tıklayarak görüntü analiz herhangi bir aşaması için pencereleri açın. Hücre Profiler geçerli ayarlar görüntü segmentasyonu uygundur gerçekleştirmek (bu ayarlarını değiştirerek tavsiye için Şekil 1 ve Tartışma bakınız) kontrol etmek için &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; penceresini ve &#39;Ortaöğretim&#39; ve &#39;Tersiyer Nesneler&#39; için bu gözlemleyin. </li><li> Analiz tamamlandığında görünen ileti kutusunda &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. Sonuçları ile tüm veri dosyaları virgülle ayrılmış değer (.csv) dosyaları (Şekil S2A) olarak kaydedilir yerin &#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39; gidin. </li></ol> 3. Veri çıkarımı <ol><li> Arasında yer almaktadır yeni bir dosya &#39;Nuclei.csv&#39;, bulHücre Profiler çıkışı. Bu dosya floresan nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP-CDK2 muhabiri oranı değerleri (Şekil 6A ve S2A) için ayrı ayrı hücre verileri içerir. NOT: Farklı laboratuvarlar kendi testlerin doğasını uygun veri bu tür işlemek isteyeceksiniz. Antikor verileri ve sağlanan Perl betiği &#39;2_gate_classifier.pl&#39; kullanarak GFP-CDK2 muhabiri değerlerine göre her tedavi durumundan hücrelerin yolluk güncel veriler için Önerilen. </li><li> &#39;Nuclei.csv&#39; veri dosyası (Şekil S2A) aynı klasöre verilen Perl komut dosyasını &#39;2_gate_classifier.pl&#39; kopyalayın. Çift tıklatın Perl komut simgesini ve istendiğinde, hücreler antikor nihayet kapı değerleri kapı ve edilecek olan dosya için bir &#39;.csv&#39; dosya adından sonra veri dosyasının tam adını yazınfloresans ve GFP-CDK2 raportör verileri. NOT: esas kapı ayarlarını belirlemek ve verilerin analizi için bu uygulama nasıl Temsilcisi Veri bölümünde ve Şekil 6 aşağıda açıklanmıştır (veri sağlanan kullanım &#39;0.004&#39; ve sırasıyla &#39;1.5&#39;, analiz). Mac kullanıcıları yazarak Terminal komut satırından Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Her kuyudan her hücre hem kapıları (Şekil 6C) karşı nasıl performans gösterir alt-nüfus etiketleri ile orijinal Hücre Profiler verilerinden ham bireysel hücre deneyi değerleri birleştiren yeni oluşturulan dosyayı gözlemleyin. </li><li> RStudio yazılımını açarak bireysel hücre ICSI&#39;nin etiketleri kullanarak her deneysel koşul için veri çizilir. &#39;Dosya&#39; ve &#39;Dosya Aç&#39; ı tıklatın sonra verilen &#39;analysis.r&#39; dosyasını seçin. Şekil 6B çizmek için komutları uyun, <sRStudio (Şekil S2B) sol üst pencerede trong&gt; 7 ve 8. Sol üst pencerede, çizgiler 5 ve 6 çift tırnak sembolleri arasında, Geçitli verileri içeren klasörün bilgisayar adresini yazın. (&quot;: / Analiz klasör / analiz çıkışı C&quot; ve &quot;nuclei_gated.csv&quot; örneğin,) sürücü harfini ve sırasıyla dosyanın kendisi, adını ekleyin. NOT: RStudio belirli bir bilgisayarda ilk kez kullanılıyorsa, R grafik paketi &#39;ggplot2 ilk yüklü olması gerekmektedir. Bu, adım gereksiz hale bundan sonra RStudio yeni bir kurulum için bir kez tek bir adımdır. &#39;Ggplot2&#39; yüklemek için, RStudio sağ alt köşesindeki pencerenin üzerinde &#39;paketler&#39; olarak adlandırılan sekmesini tıklatın Bu altında görünen &#39;Install paketleri&#39; butonuna tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. &#39;Paketler&#39; ın içine Tipi &#39;ggplot2&#39; (atlayarak alıntılar)Bu yeni pencerede hızı ve nihayet adım 3.6 devam etmek için, pencereyi kapatmak gerekli ggplot2 fonksiyonları yüklemek ve ana RStudio penceresine dönmek için &quot;Install&quot; butonuna tıklayın. </li><li> RStudio sol üst pencerede 17 üzerinden satırları vurgulama 1, daha sonra &#39;Run&#39; düğmesine tıklayın. Bu R (Şekil S2C) deneysel veriler, eşik değerleri ve iyi konum bilgilerini girecek. R şimdi geçici olarak komplo için ilgili verileri yapacak. </li><li> Hat 17 altında kalan kod bireysel blokları vurgulayın ve daha önce olduğu gibi &#39;Çalıştır&#39; düğmesine tıklayarak gelen araziler oluşturmak. RStudio sağ alt köşesindeki pencerede araziler gözlemleyin ve &#39;İhracat&#39; düğmesine (Şekil S2D) tıklatarak biçimlerinin numarasını kaydetmek. </li><li> RStudio kapanış yaparken, istendiğinde &#39;Kaydet etmeyin&#39; tıklayın. Bu aksi takdirde veri yapacak RStudio sonraki kullanımı, karışıklığı önlerBir önceki oturumdan. </li></ol>

