This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li><li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods:+the+optical+disector+and+fractionator.">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li><li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans.">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke;+a.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li><li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain.">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li><li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells.">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).</li><li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung:+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area.">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li><li>Hern&#225;ndez-Jim&#233;nez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage.">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Y&#233;benes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+overload,+measured+as+serum+ferritin,+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion.">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li><li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent,+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke.">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPAR&#947;+Agonist+Rosiglitazone.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPAR&#947; Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada tanıtılan serebral iskemi modeli son derece tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri 24-48 saat ve farklı yaklaşımlar 8,15,17 tarafından MCA bağlanmasından sonra 7 gün tespit verir. Bu MCAO-modelindeki çalışmalarında kullanılan hayvan sayısını en aza indirir kıyasla düşük bir ölüm oranına (% 1&#39;den az) sahiptir. Mortalite bu düşük oran elde etmek için kritik bir adım strok indüksiyon sonrası hayatta kalma bozabilecek enfeksiyonları önlemek için uygun aseptik koşullarda muhafaza etmektir. Bu MCAO model, aynı zamanda, istenen zamanda, bir ilmek ve arka reperfüzyon ile CCA ve MCA geçici ligasyonu ile bir geçiş model olarak, translasyonel araştırma 18 için klinik olarak uygun model olarak kabul edilen bir sürekli MCAO-modelindeki olarak kullanılamaz 19. Bu yöntem, başarılı bir şekilde fareler ve sıçanlar 17,20 kullanılmıştır. Bütün bu deliller ligasyon ile MCAO çoklu uygulamalarla serebral iskemi, yüksek çok yönlü bir model olduğunu gösterir. Bir critiBu tekniğin cal adım, bir stereo mikroskop altında invaziv cerrahi gerektirir; MCA yanı sıra elmacık kemiği zarar değil gibi Kraniyotomi çok dikkatli yapılmalıdır. Ancak, sahte hayvanların kullanımı cerrahi prosedür bağımlı etkilerini ayırt etmek yararlı bir araçtır sağlar (cerrahi prosedür ama CCA ve MCA ligasyonu tabi tutulur gerçekleştirilmez). Bu teknik, aşağıdaki beyin hasarı derecesi, çeşitli yöntemlerle ölçülebilir. Beyin kesit, Nissl boyama ve Cavalieri hacim daha sonra tahmin protokol hasarlı bölgenin tayini için daha kesin sağlar ve seri beyin kesitleri farklı imünohistokimyasal analiz için kullanılabilir çünkü bu tür çalışmalarda kullanılan farelerin sayısını en aza indirir. Bu metodolojinin daha iyi bir performans için, stereoloji yazılımında kullanılan uygun parametreleri seçmek için kritik (Tablo 1) inci tahmin için gerekli olacakformülü ile farklı bölgelerin e hacmi: V = 1 / ssf * Bir f * t * ΣP i (Ssf t bölümlerin ortalama kalınlığı, dilim örnekleme fraksiyonu, bir f ızgara aralığı alanıdır ve ΣP yapıya vurma noktası sayısı). ligasyon ile uzak MCAO infiltre lökosit ve immün hücre alt-popülasyonunu beyin hasarı 1-4 Aşağıdaki iltihabik sürece katılmaya 8,13 karakterize etmek yararlı olabilir. Burada, beyin, bağışıklık hücre karakterizasyonu, kesin stereolojik yaklaşımla ve daha çok sayıda lökosit subpopülasyonunun karakterize bir akım sitometri analizi için iki farklı metodolojiler öneriyoruz. Seri beyin kesit yararlanan, nötrofil sayısının ölçümü hücrelerinin örneklenmiş zekâ sayısından hücrelerinin toplam sayısını tahmin optik parçalama yöntemiyle 16, elde edilebilirha yol X tarafsız sanal sayım alanlar arasında düzgün mesafe ile bizim durumumuzda, enfarktüs bölgesini ilgi tüm bölgeyi kapsayan tarafsız sanal sayma alanlarda, Sistematik rastgele Sampled (SRS) seti, Y ve Z Bu yöntem doğru bir araç sağlar bağlanmasından sonra farklı zamanlarda, iskemik beyin total nötrofil sayısını belirlemek. Bu çalışmada gösterilmiş olmasına rağmen, bu protokol de iskemi 21 sonra diğer sızmış lökositlerin gibi iskemik beyin