Name: workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Bu çalışma hibe CRUK 15.043 ve 14.251 CRUK tarafından desteklenmiştir. Biz teknik yardım ve yazının eleştirel okuma Daniel Wetterskog ve Ka Kei Ho teşekkür ederim.

Tepki markerleri 1. Deneysel Perturbation ve Hücre Etiketleme (Ters Transfeksiyon siRNA Ekran) <ol><li> Steril doku kültürü başlık pipet olarak steril, düz 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına 1x siRNA tampon maddesi içinde 200 nM siRNA 70 ul. Serumdan yoksun DMEM ortamı kullanılarak 40 hacim içine transfeksiyon lipid seyreltilir ve her bir oyuğa içeren siRNA içine 105 ul akıtın. Not: serumsuz DMEM 10.5 ml 262.5 ul lipid seyreltilmesi oyuk başına lipit 2.6 ul teslim siRNA bir bütün 96 oyuklu bir plaka için uygun olan bir ana karışımı elde edilir. Bu aşamada 200 nM siRNA başlangıç ​​konsantrasyonunun kullanımı adım 1.3 içinde 20 nM&#39;ye bir çalışma konsantrasyonunu sağlar, ancak prosedürler göre ayarlanır başlangıç ​​konsantrasyonu (yani 50 nM), 5 nM kadar konsantrasyonlarda çalışmak için çalışacaktır. Onlar-hedef yanıt büyüklüğünü azaltabilir, ancak alt çalışma konsantrasyonu üzerinde Kalkanı artmasına yol açan, hedef dışı yanlış pozitif puanları azaltabiliryanlış negatif oranları t. </li><li> Oda sıcaklığında on dakika boyunca hafif bir titreşim plakasına karıştırın. Üç adet 50 ul verecek şekilde 175 ul Alt bölme şeffaf bir baz ile, 96 kuyucuklu plak tedavi opak, doku kültürü üzerine hedef başına çoğaltır. </li><li> 50 ul lipid siRNA kompleksleri doğrudan% 10 serum ihtiva eden 150 | il DMEM içinde oyuk başına 8,000 hücre dağıtarak Arka transfeksiyonu. Kullanım HCT116 insan kolorektal hücreleri stabil CDK2 aktivitesinin 5,8 raporlama GFP-etiketli işaretleyici ifade. Daha başka bir karıştırma gereklidir. Nem kontrol etmek ve plakanın &#39;kenar etkileri önleyerek ve 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içine plaka yerleştirmek için steril, yapışkan nefes alabilen membran ile plaka kapatın. </li><li> Ortam küçük bir artık miktarı kuyu kalmasını ortamı, aspire. Her çukuruna% 4 tamponlu formaldehid 100 ul ekleyerek hücreleri saptamak ve oda t, 10 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde inkübeemperature. </li><li> Plaka aspire sabitleme çözüm çıkarın. Ya da bu noktada, plaka daha sonra 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkanarak deney durdurma bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta 100 ul PBS altında sızdırmaz kılınmış ya da devam depolamak hücre permeabilizasyon. NOT: Biz tespit sonrasında kısa sürede işleme tabak tavsiye ve genellikle tam işlenmiş plakalar depolama tercih. Örneğin timerosal, sodyum azit ya da ticari alternatif olarak biyosidal koruyucu micoroganismal büyümesini önlemek için eklenebilir. Fosfataz inhibitörleri ilave edilmesi, fosfo-epitoplar korumak için yardımcı olur, ve diğer yollarla ilgili deney bağlamlarda yararlı olabilir protein modifikasyonu durumlarını muhafaza </li><li> Plaka PBS çıkarın ve permeabilizasyon çözeltisi 100 ul ekleyerek hücreleri geçirgenliği. Çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir MultiCH kullanarak permeabilizasyon çözüm aspirefrekanslarını pipet. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 100 ul blok çözeltisi eklenerek hücrelerin bloke eder. Daha sonra, oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat süre ile blok çözeltisi içinde 500 kat sulandırılmış anti-p-S780 RB1 antikorun 50 ul prob, plaka aspire blok çözeltisini çıkarın. </li><li> 5 dakika her plaka üzerinde bir solüsyon, 100 ul plaka yıkama çözeltisi ile plaka üç kez yıkayın. Kromatin spesifik DNA boyası bisbenzimid 2 uM ile takviye edilmiş blok çözeltisi içinde 50 ul floresan etiketli ikincil antikor seyreltildi 1000 kat ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca karanlıkta plaka kontrol edin. 4 ° C&#39;de karanlıkta 100 ul PBS altında, önce ve mağaza sızdırmaz olarak plaka üç kez yıkayın. Görüntü iki hafta içinde plaka. </li></ol> 2. Görüntüleme ve Görüntü