<ol>
	<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images.">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11 (2013).</li><li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening.">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li><li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content,+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888.">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).</li><li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response.">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).</li><li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution.">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li><li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+siRNA+screening.">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li><li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in.">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pRB+phosphorylation.">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside.">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li><li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+imaging+in+fixed+cells.">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li><li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 1-363 (2011).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 978-970 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

tarif akışı siRNA, daha sonra etiket algılama kullanarak hücrelerin çukurlu bir perturbance için bir yöntem teşkil eder ve son olarak elde edilen floresan mikroskobu görüntülerinden sayısal verilerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için yazılım destekli bir dizi aşama kullanımı. yaklaşım, birçok hücre tabanlı uygulamalarda geniş pratik uygulama vardır tek tek hücrelerin nükleer ve sitoplazmik yoğunluk değerlerinin teslim, odaklanmıştır. Burada kullanılan örnek, veri G1 fazındaki hücre döngüsü geçiş için iki floresan deneyleri test edilmiş ve geri nükleer DNA içeriğinin daha doğrudan bir biyofiziksel ölçüye ilişkili olan bir siRNA ekran ortamda elde edilmiştir. bireysel hücrelerin belirlenmesini sağlar ve ortaya çıkan &#39;Çekirdekler maske&#39; ilgili cytoplasmi tanımlamak için başlangıç ​​noktası olarak hizmet gibi görüntü nükleer DNA&#39;ya bir floresan DNA leke kullanımı, görüntü segmentasyonu sürecinde vazgeçilmez bir adımdırC bölgeleri. Kararlı biçimde hücrelerde ifade edilir GFP etiketli CDK2 raportör, ancak bu bölme tarif edilebilir tarafından sitoplazma içerisinde arka plan sinyali sürekli olarak daha yüksek bir değişken verir. Aynı analiz boru hattı için diğer uygun floresan bağlanmış habercilerin ve perturbance tepkilerini kullanılarak protein translokasyon olayların analizi için geçerli olmalıdır. Ayrıca, sitoplazma özel floresan boyalar ile GFP-CDK2 muhabiri ikame bu algoritmanın alternatif kullanım sitoplazmasında boyutlarını ve görüntüleri hücrelerin göreceli boyutlarını ölçmek için izin verecek. Burada anlatılan görüntü segmentasyonu stratejisi başka tasarım dikkate DNA ölçümü için entegre yoğunluk değerlerini sunmak için Hücre Profiler kullanılmasıdır. Yoğunluk Entegrasyon boyama verileri nukleus boyutunda olası varyasyonlar için izin nükleer DNA için değerleri ve görülen miktar profilleri için yakın bir maç temsiliçin, propidyum iyodür lekeli FACS verileri. Bununla birlikte, Entegre edilen yoğunluk, antijen floresans ortalama yoğunluğu ile örneklenen ortalama konsantrasyon, daha fazla biyolojik