bulunan diğer hücre popülasyonunun doğru ölçümü için farklı nötrofil alt popülasyonlarının tahmini için kullanılabilir (monositler / makrofajlar) ve aynı zamanda hayatta kalan nöronlar tahmin ya da inme sonrası nöron ölçümü için. olanlar İskemi bölgesinde nötrofil ölçümü için, Tablo 3&#39;de gösterildiği gibi, arzu edilen alanda, doğru bir tahmin etmek için en önemli adımı, uygun parametreler seçimidir.Bu parametreler (ΣQ- ile sayılan toplam hücre sayısı, N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / tsf denklemi kullanılarak toplam pozitif hücre sayısı (K) hesaplamak için stereoloji yazılımı için kullanılacaktır parçalama, ssf asf örnekleme fraksiyonu alanı, ve TSF örnekleme fraksiyonu kalınlığı) 5 olduğu, bölüm örnekleme bölümüdür. Bu yöntem, diğer ölçüm teknikleri daha düşük olmasına karşın (örneğin, doku, temsili görüntü veya alan başına nötrofil sayısının densitometri mg nötrofil belirteçlerin analizi), bu tarafsız ve kesin sağlayan bir katı madde teknik olma avantajına sahiptir hücre sayıları ölçümü. Beyin lökosit izolasyon yaklaşım bastırılması için ihtiyacı olan in vivo boyama ya da genetik manipülasyonlar sistem olmadan anında belirlenmesi ve çeşitli immün hücre alt-tiplerinin ölçülmesini sağlar. Karakterize miyeloid p gelen sıralama sonraki hücreopulations veya immünomanyetik ayırma gibi gen veya protein ekspresyonu ile ilgili başka çalışmalar gibi çok sayıda alt baş uygulamalar için kullanılabilir. Bu yöntem ile elde edilen nötrofiller, monositler ve mikroglia doğru karakterizasyon immünohistokimyasal çalışmalar, beyin doğuştan gelen bağışıklık tepkisine aracılık farklı miyeloid hücrelerine özel fonksiyonlar tahsis sağlayan bir avantaj olarak, mevcut yöntemlere göre yüksek spesifisite sağlamaktadır. Buna ek olarak, bundan başka, kanla taşınan makrofajlar (CD11 + CD45 yüksek CD68 +) gibi, uygun bir etiket ile diğer beyin popülasyonları için genişletilebilir ve diğer merkezi sinir sistemi patolojileri ve yaralanma çalışma için uygulanabilir. Bu nedenle bu teknik beyindeki inflamatuvar yanıtın heterojeniteyi keşfetmek için önemli bir araç sağlar. Bu tekniğin bir ana sınırlama değiştirebilir olan taze beyin dokusundan lökosit süspansiyonların hazırlanması bulunduğuhücreler veya bunların antijen değişiklik aktivasyon durumu. Bu teknik, immünohistokimyasal çalışmalara kıyasla daha detaylı bir niteliksel nitelenebilmesine olanak veren, ancak bu hücre izolasyonu göre daha az hassas bir ölçümü içerir. Buna rağmen, hücre izolasyon protokolünün etkinliği diğer yayımlanmış metodolojiler 9 benzer ve etkin bir şekilde kontrol ve MCAO gruplar arasında, hatta farklı tedaviler 8 tabi MCAO grupları arasında beyin bağışıklık hücrelerinin sayısında farklılık tespit etmek için kullanılabilir. Bu protokolün kritik adımlar doku diseksiyonu, doku bozulması prosedürü ve miyelin kaldırma vardır. Doku toplama ile ilgili olarak, bir normalleşme adımı nedeniyle farklı diseksiyon performansları değişkenlik önlemek için (toplanan doku tartarak) dahil edilebilir. Buna ek olarak, farklı MCAO grupları arasında normalleştirme da enfarktüs hacmi ile oluşabilir (daha önce manyetik R belirleniresonance). Bu sorunu çözmek için başka bir yolu hem iskemik ve kontrol gruplarının tüm ipsilateral yarımküre kullanmak, hatta kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için bir kontrol olarak iskemik fare kontralateral yarımkürede kullanmaktır. Bu yaklaşım, her diseksiyon arasındaki farklılıkları önler iken, bir ana dezavantajı vardır; Bir seyreltme faktörü sadece aynı taraf korteks çekirdek ve peri-enfarktüs alanları bulunan miyeloid hücrelerin sayısını hücrelerinin toplam sayısının artırılması, ancak ilave edilir. Doku bozulması ile ilgili olarak, bu protokol beyin hücrelerinin mekanik bozulması için adımlar, enzimatik tedaviler kaçınarak ve yüzey antijeni değişiklik 9,22, inflamatuar hücre alt daha kalitatif ve kantitatif analiz için önemli bir sorun önlenmesi göstermektedir. Ilgi hücre süspansiyonu hazırlanması yanı sıra, beyin örneklerinden miyelin çıkarma downst müdahaleyi önlemek için bir tavsiye adımdırBöyle immünomanyetik hücre ayırma veya sitometri 23,24 akış gibi delmek uygulamalar. Bu durum, farklı yöntemler, örneğin sukroz veya Percoll gradyenleri, ya da anti-miyelin boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, ve hücre verimini arttırmak için kullanılan miyelin kaldırmak için Percoll kullanımı ile birlikte beyin hücre süspansiyonu izolasyonu, mekanik bozulma için farklı yöntemler karşılaştırın ve 25 Canlılığına önceki çalışmalara dayanmaktadır.