Segmentasyon <ol><li> Ayrı almak için 20X amacı ile bir konfokal veya eğirme disk floresan mikroskop kullanın 16-bit, DNA boya, GFP ve bağışıklık boyama floroforlar karşılık gelen üç kanalda gri tonlama TIFF görüntüleri. Örtüşmeyen görüntü setleri birçok oyuk başına görüntü, çerçeveler gibi burada yaklaşık 1,000-2,000 hücreleri sevk yakalayın. </li><li> Her dosya adı &#39;deney adı&#39;, &#39;iyi adresi&#39;, bu sırada &#39;çerçeve sayısı&#39; ve &#39;kanal tanımlayıcı&#39;, (Şekil 3) eşsiz bir birleşimi olduğunu, böylece sistematik görüntü dosyaları adlandırın. örnek veri seti &quot;Mavi&quot; (kromatin, DNA boyama) ya da &quot;Yeşil&quot; (GFP) ya da &quot;Kırmızı&quot; kanal belirleyicileri olarak (immün lekeli fluorofor) kullanır. kuyu adresi, çerçeve sayısı ve kanal tanımlayıcı ayrıca üzerinde görüntü meta olarak adlandırılır. Kafa karıştırıcı kuyu ve çerçeve meta önlemek için çizgi sembolünü kullanın. </li><li> Belirtilen sırayla bu meta elemanları ile dosyaları adlandırın. Bu sonraki yazılım adımları CORRE sağlamak için gereklianaliz için görüntülerin ctly grup setleri. </li><li> Ücretsiz Hücre Profiler indirin ve yükleyin, Aktif Perl Community Edition, R istatistik programlama ortamı ve RStudio. Kurulum sırasında tüm varsayılan seçenekleri kabul; Aktif Perl yükleme PC kullanıcıları istendiğinde nerede PATH, dosya uzantısı dernek ve komut dosyası eşlemesi ile ilgili tüm seçenekleri etkinleştirmeniz gerekir. Aktif Perl Mac kullanıcıları için isteğe bağlıdır, ama onlar başka türlü Terminal komut satırından adım 3.2 yerine simge tıklayarak kullanarak Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir. </li><li> &#39;Dosyasından&#39; &#39;Dosya&#39; sonra, &#39;İthalat Boru Hattı&#39; tıklayın, Hücre Profiler yazılımı açın ve dosya 3_channels_pipeline.cppipe (Şekil S1A &amp; S1B) seçin. Dosya açıklanan dosya adı kongre görüntü dosyası meta yorumlamak yazılımı için gerekli talimatları içerir. Hücre Profiler artık inci nükleer DNA ve antikor yoğunlukları ayıklar, görüntüleri ilgilidirese ve her hücrenin tespit (Şekil 4 ve 5) sitoplazma yoğunluğu karşı nükleer oranını hesaplamak için GFP kanalını kullanır. </li><li> Hücre Profiler penceresinin sol alt köşesindeki düğme &#39;isimli çıkış ayarlarını tıklayın. Yeni Ekranın üst kısmında &#39;Varsayılan Giriş Dosya&#39; ve &#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39; etiketli metin kutuları vardır. Bir kerede, bu kutuların sağındaki klasör-simgeleri tıklatın ve (S1C Şekil) sırasıyla ekstre veriler, analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve hedefi seçin. </li><li> Hücre Profiler sol alt köşesindeki &#39;Analiz Görüntüler&#39; düğmesine basarak görüntü analizi başlayın. Ekranın alt kısmında veri çıkarma, &#39;Dur Analizi&#39; ve &#39;Pause&#39; düğmeleri için kalan zaman gözlemlemek. Gerekirse yararlı herhangi bir zamanda, en &#39;Pause&#39; düğmesine seçerek analiz duraklatmakGörüntüleri izlerken analiz edilirken (adım 2.8 tarif). </li><li> İsteğe bağlı olarak, program penceresinin (Şekil s1d) sol uç panelde göz simgeleri tıklayarak görüntü analiz herhangi bir aşaması için pencereleri açın. Hücre Profiler geçerli ayarlar görüntü segmentasyonu uygundur gerçekleştirmek (bu ayarlarını değiştirerek tavsiye için Şekil 1 ve Tartışma bakınız) kontrol etmek için &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; penceresini ve &#39;Ortaöğretim&#39; ve &#39;Tersiyer Nesneler&#39; için bu gözlemleyin. </li><li> Analiz tamamlandığında görünen ileti kutusunda &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. Sonuçları ile tüm veri dosyaları virgülle ayrılmış değer (.csv) dosyaları (Şekil S2A) olarak kaydedilir yerin &#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39; gidin. </li></ol> 3. Veri çıkarımı <ol><li> Arasında yer almaktadır yeni bir dosya &#39;Nuclei.csv&#39;, bulHücre Profiler çıkışı. Bu dosya floresan nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP-CDK2 muhabiri oranı değerleri (Şekil 6A ve S2A) için ayrı