olarak, bir hücre bölmesi içinde protein (ve ilgili floresan) entegre toplam miktarına göre uygun olduğu proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için uygun bir araç sağlar olmayabilir. Bu nedenle yoğunluk değerleri P-S780 RB1 ve GFP verileri kullanılmıştır anlamına gelir. seçeneği Hücre Profiler yazılımı &#39;ExportToSpreadsheet&#39; panelinde bulunan iki mod (ortalama veya entegre) veri değerlendirme arasında değiştirmek için. 3_channels_pipeline.cppipe dosyasındaki analiz ayarları örnek veri setinde görüntüler için optimize edilmiştir. Bu protokol ile yeni görüntüler setleri analizi dosya adları adlandırma kuralı yukarıda (Şekil 3) tarif kabul gerektirecektir. Ayrıca, duyarlılık arka nükleer DNA boyama ve eşik parlaklığını uygun değerleriYeni görüntü setleri şiddetler Hücre Profiler ayarları içinde ayarlanması gerekebilir. DNA boyama çeşitli görüntü segmentasyonu maskeleri oluşturmak için geçerlidir kilit rolü göz önüne alındığında, bu kanal için doğru hassasiyet ayarları uygulama Hücre Profiler yazılımı ile yeni görüntü verilerinin analizine başarılı anahtarıdır. sağlanan Hücre Profiler ayarları dosyası (3_channels_pipeline.cppipe) yeni verilere analizi uyarlanması için en sık yararlı parametreler üzerine notlar içermektedir. Bu notlar Hücre Profiler ana penceresinde ekranın üst kısmındaki metin kutusuna ve hassasiyet ayarlarını değiştirme ve kanal sayısı analiz edilecek ayarlama konusunda rehberlik dahildir. Yeni görüntü verileri ayarlarını test etmek Protokol bölümünde 2.8, olarak suçlanan gibi (Şekil s1d &#39;... belirleyin Nesneler&#39; her biri için &#39;göz&#39; simgeleri açık tıklayarak protokol adımlarını görüntü analizi sırasında görüntü segmentasyonu gözlemlemek için gerekli olabilir </strong&gt;). Çekirdekler maske doğru bir DNA boyama görüntülerden tespit edilirse, özellikle, &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; üzerinden görüntü veri görselleştirme gösterir. &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; modülü için Hücre Profiler yazılımı sayfasında eşik düzeltme faktörüdür. Bu değerin Deneme ve hata düzeltmesi en nükleer tanıma hataları düzeltmek olacaktır. değerleri her görüntü için arka plan yoğunluğu karşı DNA kanalı denge. Eşik düzeltme faktörü değerleri bu daha büyük daha (net görüntüler için iyi) sıkı ve az 1 hoşgörülü (boyama ve arka plan arasındaki kontrast daha az olan görüntülere uygun) olduğunu 1, etrafında menteşe. Hücre Profiler bireysel hücre veri ham çıktı, diğer çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Burada gösterilen veriler biyolojik eğilimleri ayıklanması yardımcı olmak amacıyla hücre başına ölçülen parametrelerin iki kapılarını uygulamak için bir Perl script kullanımıEk ölçümlerle belirlenen alt popülasyonlar d izni çapraz referans. O Hücre Profiler çerçevesinde yolluk unsurları içerir eşit mümkün olsa da, burada kullanılan alternatif rota büyük veri setleri değerlendirilmesi gerekir, özellikle eğer, daha fazla esneklik ve hız sağlar. Mevcut protokol sonrası görüntü elde etme aşamalarında yavaş sahne Hücre Profiler yazılımı çalışan olduğunu. Gerekirse Hücre profil burada farklı kapı değerleri ile iteratif, daha hızlı sonraki Perl script ile tekrar analiz edilebilir bir un-kapılı ham veri seti üretmek için kapıları empoze olmadan çalıştırmak ve. Tüm çalışmalar bu gibi uygun kapı değerleri potansiyel zamanla herhangi bir veri kümesi verilen üzerinde reaktif ile değişebilir önceden bilecek. Dolayısıyla, uygun bir kapı valu belirlemek için pozitif bir kontrol ve sahte tedirgin hücreleri için hücre Profiler elde edilen ham veri dağılımı gösteren histogramlar oluşturmak için önerilirilgi parametrelerinin es. Perl script Hücre Profiler veri değişmez bir sütun yapısını kabul yazılır ve bir kullanıcı &#39;ExportToSpreadsheet&#39; ayarlarını kullanarak Hücre Profiler ile parametreler çıkış sayısını