Morfolojik, fenotipik ve gen ifadesi mikrogliya değişiklikler yanı sıra ekstravazasyon ve hematojen makrofajlar ve nötrofillerin aktivasyonu beyin hasarı 1-4 aşağıdaki patofizyolojik kaskad bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bu protokol iki yaklaşım iskemik beyin farklı miyeloid hücre alt sayısını tahmin etmek ve onların fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirmek için sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda, nasıl infarkt değerlendirmek için de dahil olmak üzere, her iki distal Orta Serebral Arter geçici veya kalıcı ligasyonu (MCA) ve ortak karotid arter (CCA) oluşur farelerde serebral iskemi deneysel modelinde, bir açıklamasını sağlar stereolojik yazılımı kullanarak doğru Cavalieri yöntemi ile. iskemik beyin miyeloid hücre alt kümelerini karakterize ilk yaklaşım optik parçalama yaklaşımı 5 dayalı bir stereolojik yöntemdir. Bu en çokyaygın yaşam bilimleri stereolojik sonda kullanılan ve hata 5-7 düşük katsayılı hassas bir yüksek derecede sağlar. Çünkü bölüme dokusunun parçalanması hücre tahminine önyargı önler gibi doku, bölümler halinde kesilir Bu hücre ölçümü için en iyi seçimdir. Bu yöntem numaraları, dinamikleri ve iskemik dokuda 8 sızmış nötrofil alt popülasyonlarının fenotipik değişiklikleri tanımlamak için çok güçlü bir yoludur. İkinci karakterizasyon yaklaşımı beyin lökosit süspansiyonları izole etmek ve akış sitometri onları karakterize etmek basit bir yol sağlar Campanella ve ortak 9 bir modifiye protokol dayanmaktadır. Geleneksel imünohistokimyasal teknikler aksine, bunların diff göre miyeloid hücreler (CD45 yüksek CD11b +) Özellikleri (CD45 lo CD11b +) mikroglia arasında ayrım sağlar akış sitometrisi ve infiltreCD45 9-13 erent ifade seviyeleri. Buna ek olarak, pro-enflamatuar monositler (CD45 yüksek CD11b + Ly-6G - Ly-6C yüksek), nötrofil (CD45 yüksek CD11b + Ly-6G +) ve iskemik doku ve diğer lökositler alt grupları ayırt edilebilir. Bu yaklaşım, beyin iskemisi deneysel modellerinde nöro-inflamasyonu değerlendirmek için güvenilir ve hızlı bir deney sağlar. Bununla birlikte, doku işleme aktivasyon durumunu ve bir yarı-kantitatif karakterizasyonu sağlayan iskemik doku içinde bulunan farklı hücre popülasyonlarının numaraları etkileyebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda kan oluşumu, makrofajların ve nötrofillerin ekstravazasyon, felç sonrası beyin hasarına önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bu miyeloid hücre alt popülasyonlar farklı fenotipleri ve işlevleri görüntülemek ve seçkin olması gerekir ve doku hasarına onların düzenleme ve katkı çalışma özelliği olabilir. Kesin stereolojik yaklaşım ve bir akım sitometri analizi: Bu protokol beyin bağışıklık hücre karakterizasyonu için iki farklı metodolojiler sağlar. stereolojik yaklaşım sistematik rastgele örnekleme yöntemi ile hesaplanan tahmini faiz (enfarkte beynin) bir alanda hücrelerin toplam sayısını hesaplar optik parçalama yöntemine dayanmaktadır. İkinci karakterizasyon yaklaşımı beyin lökosit süspansiyonları izole etmek ve mikroglianın karakterizasyonu için izin flow sitometri onları karakterize için basit bir yol sunar, monositler ve iskemik doku nötrofillerin sızmış. Buna ek olarak, aynı zamanda, dözel bir ölüm oranı düşük ve Cavalieri yöntemi ile enfarktüs hacmini tanımlamak için histolojik beyin işleme prosedürü ile yüksek oranda tekrarlanabilir infarkt üretilmesi, beyin korteksi etkiler farelerde serebral iskemi modeli etails.