ayrı hücre verileri içerir. NOT: Farklı laboratuvarlar kendi testlerin doğasını uygun veri bu tür işlemek isteyeceksiniz. Antikor verileri ve sağlanan Perl betiği &#39;2_gate_classifier.pl&#39; kullanarak GFP-CDK2 muhabiri değerlerine göre her tedavi durumundan hücrelerin yolluk güncel veriler için Önerilen. </li><li> &#39;Nuclei.csv&#39; veri dosyası (Şekil S2A) aynı klasöre verilen Perl komut dosyasını &#39;2_gate_classifier.pl&#39; kopyalayın. Çift tıklatın Perl komut simgesini ve istendiğinde, hücreler antikor nihayet kapı değerleri kapı ve edilecek olan dosya için bir &#39;.csv&#39; dosya adından sonra veri dosyasının tam adını yazınfloresans ve GFP-CDK2 raportör verileri. NOT: esas kapı ayarlarını belirlemek ve verilerin analizi için bu uygulama nasıl Temsilcisi Veri bölümünde ve Şekil 6 aşağıda açıklanmıştır (veri sağlanan kullanım &#39;0.004&#39; ve sırasıyla &#39;1.5&#39;, analiz). Mac kullanıcıları yazarak Terminal komut satırından Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Her kuyudan her hücre hem kapıları (Şekil 6C) karşı nasıl performans gösterir alt-nüfus etiketleri ile orijinal Hücre Profiler verilerinden ham bireysel hücre deneyi değerleri birleştiren yeni oluşturulan dosyayı gözlemleyin. </li><li> RStudio yazılımını açarak bireysel hücre ICSI&#39;nin etiketleri kullanarak her deneysel koşul için veri çizilir. &#39;Dosya&#39; ve &#39;Dosya Aç&#39; ı tıklatın sonra verilen &#39;analysis.r&#39; dosyasını seçin. Şekil 6B çizmek için komutları uyun, <sRStudio (Şekil S2B) sol üst pencerede trong&gt; 7 ve 8. Sol üst pencerede, çizgiler 5 ve 6 çift tırnak sembolleri arasında, Geçitli verileri içeren klasörün bilgisayar adresini yazın. (&quot;: / Analiz klasör / analiz çıkışı C&quot; ve &quot;nuclei_gated.csv&quot; örneğin,) sürücü harfini ve sırasıyla dosyanın kendisi, adını ekleyin. NOT: RStudio belirli bir bilgisayarda ilk kez kullanılıyorsa, R grafik paketi &#39;ggplot2 ilk yüklü olması gerekmektedir. Bu, adım gereksiz hale bundan sonra RStudio yeni bir kurulum için bir kez tek bir adımdır. &#39;Ggplot2&#39; yüklemek için, RStudio sağ alt köşesindeki pencerenin üzerinde &#39;paketler&#39; olarak adlandırılan sekmesini tıklatın Bu altında görünen &#39;Install paketleri&#39; butonuna tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. &#39;Paketler&#39; ın içine Tipi &#39;ggplot2&#39; (atlayarak alıntılar)Bu yeni pencerede hızı ve nihayet adım 3.6 devam etmek için, pencereyi kapatmak gerekli ggplot2 fonksiyonları yüklemek ve ana RStudio penceresine dönmek için &quot;Install&quot; butonuna tıklayın. </li><li> RStudio sol üst pencerede 17 üzerinden satırları vurgulama 1, daha sonra &#39;Run&#39; düğmesine tıklayın. Bu R (Şekil S2C) deneysel veriler, eşik değerleri ve iyi konum bilgilerini girecek. R şimdi geçici olarak komplo için ilgili verileri yapacak. </li><li> Hat 17 altında kalan kod bireysel blokları vurgulayın ve daha önce olduğu gibi &#39;Çalıştır&#39; düğmesine tıklayarak gelen araziler oluşturmak. RStudio sağ alt köşesindeki pencerede araziler gözlemleyin ve &#39;İhracat&#39; düğmesine (Şekil S2D) tıklatarak biçimlerinin numarasını kaydetmek. </li><li> RStudio kapanış yaparken, istendiğinde &#39;Kaydet etmeyin&#39; tıklayın. Bu aksi takdirde veri yapacak RStudio sonraki kullanımı, karışıklığı önlerBir önceki oturumdan. </li></ol>

<ol>
	<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images.">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11 (2013).</li><li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening.">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li><li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content,+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888.">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).</li><li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response.">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).