değiştirir eğer durmasına olabilir. Notlar Perl komut dosyaları içinde yer alan ayarları değişiklik uygulamak yardımcı olmak. Bu bir metin editörü komut görüntülemek görmek için, tercihen bir programcı metin editörü (örneğin, http://www.activestate.com/komodo-edit) renk kodu Perl elemanları ayarlanır. Veri formatında değişikliklere uyum için komut dosyası ayarlamak için nereye Bu notlar gösterir. Perl script benzer, görüntü analiz verilerinden rakamlar komplo için talimatlar içeren sağlanan Ar-kod dosyası (analysis.r), kullanım ve adaptasyon ek notlar görmek için bir metin editörü veya RStudio yazılımında okunabilir. Bu notlar düzenli ifadeler ve Perl &lt;ayrıntıları ile takviye edilebilirsup&gt; 12 ve veri okuma açıklamalı ve sırasıyla, çizilen nasıl temelini oluşturan her ikisi de R için ggplot2 13 paket. Floresan mikroskobu kullanarak yeni çalışmalar yanı sıra açık kaynak yayınlar tevdi ham veriler, burada tarif edilen analiz yöntemleri ile tedavi edilebilir. yüksek içerik verilerinin doğası herhangi bir gözlemci araştırma çıkarlarına bağlı olarak farklı analitik vurguları ile özyinelemeli analiz için oldukça rahat. Veri istenebilir sorular başlangıçta kullanılan prob ile sınırlı olmasına rağmen, görüntü verileri genellikle anlamlı onları üretilen çalışmaların kapsamı dışında tekrar analiz edilebilir.

Burada sunulan çalışma tek tek hücreler ve belirlenen hücre içi bölgeleri belirlemek için yapışık hücreler floresan mikroskop görüntüleri algoritma güdümlü dökümü yapmak için serbestçe ulaşılabilen yazılımın Celi Profiler kullanımını tarif eder. Bölütlemesi olarak adlandırılır bu yaklaşım, her bir hücre ya da (haliyle bölümlere ayrılmış nesneler adlandırılır) hücre içi bölgesinde lokalize floresan işaretli belirteçleri miktarının tarafından görüntüsü hücrelerin daha sonra çok parametre analizi sağlar. Bu iş akışı, yüksek içerik analizi sağlamak için bir temel oluşturur ve daha gelişmiş ve çok parametrik uyacak şekilde modifiye, bireysel hücre özel yüksek-içerik araçların veya tescilli yazılım erişimi olmayan laboratuvarlarda analizleri edilebilir bir araç olarak hizmet etmek amaçlanmıştır. Bu yazının birlikte verilen dosyalar açıklanan analiz oluşturmak için ilgili ham görüntü verileri, algoritma ayarları ve destekleyici komut bir deney seti bulunmaktadır. verilen algoritma ayarları fveya Hücre Profiler ayarlamak örnek veriler ve ayarlar diğer çalışmalardan görüntü verilerinin kullanılmasını sağlamak için gerekli olabilir ne Tartışma bölümünde detayları için optimize edilmiştir. Nicel veri Hücre Profiler kullanarak ekstre edildikten sonra, farklı laboratuvarlar ham veri bireysel hücre değerleri tarafından sunulan bilgilerin nasıl kullanılacağı için farklı gereksinimleri olabileceğini; Burada gösterilen girişler her bir deney için ham verilere uygulanan geldiği bir yaklaşımdır. Bu kapıları kullanarak, veri kapıları tarafından tanımlanan yanıtı geçiren hücrelerin alt popülasyonlar farklı tedaviler bağlayan eğilimlerin görselleştirme izin yanıt ikili açısından dönüşür. kapıları ilgili her ölçüm için uygun negatif ve pozitif kontroller için elde edilen verilerin dağılımlarının gözlemlerine dayalı ayarlanır. kapıları kullanımı, ham, hücre bazlı ölçümler yönetmek için nasıl sadece bir örnektir. Ayrıca burada gösterilen nükleer DNA yoğunluğu kullanımı benikapılı veriler ile bir arada değerleri sürekli bir dizi olarak, ham formunda asurements. Görüntü analiz verileri yönetmek Diğer yaklaşımlar çalışmanın niteliğine bağlı olarak, dikkate alınmalıdır; alt popülasyonlar hücreleri atanması için kapılarını kullanarak istatistiksel alternatifler parametrelerin çok sayıda 3 bildirilmiştir genelinde yüksek içerik verileri özetlemek için stratejiler 2 ve sistematik karşılaştırmalar bildirilmiştir. 