Burada gösterilen serebral iskemi modeli striatum sulama MCA lenticulostriatal kolları (Şekil 1) tıkalı değildir, çünkü striatal doku etkilemeden kortekste sadece görülen infarkt oluşturur. Nissl boyama ile, hasarlı alan bir hipokrom kortikal alanda (Şekil 2) olarak tespit edilebilir. Bu model Nissl-lekeli bölümlerde Cavalieri yöntemi ile tahmin MCAO (% 15.89 ± 0.28 IH) (Şekil 2) 24 saat sonra yüksek tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri ile karakterizedir. Cavalieri yöntemi ile infarkt hacmi tahmini contralesional ve ipsilesional hemisferde Gundersen hata (CE) katsayısı hem de infarkt alanı (Tablo 2) yansıyan bir düşük hata ile doğru bir yaklaşımdır. Hasar gören doku hacmi mm 3 hem de bölüm 3.2.13 formül kullanılarak% IH olarak ifade edilebilir. Buna ek olarak, tahminiipsilesional ve contralesional bölgelerin toplam hacminin enfarkte hacim düzeltilmesi için hasarlı dokuya (Tablo 2) olan yüksek değerleri bilmek ödem endeksinin hesaplanmasında sağlar. Beyin dokusunun seri kesit işleme göz önüne alındığında, bu Optik Parçalama yaklaşımı (Şekil 3 ve Tablo 4) kullanılarak, iskemik alanda, infiltre nötrofil gibi, hücre alt tamsayısının doğru tahmin gerçekleştirmek için bir avantaj alınabilir Tablo 3&#39;te gösterilen parametreler ile. Bu protokol, 24 saat sürdürüldü ve pMCAO (Şekil 3D), sonra farede 82.856 ± 8.143 48&#39;de saatte 23.328 ± 3.623 ve infarkt alanı nötrofillerin (Ly6G-pozitif hücreleri), toplam sayısını belirler. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, nötrofil infiltrasyonu doğrudan infarkt (Şekil 3E) ile ilişkilidir. T TahminiOptik Parçalama yöntemiyle nötrofil o sayı Gundersen (Tablo 4) CE tarafından yansıtılır, düşük hata ile doğru bir yaklaşımdır. lökosit izolasyonu ve karakterizasyonu protokolü flow sitometri iskemik farelerin ipsilesional yarımkürenin korteks 47.922 ± 23.174 miyeloid hücrelerin izolasyonu sağlar. Bu hücre süspansiyonu içinde bulunan toplam olayların% 10-30 ihtiva etmektedir. Hücresel enkaz (Şekil 4) ilişkili bu protokolü mevcut düşük FSC parametresi kullanılarak çekilen olayların büyük çoğunluğu. CD11 boyama CD11b + hücrelerinin daha önce belirtildiği gibi bu, 200 9&#39;da FSC eşiği ayarı ile analiz dışında olabilir ki, hücre döküntüsü, bu işaretleyici ile etiketlenmiş olmadığını göstermektedir ve (Şekil 4) daha yüksek bir FSC değerine sahip olduğunu göstermektedir. Bu yöntemle elde edilen hücre enkaz değişebilen miktarda örnek süreci o farklılıkları göstermektediring (zamanlama, doku koruma, örnek sıcaklığı, verimli miyelin kaldırma, vb) bunun için hesap edebilirsiniz. Buna ek olarak, hücre süzgeçler kullanımı da örneklerde hücresel kelepçeler yok etmek için gerekli olan; Bu aşama, hücre boyama için yapılması gerekmektedir. CD11b ve CD45 ekspresyonu göre Şekil 5&#39;te gösterilen yolluk strateji kullanarak, iskemik doku içinde yerleşik ve infiltre miyeloid hücrelerin birbirinden ayırabilir. Iskemik hemisferde bu CD11 + popülasyonu artar (Şekil 4, Şekil 5 ve Tablo 5) saf ve bu hücreler, çoğunlukla mikroglia iskemi sonrası çoğalan gösteren CD45 düşük ekspresyonu ile ilişkili olan plasebo grubu ile karşılaştırıldığında . Iskemik beyin bir CD11b + CD45 yüksek hücre alt-popülasyonu ortaya çıkması ile kanıtlandığı gibi bu fark (nedeniyle çevre hücre infiltrasyonuna Şekil 4, büyük olasılıklaŞekil 5 ve naif ve sahte beyinlerinde az sayıda olan Tablo 5). Beyin iskemi CD11b + hücre popülasyonuna infiltratların katkısı çok dinamik bir süreç 4. Bağlanması ile MCAO-modelindeki olarak,% 30 ila lezyonun büyüklüğüne ve karakterizasyonu yapılmıştır zaman bağlı olarak, toplam CD11b + hücrelerinin% 60 arasında değişebilir. Ly-6G + hücreleri gibi, özelliği Nötrofiller, bunlar CD11b + CD45% 70-80 ihtiva gibi, serebral iskemi, bu model kullanılarak iskemik fare beyninde MCAO 24 saat sonra bulunan en çok infiltre hücre popülasyonu hi. Ly-6C