</li><li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution.">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li><li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+siRNA+screening.">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li><li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in.">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pRB+phosphorylation.">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside.">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li><li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+imaging+in+fixed+cells.">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li><li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 1-363 (2011).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 978-970 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

tarif akışı siRNA, daha sonra etiket algılama kullanarak hücrelerin çukurlu bir perturbance için bir yöntem teşkil eder ve son olarak elde edilen floresan mikroskobu görüntülerinden sayısal verilerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için yazılım destekli bir dizi aşama kullanımı. yaklaşım, birçok hücre tabanlı uygulamalarda geniş pratik uygulama vardır tek tek hücrelerin nükleer ve sitoplazmik yoğunluk değerlerinin teslim, odaklanmıştır. Burada kullanılan örnek, veri G1 fazındaki hücre döngüsü geçiş için iki floresan deneyleri test edilmiş ve geri nükleer DNA içeriğinin daha doğrudan bir biyofiziksel ölçüye ilişkili olan bir siRNA ekran ortamda elde edilmiştir. bireysel hücrelerin belirlenmesini sağlar ve ortaya çıkan &#39;Çekirdekler maske&#39; ilgili cytoplasmi tanımlamak için başlangıç ​​noktası olarak hizmet gibi görüntü nükleer DNA&#39;ya bir floresan DNA leke kullanımı, görüntü segmentasyonu sürecinde vazgeçilmez bir adımdırC bölgeleri. Kararlı biçimde hücrelerde ifade edilir GFP etiketli CDK2 raportör, ancak bu bölme tarif edilebilir tarafından sitoplazma içerisinde arka plan sinyali sürekli olarak daha yüksek bir değişken verir. Aynı analiz boru hattı için diğer uygun floresan bağlanmış habercilerin ve perturbance tepkilerini kullanılarak protein translokasyon olayların analizi için geçerli olmalıdır. Ayrıca, sitoplazma özel floresan boyalar ile GFP-CDK2 muhabiri ikame bu algoritmanın alternatif kullanım sitoplazmasında boyutlarını ve görüntüleri hücrelerin göreceli boyutlarını ölçmek için izin verecek. Burada anlatılan görüntü segmentasyonu stratejisi başka tasarım dikkate DNA ölçümü için entegre yoğunluk değerlerini sunmak için Hücre Profiler kullanılmasıdır. Yoğunluk Entegrasyon boyama verileri nukleus boyutunda olası varyasyonlar için izin nükleer DNA için değerleri ve görülen miktar profilleri için yakın bir maç temsiliçin, propidyum iyodür lekeli FACS verileri. Bununla birlikte, Entegre edilen yoğunluk, antijen floresans ortalama yoğunluğu ile örneklenen ortalama konsantrasyon, daha fazla biyolojik olarak, bir hücre bölmesi içinde protein (ve ilgili floresan) entegre toplam miktarına göre uygun olduğu proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için uygun bir araç sağlar olmayabilir. Bu nedenle yoğunluk değerleri P-S780 RB1 ve GFP verileri kullanılmıştır anlamına gelir. seçeneği Hücre Profiler yazılımı &#39;ExportToSpreadsheet&#39; panelinde bulunan iki mod (ortalama veya entegre) veri değerlendirme arasında değiştirmek için. 3_channels_pipeline.cppipe dosyasındaki analiz ayarları örnek veri setinde görüntüler için optimize edilmiştir. Bu protokol ile yeni görüntüler setleri analizi dosya adları adlandırma kuralı yukarıda (Şekil 3) tarif kabul gerektirecektir. Ayrıca, duyarlılık arka nükleer DNA boyama ve eşik parlaklığını uygun değerleriYeni görüntü setleri şiddetler Hücre Profiler ayarları içinde ayarlanması gerekebilir. DNA boyama çeşitli görüntü segmentasyonu maskeleri oluşturmak için geçerlidir kilit rolü göz önüne alındığında, bu kanal için doğru hassasiyet ayarları uygulama Hücre Profiler yazılımı ile yeni görüntü verilerinin analizine başarılı anahtarıdır. sağlanan Hücre Profiler ayarları dosyası (3_channels_pipeline.cppipe) yeni verilere analizi