6 - Görüntü verilerinin yüksek içerik analizleri ilaç yanıtının hücresel çalışmalarda kullanılmasını bulduk, genetik ve çevresel stres sinyalizasyon 4 ters. yüksek içerik analizi hak floresan mikroskop verilerinin analizi algoritmik nicel ve mekansal parametreler tek tek hücrelerin 7 genelinde eş zamanlı olarak dikkate alınması izin vermesinden kaynaklanıyor. Bu şekilde, birçok tahlil için hücresel sonuçları analiz: d çapraz referans diferansiyel davranış olabilirefined hücre alt popülasyonlar morfolojik değişkenlerin dikkate içerebilir deneysel koşullar ve tahlillerde izlenebilir. stratejileri ve analiz iş akışı diğer yüksek-içerik yaklaşımlar gibi, bireysel hücrelere çapraz başvurulan çoğaltılmış veri sunma yeteneğine sahiptir, burada ele. Floresan mikroskop görüntüleri oluşturmak ve binlerce görüntü kadar düşük kapasiteli geleneksel floresan tabanlı mikroskopi üretilen görüntülerin onlarca arasında değişen verilerin analizi için geçerli olan Yüksek içerik yöntemleri takım çalışmalar otomatik yüksek içerik tarama platformları kullanarak üretti. akışı ayrı deneyler nükleer floresan markörü şiddet ya da sırasıyla, bir flüoresan raportör proteininin çekirdek / sitoplazmik translokasyon ya bakımından ölçüldüğü, örnek veri ile burada gösterilmiştir. iş akışı, bu deneyler, ayrı ayrı olarak ya da kombinasyon halinde EAC bağlı olması ile esnekh farklı araştırmacılar tarafından araştırma sorusunu verilen. örnek, veri RNA interferans (RNAi), deney (Şekil 1) bir parçası olarak üretilmektedir. Susturucu RNA oligonükleotidleri (siRNA), sikline bağımlı kinaz (CDK) aktivitesinin iki floresan haberci için değişikliklere neden HCT116 insan kolorektal karsinom hücrelerinde spesifik proteinlerin demonte etmek için kullanılır. Serin nükleer retinoblastoma 780 (p-S780 RB1) olarak CDK6-bağımlı fosfatlamanın antikor lekelemesi yoluyla değerlendirilir. Aynı hücrelerde, CDK2 aktivitesi (GFP CDK2 raportör) yeşil floresan protein etiketli raportör CDK2 etkinliğinin olmaması raportör çekirdekten sitoplazmaya ve CDK2 aktivasyon servisleri üzerinde bulunan sitoplazmik oranı nükleer değerlendirilir 8. Buna ek olarak, her bir hücrenin nükleer DNA, bir DNA-ara boya kullanılarak lekelenmektedir, görüntüler çekirdek sınırları hücreleri belirlenmesi ve tanımlanması için bir araç olarak hizmet eder bisbenzimid, hem de birDNA, bolluk hücrenin hücre döngüsü durumuyla ilgili bilgileri sağlayan (Şekil 2) sa ölçer. CDK6 ve CDK2 faaliyetleri hücre döngüsünün 5 S fazına G1 hücre geçiş tespit edilebilir ve bu, tek tek hücrelerin iki muhabir arasında yakın bir uyum beklendiği gibi, birbirine 9,10 başarılı ve. Burada kullanılan gösterim veri kümesi siRNA etkisi CDK6, retinoblastom proteini (RB1) ve bir hedefleme negatif kontrol (Tablo 1) hedef bir örnek olarak analiz eder. CDK6 demonte p-S780 RB1 epitopunun bir azalmaya ve hücre döngüsünün G1 fazında hücrelerin birikmesi hem ortaya çıkarmak gerekir. RB1 Knockdown fosfo-S780 antikorunun özgünlük için bir reaktif kontrolü olarak hizmet vermektedir. Formalin floresan mikroskop görüntüleri floresan lekeli HCT116 doku kültürü hücreleri, algoritmik görüntü analizi için kullanılan, 11 sabit. Elde edilen sayısal veriler için kullanılançapraz-referans muhabirleri ve farklı demonte devletlerin etkisini ölçmek. Bu tür bir analiz tarafından üretilen verilerin potansiyel büyüklüğü normal analiz araçları bir meydan okuma sunabilir. Örneğin, bireysel hücre veri bazı elektronik tablo yazılımı karşılayacak daha büyük olabilir. Büyük veri setleri analizi yardımcı veri basit, yüksek tekrarlayıcı, denetimli işleme gerçekleştirmek Perl scriptleri dahildir. Perl script Belirli bir dosya adlandırma kuralı (Şekil 3) ile görüntü dosyalarını işlerken Hücre Profiler tarafından üretilen çıktı dosyaları için özel olarak yazılmış, ve analiz kullanılmak üzere kuyu başına alanların değişken numaralar için izin verir. Bu hücre alt 5 trendleri izlemek için kapı bireysel hücre deneyi verilerine sık önemlidir ve burada