hi pro-inflamatuar monositlerin - hücrelerin geri kalanı çoğunlukla CD11 + CD45 hi Ly-6G bir ICSI&#39;nin vardır. Bu modelde, bu nüfus 24 den MCAO sonra 48 saat iskemik beyin bölgelerinde sayısı artacak. Şekil 1:. MCA ligasyon için cerrahi prosedür, (A) geçici kas retraksiyonu sonra, küçük bir kranyotomi fare kafatası içinde gerçekleştirilir. MCA bir düğüm veya 9/0 sütür kullanarak bir ilmek ile bağlanır. (B) MCAO modeli tarafından üretilen kortikal lezyon Temsilcisi görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Şekil 2: Cavalieri tarafından infarkt hacmi miktarının belirlenmesi. (A) Nissl-lekeli beyin kesitlerinin Temsilcisi görüntüleri kalıcı MCA bağlanmasından sonra 24 saat. yüksek büyütme Nissl boyama sonra hipocromatic alanı gösterirMCAO&#39;dan sonra hasarlı bölgeyi (çekirdek) tanımlar. Peri-Enfarktüs (PI) bölgesi de gösterilmiştir. (B) (n = MCAO sonra, seri Nissl lekeli bölümlerde 50 fare, 24 saat Cavalieri yöntemi kullanılarak% infarkt Yarımküre (% IH) olarak temsil enfarktüs hacminin sayısallaştırılması ). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Şekil 3: infarkt alanında 24 nötrofil ve bağlanmasından sonra 48 saat içinde Stereolojik miktar, Optik Parçalama yöntemi kullanılarak. MCAO&#39;dan 24 saat sonra İskemi bölgesinde infiltre edilmiş nötrofil (Ly6G-pozitif hücreleri) (A) Örnek görüntüsü. Sınırlandırılması enfarkte alanı göstermektedir. (B, C) ​​optik parçalama nötrofil ölçümü için bir optik dissektör örnekler. (D) 24 ° C&#39;da enfarkte bölgedeki toplam nötrofil miktar tayini ve 48 saat (n = 4 fare). (E)Enfarktüs 24 boyuta ve MCA bağlanmasından sonra 48 saat ile nötrofil sayısının korelasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Şekil 4:. Fiziksel parametreler (SSC ve FSC) temelinde naif, sahte ve iskemik (MCAO sonra 24 saat) hemisfer elde edilen beyin lökositlerin Temsilcisi nokta-arsa dağılım analizi CD11b (kırmızı) ifade olaylar bir nüfus tespit edilmiştir Tüm gruplarda. Bu popülasyon CD45 ekspresyonu göre kapı ve karakterize edildi. CD45 (yeşil) düşük seviyelerde ifade hücreler iskemik ve non-iskemik beyin korteksinde bulunan ve mikrogliyal hücrelere karşılık geldi. Bunun aksine, hücre (sarı) CD45 seviyeleri sentezleyen tektiniskemik yarımkürede ve plasebo grubunda daha az ölçüde bulunamadı. CD11 +, CD45 yüksek nüfusun daha fazla analizi, nötrofil (Ly-6G + hücreleri, mavi) ve pro-enflamatuar monositler (Ly-6C yüksek hücreleri, portakal), ana hücre, beyinde bulunan alt-popülasyonları bulunduğunu inme 24 saat sonra sızan olduğunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Şekil 5:. Iskemik doku infiltrasyonu miyeloid hücreleri yerleşik ayırt etmek için stratejiler yolluk CD11 + hücresi, ilk izotip floresan yoğunluğu (A) &#39;ya göre olan kapı edildi. Iskemik beyin hücre süspansiyonları bir temsilcisi nokta arsa panelinin yukarı-sağ köşesinde gösterilir. IçindeAyrıca, bu tekniği kullanarak elde edilen olayların toplam sayısı ve CD11b + olayların sayısı için tipik değerler (gösterilmiştir hayır hücre / iskemik beyin hemisfer;. (A) CD11b + hücrelerinin CD45 Floresan yoğunluğu analizi panelinde gösterilir kapılı CD11 + alt populasyonun CD45 ve CD11 ifade B. temsilcisi nokta arsa analizi panelinin yukarı-sağ köşesinde gösterilir. Buna ek olarak, iskemik beyin yarımkürede başına elde edilen CD45 lo CD45 hi hücrelerin tipik sayısı bu tekniği kullanarak (B) gösterilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Cavalieri yöntem için kullanılan parametreler </td></tr><tr><td> Bölüm Kalınlığı (t) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Dilim örnekleme fraksiyonu (ssf) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Bölümleri arasındaki mesafe </td><td> 600 mikron </td></tr><tr><td> Izgara Aralığı </td><td> 100 um </td></tr></tbody></table> Tablo 1: enfarkte doku stereolojik ölçümü için kullanılan parametreler. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sonuçlar </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Enfarktüs </td></tr><tr><td> Konum (μm²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Hacim (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Cilt için düzeltildi Projeksiyon üzerinde (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 1 &#39; </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), a (k) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Enfarktüslü Yarımküre </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Beyin Ödemi (Ips Cilt / Vol Devam) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak Cavalieri yöntemi ile, contralesional ipsilesional ve enfarktüs hacimleri temsili örnekleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colOptik kincinin için kullanılan açıklık = &quot;2&quot;&gt; Parametreler </td></tr><tr><td> Bölüm Kalınlığı (TSF) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Dilim örnekleme fraksiyonu (ssf) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Çerçeve Yüksekliği Sayma </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Çerçeve Genişliği Sayma </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> X ızgara boyutu </td><td> 230 mikron </td></tr><tr><td> X ızgara boyutu </td><td> 230 mikron </td></tr><tr><td> Güvenli Guard </td><td> 2 um </td></tr><tr><td> Optik Disektör Yükseklik </td><td> 14 um </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak optik parçalama probu ile beyin iskemi sonrasında sızmış nötrofillerin stereolojik ölçümü için kullanılan parametreler. <table border="0" cellpadding="0" cellspadans ediyorum = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Optik parçalama tarafından Nötrofiller Tahmini </td></tr><tr><td> Örnekleme Siteleri Sayısı </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Şekil Faktörü </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Toplam belirteçler Sayılan </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Optik parçalama Tahmin Nötrofiller </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak Optik Parçalama probu ile beyin iskemi sonrasında tahmin sızmış nötrofillerin Temsilcisi örneği. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Nötrofiller </td><td> Monositler </td><td> Mikroglia </td></tr><tr><td> Saf </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> Sham 24 saat </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1,124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 saat </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1,345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tablo 5: yaklaşımla sitometri Akış ile beyin iskemi sonrasında tahmin miyeloid hücrelerin Temsilcisi sonuçları.

Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Görüntüleme.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır. 

Video: Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

Fare Daimi Orta Serebral Arter ligasyon Of Uygulama

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Tıp

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

Sıçan Cremaster&#39;ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Kalıcı Serebral Gemi Tıkanıklığı<em&gt; Ile</em&gt; Çift Ligature ve transeksiyonu

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Farelerde Modelleme İnme: Distal Orta Serebral Arter Daimi Pıhtılaşma

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Geçici Serebral Hipoksi-iskemi Dayalı Bir Trombotik İnme Modeli

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Yaşlı Sıçanlarda Ortak Karotis Arter Tıkanıklığı ile Kalıcı Distal Orta Serebral Sahne Kortikal İskemi Sürekli Engelli Eğitim için

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

P10 Sıçanlarda Yenidoğan İnme Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Modeli

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.