uyarlanması için en sık yararlı parametreler üzerine notlar içermektedir. Bu notlar Hücre Profiler ana penceresinde ekranın üst kısmındaki metin kutusuna ve hassasiyet ayarlarını değiştirme ve kanal sayısı analiz edilecek ayarlama konusunda rehberlik dahildir. Yeni görüntü verileri ayarlarını test etmek Protokol bölümünde 2.8, olarak suçlanan gibi (Şekil s1d &#39;... belirleyin Nesneler&#39; her biri için &#39;göz&#39; simgeleri açık tıklayarak protokol adımlarını görüntü analizi sırasında görüntü segmentasyonu gözlemlemek için gerekli olabilir </strong&gt;). Çekirdekler maske doğru bir DNA boyama görüntülerden tespit edilirse, özellikle, &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; üzerinden görüntü veri görselleştirme gösterir. &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; modülü için Hücre Profiler yazılımı sayfasında eşik düzeltme faktörüdür. Bu değerin Deneme ve hata düzeltmesi en nükleer tanıma hataları düzeltmek olacaktır. değerleri her görüntü için arka plan yoğunluğu karşı DNA kanalı denge. Eşik düzeltme faktörü değerleri bu daha büyük daha (net görüntüler için iyi) sıkı ve az 1 hoşgörülü (boyama ve arka plan arasındaki kontrast daha az olan görüntülere uygun) olduğunu 1, etrafında menteşe. Hücre Profiler bireysel hücre veri ham çıktı, diğer çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Burada gösterilen veriler biyolojik eğilimleri ayıklanması yardımcı olmak amacıyla hücre başına ölçülen parametrelerin iki kapılarını uygulamak için bir Perl script kullanımıEk ölçümlerle belirlenen alt popülasyonlar d izni çapraz referans. O Hücre Profiler çerçevesinde yolluk unsurları içerir eşit mümkün olsa da, burada kullanılan alternatif rota büyük veri setleri değerlendirilmesi gerekir, özellikle eğer, daha fazla esneklik ve hız sağlar. Mevcut protokol sonrası görüntü elde etme aşamalarında yavaş sahne Hücre Profiler yazılımı çalışan olduğunu. Gerekirse Hücre profil burada farklı kapı değerleri ile iteratif, daha hızlı sonraki Perl script ile tekrar analiz edilebilir bir un-kapılı ham veri seti üretmek için kapıları empoze olmadan çalıştırmak ve. Tüm çalışmalar bu gibi uygun kapı değerleri potansiyel zamanla herhangi bir veri kümesi verilen üzerinde reaktif ile değişebilir önceden bilecek. Dolayısıyla, uygun bir kapı valu belirlemek için pozitif bir kontrol ve sahte tedirgin hücreleri için hücre Profiler elde edilen ham veri dağılımı gösteren histogramlar oluşturmak için önerilirilgi parametrelerinin es. Perl script Hücre Profiler veri değişmez bir sütun yapısını kabul yazılır ve bir kullanıcı &#39;ExportToSpreadsheet&#39; ayarlarını kullanarak Hücre Profiler ile parametreler çıkış sayısını değiştirir eğer durmasına olabilir. Notlar Perl komut dosyaları içinde yer alan ayarları değişiklik uygulamak yardımcı olmak. Bu bir metin editörü komut görüntülemek görmek için, tercihen bir programcı metin editörü (örneğin, http://www.activestate.com/komodo-edit) renk kodu Perl elemanları ayarlanır. Veri formatında değişikliklere uyum için komut dosyası ayarlamak için nereye Bu notlar gösterir. Perl script benzer, görüntü analiz verilerinden rakamlar komplo için talimatlar içeren sağlanan Ar-kod dosyası (analysis.r), kullanım ve adaptasyon ek notlar görmek için bir metin editörü veya RStudio yazılımında okunabilir. Bu notlar düzenli ifadeler ve Perl &lt;ayrıntıları ile takviye edilebilirsup&gt; 12 ve veri okuma açıklamalı ve sırasıyla, çizilen nasıl temelini oluşturan her ikisi de R için ggplot2 13 paket. Floresan mikroskobu kullanarak yeni çalışmalar yanı sıra açık kaynak yayınlar tevdi ham veriler, burada tarif edilen analiz yöntemleri ile tedavi edilebilir. yüksek içerik verilerinin doğası herhangi bir gözlemci araştırma çıkarlarına bağlı olarak farklı analitik vurguları ile özyinelemeli analiz için oldukça rahat. Veri istenebilir sorular başlangıçta kullanılan prob ile sınırlı olmasına rağmen, görüntü verileri genellikle anlamlı onları üretilen çalışmaların kapsamı dışında tekrar analiz edilebilir.