gösterilen her tahlil türü için önceden belirlenmiş bir dizi kapısı dayalı her hücre bayrak bir Perl script kullanımıdır. Da dahil isteğe Perl komut vardırhangi bireysel kuyuların (veya koşullar) veri sonuçlarını özetlemek, teslim: set kapısı içindeki hücrelerin ve ham tahlil puanları ortalama değerlerin yüzdesi. yanıtları tamamını veya bir kuyu içindeki hücrelerin çoğunluğunu etkileyen durumlarda veri görüntüleme ikinci, daha homojen şekilde geçerlidir. Yukarıda ele alındığı gibi, bu gibi değerlendirme yanıt olarak bir popülasyon içindeki hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı tek tek hücre veri gating ile elde daha az kullanışlıdır. açıklanan iş akışı programı siRNA veya tarif işaretleyici deneyleri ile pertürbasyondan sınırlı değildir. Çalışmalar siRNA kombinasyonu, kimyasal inhibitörleri ve radyasyon tedavisi ile doku kültürü deneyleri ve CDK6 dışındaki belirteçler ve CDK2 aktivitesi 5 değerlendirilmesi için yanıtları analiz etmek için, bu yaklaşımı kullanmışlardır. Kavramsal olarak, deneysel strateji biyolojik kullanışlı hücre içi bölgelerde çeşitli otomatik kayıt sağlarfloresan mikroskop görüntüleri mevcut olan tek tek hücrelerde. Gibi, bu yaklaşım nüfus ziyade bireysel hücreler üzerinde odaklanmak teknikleri ile atlanabilir nicel, çoğaltılmış veri ortaya biyolojik bilgiyi elde edebilirsiniz. Küçük modifikasyonlar ile tarif edilen bir yaklaşım ve analiz akışı bir floresans bazlı deney çıkışları ve hücre-biyolojik yanıtlar, kantitatif, tek tek hücre veriler sağlayabilir burada DNA içeriğinin nicel değerlendirme, çekirdek ya da sitoplazmik floresan ölçümü ya da bunların arasındaki belirteçlerin mekik İki bölme, ya tek tek ya da bir çok katlı bir şekilde ilgi çekmektedir. Yayınlama gereksinimleri artan bir şekilde yayınlanmış verileri yeniden analiz isteyen laboratuvarlar da doğrudan ilgilendiren olacak burada anlatılanlar gibi açıkça erişilebilir ham verilere erişimi ve mikroskopi görüntü analizi için ücretsiz araçlarımızdan ile aşinalık sunulması doğru eğilimi gibi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="604">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Yapışık memeli doku kültürü modelleri hücrelerin davranışını yöneten kontrol mekanizmalarının anlaşılması gelişmeler tek hücreli analizi modları giderek daha bağımlı hale gelmektedir. Hücre popülasyonlarının gelen biyomarkerların ortalama değerleri yansıtan kompozit verileri teslim Yöntemleri çalışılan biyolojik sistemin heterojen yansıtan ICSI&#39;nin dinamiklerini kaybetme riski. Bu doğrultuda, geleneksel yaklaşımlar yerini ediliyor, ya da yüksek içerik mikroskobu ile değerlendirmesini sağlamak için geliştirilmiştir hücresel tahlil, daha karmaşık formlar ile destekledi. Bu deneyler potansiyel özel yazılım paketleri eşlik tarafından etkin floresan belirteçler, görüntüleri çok sayıda oluşturmak hücre başına çok parametrik ölçümler için izin verir. Bununla birlikte, nispeten yüksek yatırım maliyetleri ve bu cihazların çoğunun aşırı uzmanlaşma birçok araştırmacı için erişilebilir önlemiştir. Burada tarif a,floresan mikroskobu görüntüleri ile kullanım için uygun olan tek tek hücrelerin özel hücre içi bölgelerde birden fazla floresan markör yoğunluklarının ölçülmesi için evrensel olarak geçerli bir iş akışı. Bu iş akışı Key floresan işaretleyici yoğunluğunu bu görüntüler tek tek hücrelerin, hücre içi tanımlanan bölgelere bölüm ayırt ve teslim serbestçe kullanılabilir Hücre Profiler yazılımı 1 uygulanması bu bölgelere özgü değerler olduğunu. görüntü verileri tek tek hücre yoğunluğu değerlerinin ekstraksiyon bu iş akışının merkezi amacı ve yapışık insan hücrelerinde G1 kontrol noktası düzenleyiciler için bir siRNA ekranından kontrol verilerinin analizi ile izah edilecektir. Bununla birlikte, burada sunulan akışı hücre pertürbasyon diğer araçlarla sağlanan verilerin analizi uygulanabilir (örneğin, bileşik, ekranlar) bu ve floresan bazlı hücresel belirteçlerinin diğer formları ve laboratuarlar arasında geniş bir aralığı için yararlı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Görüntüleme.  UCL Cancer Institute.  Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir. 

Video: Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts whose expression is associated with insecticide resistance phenotypes in Anopheles gambiae mosquitoes. The application can be used online or downloaded and used locally by anyone. The local application can be modified to add new insecticide resistance datasets generated from multiple -omics platforms. This guide demonstrates how to add new datasets and handle missing data. Furthermore, IR-TEx can be completely and easily recoded to use-omics datasets from any experimental data, making it a valuable resource to many researchers. The protocol illustrates the utility of IR-TEx in identifying new insecticide resistance candidates using the the microsomal glutathione transferase, GSTMS1, as an example. This transcript is upregulated in multiple pyrethroid resistant populations from C&#244;te D&#39;Ivoire and Burkina Faso. The identification of co-correlated transcripts provides further insight into the putative roles of this gene.

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx explores insecticide resistance-related transcriptional profiles in the species Anopheles gambiae. Provided here are full instructions for using the application, modifications for exploring multiple transcriptomic datasets, and using the framework to build an interactive database for collections of transcriptomic data from any organism, generated in any platform.

IR-TEx: Sıtma Vektör Anopheles gambiyae için tasarlanmış Büyük Veri Transkripsiyonları için Açık Kaynak Veri Entegrasyon Aracı

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This problem is aggravated with increasing density of worms and creates challenges for imaging and quantification. We developed a FIJI-based workflow, Worm-align, that can be used to generate single- or multi-channel montages of user-selected, straightened and aligned worms from raw image data of C. elegans. Worm-align is a simple and user-friendly workflow that does not require prior training of either the user or the analysis algorithm. Montages generated with Worm-align can aid the visual inspection of worms, their classification and representation. In addition, the output of Worm-align can be used for subsequent quantification of fluorescence intensity in single worms, either in FIJI directly, or in other image analysis software platforms. We demonstrate this by importing the Worm-align output into Worm_CP, a pipeline that uses the open-source CellProfiler software. CellProfiler&#8217;s flexibility enables the incorporation of additional modules for high-content screening.&#160;As a practical example, we have used the pipeline on two datasets: the first dataset are images of heat shock reporter worms that express green fluorescent protein (GFP) under the control of the promoter of a heat shock inducible gene hsp-70, and the second dataset are images obtained from fixed worms, stained for fat-stores with a fluorescent dye.

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP is a simple FIJI/CellProfiler workflow that can be used to straighten and align Caenorhabditis elegans samples and to score whole-worm image-based assays without the need for prior training steps. We have applied Worm-align/Worm_CP to the quantification of&#160;heat-shock induced expression in live animals or lipid droplets&#160;in fixed samples.

Caenorhabditis elegans'tan Elde Edilen Floresan Görüntü Verilerinin Düzleştirilmesi ve Ölçülmesi Için Solucan Hizalama ve Worm_CP İki Açık Kaynak Boru Hattı

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...