Burada sunulan çalışma tek tek hücreler ve belirlenen hücre içi bölgeleri belirlemek için yapışık hücreler floresan mikroskop görüntüleri algoritma güdümlü dökümü yapmak için serbestçe ulaşılabilen yazılımın Celi Profiler kullanımını tarif eder. Bölütlemesi olarak adlandırılır bu yaklaşım, her bir hücre ya da (haliyle bölümlere ayrılmış nesneler adlandırılır) hücre içi bölgesinde lokalize floresan işaretli belirteçleri miktarının tarafından görüntüsü hücrelerin daha sonra çok parametre analizi sağlar. Bu iş akışı, yüksek içerik analizi sağlamak için bir temel oluşturur ve daha gelişmiş ve çok parametrik uyacak şekilde modifiye, bireysel hücre özel yüksek-içerik araçların veya tescilli yazılım erişimi olmayan laboratuvarlarda analizleri edilebilir bir araç olarak hizmet etmek amaçlanmıştır. Bu yazının birlikte verilen dosyalar açıklanan analiz oluşturmak için ilgili ham görüntü verileri, algoritma ayarları ve destekleyici komut bir deney seti bulunmaktadır. verilen algoritma ayarları fveya Hücre Profiler ayarlamak örnek veriler ve ayarlar diğer çalışmalardan görüntü verilerinin kullanılmasını sağlamak için gerekli olabilir ne Tartışma bölümünde detayları için optimize edilmiştir. Nicel veri Hücre Profiler kullanarak ekstre edildikten sonra, farklı laboratuvarlar ham veri bireysel hücre değerleri tarafından sunulan bilgilerin nasıl kullanılacağı için farklı gereksinimleri olabileceğini; Burada gösterilen girişler her bir deney için ham verilere uygulanan geldiği bir yaklaşımdır. Bu kapıları kullanarak, veri kapıları tarafından tanımlanan yanıtı geçiren hücrelerin alt popülasyonlar farklı tedaviler bağlayan eğilimlerin görselleştirme izin yanıt ikili açısından dönüşür. kapıları ilgili her ölçüm için uygun negatif ve pozitif kontroller için elde edilen verilerin dağılımlarının gözlemlerine dayalı ayarlanır. kapıları kullanımı, ham, hücre bazlı ölçümler yönetmek için nasıl sadece bir örnektir. Ayrıca burada gösterilen nükleer DNA yoğunluğu kullanımı benikapılı veriler ile bir arada değerleri sürekli bir dizi olarak, ham formunda asurements. Görüntü analiz verileri yönetmek Diğer yaklaşımlar çalışmanın niteliğine bağlı olarak, dikkate alınmalıdır; alt popülasyonlar hücreleri atanması için kapılarını kullanarak istatistiksel alternatifler parametrelerin çok sayıda 3 bildirilmiştir genelinde yüksek içerik verileri özetlemek için stratejiler 2 ve sistematik karşılaştırmalar bildirilmiştir. 6 - Görüntü verilerinin yüksek içerik analizleri ilaç yanıtının hücresel çalışmalarda kullanılmasını bulduk, genetik ve çevresel stres sinyalizasyon 4 ters. yüksek içerik analizi hak floresan mikroskop verilerinin analizi algoritmik nicel ve mekansal parametreler tek tek hücrelerin 7 genelinde eş zamanlı olarak dikkate alınması izin vermesinden kaynaklanıyor. Bu şekilde, birçok tahlil için hücresel sonuçları analiz: d çapraz referans diferansiyel davranış olabilirefined hücre alt popülasyonlar morfolojik değişkenlerin dikkate içerebilir deneysel koşullar ve tahlillerde izlenebilir. stratejileri ve analiz iş akışı diğer yüksek-içerik yaklaşımlar gibi, bireysel hücrelere çapraz başvurulan çoğaltılmış veri sunma yeteneğine sahiptir, burada ele. Floresan mikroskop görüntüleri oluşturmak ve binlerce görüntü kadar düşük kapasiteli geleneksel floresan tabanlı mikroskopi üretilen görüntülerin onlarca arasında değişen verilerin analizi için geçerli olan Yüksek içerik yöntemleri takım çalışmalar otomatik yüksek içerik tarama platformları kullanarak üretti. akışı ayrı deneyler nükleer floresan markörü şiddet ya da sırasıyla, bir flüoresan raportör proteininin çekirdek / sitoplazmik translokasyon ya bakımından ölçüldüğü, örnek veri ile burada gösterilmiştir. iş akışı, bu deneyler, ayrı ayrı olarak ya da kombinasyon halinde EAC bağlı olması ile esnekh farklı araştırmacılar tarafından araştırma sorusunu verilen. örnek, veri RNA interferans (RNAi), deney (Şekil 1) bir parçası olarak üretilmektedir. Susturucu RNA oligonükleotidleri (siRNA), sikline bağımlı kinaz (CDK) aktivitesinin iki floresan haberci için değişikliklere neden HCT116 insan kolorektal karsinom hücrelerinde spesifik proteinlerin demonte etmek için kullanılır. Serin nükleer retinoblastoma 780 (p-S780 RB1) olarak CDK6-bağımlı fosfatlamanın antikor lekelemesi yoluyla değerlendirilir. Aynı hücrelerde, CDK2 aktivitesi (GFP CDK2 raportör) yeşil floresan protein etiketli raportör CDK2 etkinliğinin olmaması raportör çekirdekten sitoplazmaya ve CDK2 aktivasyon servisleri üzerinde bulunan sitoplazmik oranı nükleer değerlendirilir 8. Buna ek olarak, her bir hücrenin nükleer DNA, bir DNA-ara boya kullanılarak lekelenmektedir, görüntüler çekirdek sınırları hücreleri belirlenmesi ve tanımlanması için bir araç olarak hizmet eder bisbenzimid, hem de birDNA, bolluk hücrenin hücre döngüsü durumuyla ilgili bilgileri sağlayan (Şekil 2) sa ölçer. CDK6 ve CDK2 faaliyetleri hücre döngüsünün 5 S fazına G1 hücre geçiş tespit edilebilir ve bu, tek tek hücrelerin iki muhabir arasında yakın bir uyum beklendiği gibi, birbirine 9,10 başarılı ve. Burada kullanılan gösterim veri kümesi siRNA etkisi CDK6, retinoblastom proteini (RB1) ve bir hedefleme negatif kontrol (Tablo 1) hedef bir örnek olarak analiz eder. CDK6 demonte p-S780 RB1 epitopunun bir azalmaya ve hücre döngüsünün G1 fazında hücrelerin birikmesi hem ortaya çıkarmak gerekir. RB1 Knockdown fosfo-S780 antikorunun özgünlük için bir reaktif kontrolü olarak hizmet vermektedir. Formalin floresan mikroskop görüntüleri floresan lekeli HCT116 doku kültürü hücreleri, algoritmik görüntü analizi için kullanılan, 11 sabit. Elde edilen sayısal veriler için kullanılançapraz-referans muhabirleri ve farklı demonte devletlerin etkisini ölçmek. Bu tür bir analiz tarafından üretilen verilerin potansiyel büyüklüğü normal analiz araçları bir meydan okuma sunabilir. Örneğin, bireysel hücre veri bazı elektronik tablo yazılımı karşılayacak daha büyük olabilir. Büyük veri setleri analizi yardımcı veri basit, yüksek tekrarlayıcı, denetimli işleme gerçekleştirmek Perl scriptleri dahildir. Perl script Belirli bir dosya adlandırma kuralı (Şekil 3) ile görüntü dosyalarını işlerken Hücre Profiler tarafından üretilen çıktı dosyaları için özel olarak yazılmış, ve analiz kullanılmak üzere kuyu başına alanların değişken numaralar için izin verir. Bu hücre alt 5 trendleri izlemek için kapı bireysel hücre deneyi verilerine sık önemlidir ve burada gösterilen her tahlil türü için önceden belirlenmiş bir dizi kapısı dayalı her hücre bayrak bir Perl script kullanımıdır. Da dahil isteğe Perl komut vardırhangi bireysel kuyuların (veya koşullar) veri sonuçlarını özetlemek, teslim: set kapısı içindeki hücrelerin ve ham tahlil puanları ortalama değerlerin yüzdesi. yanıtları tamamını veya bir kuyu içindeki hücrelerin çoğunluğunu etkileyen durumlarda veri görüntüleme ikinci, daha homojen şekilde geçerlidir. Yukarıda ele alındığı gibi, bu gibi değerlendirme yanıt olarak bir popülasyon içindeki hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı tek tek hücre veri gating ile elde daha az kullanışlıdır. açıklanan iş akışı programı siRNA veya tarif işaretleyici deneyleri ile pertürbasyondan sınırlı değildir. Çalışmalar siRNA kombinasyonu, kimyasal inhibitörleri ve radyasyon tedavisi ile doku kültürü deneyleri ve CDK6 dışındaki belirteçler ve CDK2 aktivitesi 5 değerlendirilmesi için yanıtları analiz etmek için, bu yaklaşımı kullanmışlardır. Kavramsal olarak, deneysel strateji biyolojik kullanışlı hücre içi bölgelerde çeşitli otomatik kayıt sağlarfloresan mikroskop görüntüleri mevcut olan tek tek hücrelerde. Gibi, bu yaklaşım nüfus ziyade bireysel hücreler üzerinde odaklanmak teknikleri ile atlanabilir nicel, çoğaltılmış veri ortaya biyolojik bilgiyi elde edebilirsiniz. Küçük modifikasyonlar ile tarif edilen bir yaklaşım ve analiz akışı bir floresans bazlı deney çıkışları ve hücre-biyolojik yanıtlar, kantitatif, tek tek hücre veriler sağlayabilir burada DNA içeriğinin nicel değerlendirme, çekirdek ya da sitoplazmik floresan ölçümü ya da bunların arasındaki belirteçlerin mekik İki bölme, ya tek tek ya da bir çok katlı bir şekilde ilgi çekmektedir. Yayınlama gereksinimleri artan bir şekilde yayınlanmış verileri yeniden analiz isteyen laboratuvarlar da doğrudan ilgilendiren olacak burada anlatılanlar gibi açıkça erişilebilir ham verilere erişimi ve mikroskopi görüntü analizi için ücretsiz araçlarımızdan ile aşinalık sunulması doğru eğilimi gibi.

<table><tbody><tr><td>AllStars negative control siRNA</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>Negative control siRNA.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Custom synthesis</td><td>NA</td><td>Antisense sequence: 5&#039; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Custom synthesis</td><td>NA</td><td>Antisense sequence: 5&#039; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x siRNA buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td></tr><tr><td>Nulcease-free water (non-DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>For dilution of siRNA buffer.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Transfection lipid.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td></tr><tr><td>96 well tissue culture plate</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td></tr><tr><td>Breathable membrane</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td></tr><tr><td>Neutral buffered formalin, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Non-ionic detergent</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>For plate wash solution.</td></tr><tr><td>Anti-P-S780 RB1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Rabbit monoclonal</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td></tr><tr><td>Permeabilization solution</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td></tr><tr><td>Plate wash solution</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.</td></tr><tr><td>Block solution</td><td>NA</td><td>NA</td><td>5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community Edition</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R programming environment</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Yapışık memeli doku kültürü modelleri hücrelerin davranışını yöneten kontrol mekanizmalarının anlaşılması gelişmeler tek hücreli analizi modları giderek daha bağımlı hale gelmektedir. Hücre popülasyonlarının gelen biyomarkerların ortalama değerleri yansıtan kompozit verileri teslim Yöntemleri çalışılan biyolojik sistemin heterojen yansıtan ICSI&#39;nin dinamiklerini kaybetme riski. Bu doğrultuda, geleneksel yaklaşımlar yerini ediliyor, ya da yüksek içerik mikroskobu ile değerlendirmesini sağlamak için geliştirilmiştir hücresel tahlil, daha karmaşık formlar ile destekledi. Bu deneyler potansiyel özel yazılım paketleri eşlik tarafından etkin floresan belirteçler, görüntüleri çok sayıda oluşturmak hücre başına çok parametrik ölçümler için izin verir. Bununla birlikte, nispeten yüksek yatırım maliyetleri ve bu cihazların çoğunun aşırı uzmanlaşma birçok araştırmacı için erişilebilir önlemiştir. Burada tarif a,floresan mikroskobu görüntüleri ile kullanım için uygun olan tek tek hücrelerin özel hücre içi bölgelerde birden fazla floresan markör yoğunluklarının ölçülmesi için evrensel olarak geçerli bir iş akışı. Bu iş akışı Key floresan işaretleyici yoğunluğunu bu görüntüler tek tek hücrelerin, hücre içi tanımlanan bölgelere bölüm ayırt ve teslim serbestçe kullanılabilir Hücre Profiler yazılımı 1 uygulanması bu bölgelere özgü değerler olduğunu. görüntü verileri tek tek hücre yoğunluğu değerlerinin ekstraksiyon bu iş akışının merkezi amacı ve yapışık insan hücrelerinde G1 kontrol noktası düzenleyiciler için bir siRNA ekranından kontrol verilerinin analizi ile izah edilecektir. Bununla birlikte, burada sunulan akışı hücre pertürbasyon diğer araçlarla sağlanan verilerin analizi uygulanabilir (örneğin, bileşik, ekranlar) bu ve floresan bazlı hücresel belirteçlerinin diğer formları ve laboratuarlar arasında geniş bir aralığı için yararlı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Görüntüleme.  UCL Cancer Institute.  Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir. 

Video: Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biyokimya

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Gelişim Biyolojisi

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Biyomühendislik

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biyoloji

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler