Name: derivation of t cells in vitro from mouse embryonic stem cells
Uploaded: 2014-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

We thank Joon Kim for expert flow cytometry assistance. Research in the authors&#8217; labs is supported by the SCORE program of the National Institutes of Health (grant SC1-GM095402 to B.D.O) and the Canadian Institutes of Health Research (to J.C.Z.P.). J.C.Z.P. is supported by a Canada Research Chair in Developmental Immunology. The biomedical research infrastructure of Hunter College is supported in part by the NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) program via grant MD007599. We also acknowledge the New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) for its support of the initiation of stem cell research at Hunter College via grant C023048.

Kültür Medya, Sitokinlerle ve Jelleşmiş Plakaların 1. Hazırlık <ol><li> Yüksek glikoz ve sodyum piruvat ile Eagle Medium (DMEM) içinde Dulbecco modifikasyonu kullanılarak bir ES hücre ortamı hazırlayın. % 1 HEPES Tamponu,% 1 non-essential amino aist,% 0.1 gentamisin (50 mg / ml) ve% 0.1 (Fetal Sığır Serumu (FBS) Kalifiye% 20 ESC,% 1 Penisilin / Streptomisin,% 1 L-glutamin, ekleme 55 uM), β-mersaptoetanol eklenir. Süzme ile ES hücre ortamı sterilize edin. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre toz Alfa Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) 1 L yaparak OP9 ortamı hazırlayın. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin ekleyin. Karıştırmak için ters. Iki adet 500 ml&#39;lik alikota süzme ile sterilize edin. NOT: tozundan yapılan medya kullanımı tavsiye ve geliştirilmiş OP9 hücre bakım ve in vitro farklılaşma sonuçları elde etmek muhtemeldir. Bu yaklaşım standart bir prosedür haline gelmiştir. Ancak, biz de tha dikkatt biz bazen yeterli başarı ile önceden yapılmış sıvı α-MEM kullandık. </li><li> % 90 FBS,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) eklenerek ortam dondurma hazırlayın. Yavaşça karıştırınız ve süzülerek sterilize. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 10 ug / ml tam ortam içinde OP9 insan rekombinant Flt-3, ligand (Flt-3 L) içinde çözülmesiyle 2,000x Flt-3, ligand (10 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C&#39;de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama ile ilgili tedarikçinin tavsiyelerine uyun. Not: Flt-3L stabilitesi (4 ° C &#39;de 3 ay -80 ° C de 1 ay) kısadır. </li><li> Tam OP9 ortamını kullanarak 1,000x, IL-7 (1 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C&#39;de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama tedarikçinin önerileri izleyin (IL-7 -80 ° C&#39;de 12 aya kadar dayanır). </li><li> LİF i 7 10 adet 1:10 seyreltme ile 1,000x, lösemi önleyici faktörü (LİF) ya da (10 ug / ml) hazırlayınn, ES hücre ortamı. 4 ° C&#39;de muhafaza kısım. Kısım şişeler üzerinde üretici tarafından sağlanan son kullanma tarihini not ettiğinizden emin olun. NOT: Ürün üretim tarihinden itibaren konsantre veya seyreltilmiş formu en az 18 ay stabildir. </li><li> Jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakalar hazırlamak ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1.5 ml% 0.1 jelatin solüsyonunu ilave edin. Kaplama için en az 30 dakika izin kapakları ile oda sıcaklığında steril bir muhafaza içinde yemekler bırakın. Yemekler de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde bir gece boyunca kalabilir. Sağ cep tohumlamadan önce herhangi bir artık jelatin çözüm çıkarın. Jelatin çözüm tamamen kuyuda kurumasına izin vermeyin. </li></ol> 2. Hazırlık ve Besleyici Hücreleri ve Fare Embriyonik Kök Hücreleri Bakım (Mesc) NOT:% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör tüm hücreleri inkübe edin. <ol><li> Çözülme Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF) <ol><li> Donmuş bir flakon (~ 5 x 10 6 Hızlı-çözülme </sup&gt; hücre / mitomisin C ile tedavi (veya başka mitotikal tutuklandı) MEF&#39;lerin flakon) ve onları bir 15 ml tüp transfer. </li><li> Yavaş yavaş dondurma ortamından DMSO sulandırmak için damla damla olarak, çözülmüş hücrelere ES hücre ortamı 8 ml ilave edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 400 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve ES hücre ortamı, 3 ml hücre pelletini. </li><li> Önceden ısıtılmış ES hücre ortamı 33 ml 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü hazırlayın. 36 ml nihai hacme getirmek üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş MEF&#39;lerin 3 ml ilave edilir. </li><li> İki jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakaların her bir kuyunun içine yeniden süspanse MEF&#39;lerin 3 ml dağıtın. Hücreler takın ve onlara mESCs, tohumlamadan önce yaymak için izin vermek üzere en az altı saat süreyle tekrar inkübatör içine tabak yerleştirin. Medya her 2-3 günde bir değiştirilir ise bu mitotikal tutuklandı besleyici katmanlar, ilk ekimden birkaç gün boyunca kullanılabilir olabilir. NOT: Taze tutuklandı MEF&#39;ler da kullanılabilir. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Tohumlama mESCs <ol><li> 37 ° C su banyosu içinde dondurulmuş Mesc klon ile bir şişe hızlı çözünmesi ve 2.1.1-2.1.3 tarif edildiği gibi hücrelerini hazırlamak. NOT: Bir 6-çukurlu plaka bir birleşik kuyusundan Mesc 2 şişe dondurma. </li><li> (Adım 2.1.5 hazırlandı) tutuklandı MEF tek tabakasıyla 6-plaka (Mesc klonu itibarıyla) bir kuyudan ortamları çıkarın ve MEF tek tabaka üstüne mESCs ve 3 ml tohum. 1,000x LİF (10 ng / ml), 3 ul ekleyin. Kuvöz içine yemekleri dönün. </li></ol></li><li> ES hücre bakım ve tripsin aracılı geçit NOT: Mesc izdiham göre değiştir günlük medya, ya da bölünmüş. Optimal, hasat ve split / yeniden-plaka hücreleri her gün. <ol><li> ES hücre ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile mESCs yıkayın. PBS çıkarın. % 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve 3-5 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tripsinize hücreleri toplamak ve 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine transfer edin. Şiddetle m topaklannı kırmaya hücre süspansiyonu pipetleyinEKH. Tripsin nötralize etmek için hücre süspansiyonu tam ES hücre ortamı 2 ml ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri. Süpernatantı ve 3 ml ES hücre medya pelletini. </li><li> Hazırlanan tutuklandı MEF tek tabakaları ihtiva eden 6 oyuklu plakalar ortamı çıkarın. Her bir oyuğa ES hücre ortamı, 3 ml (istenilen bölme oranına göre) hücre süspansiyonu uygun miktarda ekilmiş edin. 1,000x LIF 3 ul ekleyin. 2 gün içinde geçiş için hazır olacak 6: Birleşik bir Mesc de 1 bölün. </li></ol></li><li> OP9 / OP9-DL1 hücrelerin bakım <ol><li> OP9 hücrelerin bir şişe çözülme (adımları izleyin 2.1.1-2.1.3 OP9 medyayı kullanarak) </li><li> 10 cm doku kültürü çanak 7 mi OP9 ortam ekleyin. Plaka boyunca hücrelerin dağıtılması, damla damla bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 3 ml ilave edilir. Gece boyunca inkübatör içinde hücreleri yerleştirin. </li><li> Ertesi gün hücrelerin OP9 izdiham kontrol edin. Çanak birçok ölü yüzen hücreleri içeriyorsa, remoOrtamı ettik ve taze ortam OP9 10 ml ekleyin. Neredeyse tam izdiham görülmez ise inkübatör tabak dönmek. 4 yakın birleşik OP9 monolayer: Split 1 (tripsin kullanarak). NOT: Tabaklar yaklaşık 2 gün içinde tekrar aynı izdiham düzeyine ulaşması gerekir. Aşırı yapışık hale OP9 hücreleri bırakmamaya özen gösterin. </li><li> Genişleme hisse senetleri gibi OP9 hücrelerin erken pasajlar dondurun. NOT: konfluen 10 cm çanak yakın birinden OP9 hücrelerin 2 şişe dondurma. Genişletme stoklar Her bir ampul, aşağıda daha ayrıntılı olarak Mesc ko-kültür deneyleri kullanılan çalışma stoğu oluşturmak için çoğaltılabilir. Değişen sıcaklıklara olumsuz donar kalitesini etkileyebilir, çünkü daha -80 ° C&#39;de derin dondurucuda daha sıvı azot içinde dondurulur, tüm OP9 stokları tutun. </li></ol></li></ol> 3. OP9-DL1 Ortak kültür Prosedür <ol><li> Eş-kültür preparatlar <ol><li> Yaklaşık bir hafta önce, bir ortak-kültürünün başlatılmasından MEF&#39;ler, mESCs ve OP9 Hücre çalışma STO çözülmecks. OP9-DL1 hücrelerinin ko-kültür gününde 8 kadar gerekli olmadığından, ko-kültür başlangıcından sonraki ilk üç gün boyunca OP9-DL1 hücrelerini eritin. Bakım ya da gerektiği gibi tüm hücreleri dondurmak. </li><li> Deneyin ölçeği dayalı gün 0 ko-kültür ile% 80 kaynaşmaya eriştikten hazır OP9 hücre tekli katmanları, 10 cm tabaklar başlangıç ​​sayısını belirlemek (örneğin, Mesc klonların sayısı ve ayırt edilmesi için ortak-kültür zaman noktalarının sayısı ile ) analiz edilebilir. 4 ve 1: bir ko-kültürü hazırlamak için, 1 ila OP9 hücrelerinin konfluent çanak yakınındaki bölme 6 iki gün önce mono tabakalar gerekli olacaktır ne zaman. NOT: Bir ÇIK klon başına en az bir levha gerekir. Gün 5 pasaj altı tabak tohum için yeterli hücrelerin vermelidir 0. günde (aşağıda tarif edildiği gibi), genellikle, tek bir ESC klon, tek bir plaka üzerinde tohumlandı. Her gün 5 tabak bir sonraki analiz zaman noktasını sağlayacaktır. </li><li> OP9 monokatmanlar sürekli ko-kültür geçişi için gerekli olacak bu yana, bakımı her zaman HAYATIMIN almakko-kültür ile paralel olarak ilave OP9 kültür plakalarının yeterli sayıda. </li></ol></li><li> Gün 0: ortak-kültürünün başlatılması <ol><li> 2.3.1-2.3.4 gibi Mesc toplayın. Hücreleri saymak. </li><li> Her bir klon için Mesc plaka başına OP9 ortam, 10 ml 5 x 10 4 Mesc hazırlar. NOT:. Biz kullanılan olmasına rağmen, biz alternatif bir orta α-MEM,% 10 FBS oluşan ve 5 x 10 β-mercaptoethanol da farklılaşma ko-kültürlerinde kullanılmak üzere rapor edilmiştir -5 M 10 unutmayın </li><li> OP9 yemekleri eski ortamları çıkarın ve plaka boyunca eşit hücrelerini dağıtmak için özen yemekleri Mesc süspansiyonu 10 ml ekleyin. 37 ° C inkübatör yemekler yerleştirin. </li></ol></li><li> 3. Gün: Medya değişiklik <ol><li> Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Koloniler üzere parlaklık kaybetmek ve basık görünür başlamalıdır. </li><li> Yemekler ortamı kaldırın ve yavaşça taze OP9 10 ml ekleyinmedya. </li><li> Inkübatör ko-kültür yemekleri dönün. Görsel kolonilerin% 80-90 görsel mezoderm-benzeri morfolojiye sahiptir ~ kadar gerçekleştirilemeyen gereken bir sonraki geçidin (gün 5) için, besleyici OP9 tek tabaka hazırlama zamanlama bilgi günlük mezoderm gibi koloni oluşumunu izlemek. 5 gün hücre transferi, aşama fazla erteleme 2 gündür. </li></ol></li><li> 5. Gün: ön-kaplama ile Tripsin aracılı geçit. NOT: optimal konfluen OP9 hücreleri ile önceden 10 cm yemekleri yeterli sayıda hazırlayın. Ko-kültürler görsel aşama 3.3.3 açıklanan özellikler gösterir yalnızca sonraki adımlara devam (ayrıca Temsilcisi Sonuçlar bakınız). <ol><li> Ko-kültür yemekleri ortamı çıkarın. Yıkamak için 4 ml PBS ilave edin. PBS girdap ve çıkarın. % 0.25 tripsin 4 ml ilave edilir ve ~ 5 dakika boyunca inkübatör yemekler yerleştirin. </li><li> Dikkat ederek kadar, aşırı hava kabarcıkları tanıtmak için, güçlü pipetleme ile tripsinize edilmiş hücre katmanı bozabilirHomojen, çoğunlukla tek bir hücre süspansiyonu elde edilir. </li><li> Tam OP9 medya 4 ml ekleyin ve pipetleme karıştırın. 30 dakika boyunca inkübatör yeni, boş bir 10 cm çanak ve yerine hücreleri aktarın OP9 hücreleri çanak uymak için izin vermek. Bu &quot;ön kaplama&quot; aşaması eş-kültür bir sonraki adıma aktarılmıştır OP9 hücrelerin sayısını azaltır. </li><li> 40 mikron hücre süzgeçler ile 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın. </li><li> Ön kaplama çanak yapışkan olmayan hücreler toplanır ve daha sonra tüpe hücre süzgecinden yoluyla geçmektedir. 6 ml PBS&#39;de hafifçe bulaşık yıkama ve arkasında bağlı OP9 hücreleri bırakarak aynı süzgecinden geçirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 400 x g&#39;de 5 dakika santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı ve tam OP9 medya 3 ml pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Hücreleri saymak. </li><li> Optimal Konfluent OP9 hücreleri ile 10 cm plakalardan ortamı çıkarın. </li><li> Her analiz zaman noktası için, OP9 mono 5 x 10 5 hücre tohum10 ml nihai hacim içinde katmanı. </li><li> 5 ng / ml insan rekombinan Fit-3L ekleyin ve inkübatör yemekler yerleştirin. </li></ol></li><li> 8. Gün: Hematopoetik progenitör Hücre (HPC) koleksiyonu NOT: Bu aşama için süre içinde bu olacağı şekilde önceden OP9 veya OP9-DL1 hücre mono tabakaları ile 6 oyuklu plakaların yeterli sayıda Hazırlama ~% 80 konfluent. <ol><li> 40 mikron filtreli, 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın. </li><li> Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Yüksek basınçlı bir parlak kümeleri gevşek OP9 tek tabaka eklenmesi gerekmektedir. Bir pipet ile OP9 tek tabaka ve yemeğin üzerine mevcut medya yıkanması (ama aşırı rahatsız değil) mümkün olduğunca bu hücrelerin birçok toplayın. Köpük oluşumu önlemek için, her zaman bu HPC toplama / yıkama aşaması sırasında pipet ucuna ortamın en az 1 ml bırakın. </li><li> Bir tüp içine 40 um süzgecinden hücreleri geçirin. , Tüm HPC aynı plaka 8 ml PBS ilave edin ve bir mikroskop altında kontrol bizyeniden toplandı. Daha kuvvetli bir yıkama ile (eğer gerekli ise) PBS Yıkama / toplama aşamasından tekrar edilmelidir. Zaten aynı Hücreleri plakadan içeren tüp içine hücreleri süzün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> 5 ng OP9 ortam (levha, 5. günde tohumlanır başına) 3 ml &#39;lik bir ana karışımı hazırlayın / ml Flt-3L ve 1 ng / ml IL-7. </li><li> Fit-3L + IL-7 ana karışımı ile OP9 medya (işlenen her 10 cm çanak için 3 ml) süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. OP9 hücrelerine sahip bir 6-yuvalı plakanın bir oyuğuna Her levhadan toplanan hücreler aktarın. <ol><li> , Monositik, B hücreleri ya da eritroid soylar doğru pillerinin OP9 hücreler üzerine hücreler toplandı tohum için. T hücreleri elde etmek için, OP9-DL1 hücre mono tabakaları üzerine hücreleri tohum. </li></ol></li><li> Inkübatör içine 6 oyuklu plakalar yerleştirin. </li></ol></li><li> Gün 10: Medya değişiklik <ol><li> Her biri farklı klon Mesc besleyici hücre tipi Combina bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayınko-kültür tion. </li><li> Flt-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml &#39;si ile OP9 ortamın bir ana karışımı hazırlayın. Her bir oyuk için 3 ml hazırlayın. </li><li> Yavaşça aynı ESC klon besleyici hücre tipi kombinasyonunu içeren çoklu ortam çukurlardan birleştirerek 6 oyuklu plakanın her bir medya toplar. </li><li> Her bir kuyuya OP9 ortam ana karışımı 2 ml (3.6.2) ekleyin. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de toplanmıştır ortam. Kuyu başına OP9 medya ana karışımı 1 ml her pelet (görünür eğer çok küçük) (3.6.2 bakınız) başlangıçta adımda 3.6.3 toplanan süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon. </li><li> Lütfen, her oyuğa ortam başlangıçta 3 ml her bir hazne içinde toplanmıştır hacmi getiren başka içine hücre 1 ml dağıtın. Inkübatör yemekleri dönün. </li></ol></li><li> Gün 12: Hayır tripsin pasaj Not: Bu s onlar optimal zamanında birleştirilebilmeli böylece önceden OP9 veya OP9-DL1 hücreleri ile 6 oyuklu tabaklarda yeterli sayıda hazırlayındım. Gün 12 geliştirme eritrosit, monositik ve erken evre T hücreleri akış sitometrisi analizleri için idealdir. <ol><li> Bir ana karışımı Fit-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml &#39;si ile OP9 ortam (ko-kültür içinde devam edecek her çukuruna 3 ml) hazırlayın. </li><li> 40 um süzgeçler (ko-kültür, her klon-ESC besleyici hücre tipi kombinasyon için bir adet) ile 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü hazırlayın. </li><li> Kuvvetlice kuyuda (tek tabaka da dahil olmak üzere) tüm hücreleri parçalamak için her bir oyuğa mevcut ortamı pipetle. Tek bir hücre süspansiyonu andıran bir kıvama gelinceye kadar güçlü pipetlenmesiyle devam edin. </li><li> Tüp içine süzgecinden toplanan hücreler geçirin. Kalan tüm yıkama hücreleri ve toplamak için, her bir oyuğa PBS 3 ml ilave edilir. Aynı süzgecinden hücrelere geçerler. Aynı ESC klon-besleyici hücre tipi kombinasyonu içeren çoklu kuyu hücreleri birleştirin. </li><li> Kullanılan hücre süzgeç atın ve bir kuyuya bir kısım eşdeğer kaldırmak (~ 6 ml) İstenilen için(ya da başka) akış sitometrisi o gün yürütülecek analiz eder. Kullanımdan önce buz üzerinde, bu alikotları saklayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Süpernatantı. Oyuk başına ana karışımı 3 ml, 50 ml santrifüj tüpünden elde edilen pelet yeniden tohumlu edilmesi. Uygun besleyici bir hücre tipi için her hücre süspansiyonu, göz başına 3 ml ilave edilir ve kuluçka makinesi içindeki yemekler yerleştirin. </li></ol></li><li> Gün 14: Medya değişiklik <ol><li> Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin. </li></ol></li><li> Gün 16: Hayır tripsin pasaj NOT: Bu aşama için önceden en uygun konfluent OP9 veya OP9-DL1 hücreleri, 6 oyuklu kapları hazırlayın. NOT: Flow sitometri B lenfositleri ve orta evre T hücrelerinin analizleri için günlük 16 idealdir. <ol><li> Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin. </li></ol></li><li> Gün 18: Medya değişiklik <ol><li> Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin. </li></ol></li><li> Gün 20: Hayır tripsin pasaj NOT: Gün 20 iAkış sitometri için s ideal bir T hücrelerini gelişmekte geç sahneye orta analizleri. <ol><li> Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin. İstenirse, hücreleri son gün 20 alternatif medya değişikliği ayırt taşımak ve hiçbir tripsin lenfosit genişleme oranı günlük izlenmesi ile, her iki gün geçitleri. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro.">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li><li>Pui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+expression+in+early+lymphopoiesis+influences+B+versus+T+lineage+determination.">Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination.</a> Immunity. 11, 299-308 (1999).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1101 (1994).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li><li>Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-2-deficient+blastocyst+complementation:+an+assay+of+gene+function+in+lymphocyte+development.">RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).</li><li>de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cell-derived+prehematopoietic+progenitors.">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors.</a> Blood. 102, 1649-1653 (2003).</li><li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+autophagic+protein+beclin+1+early+in+lymphocyte+development.">A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development.</a> J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).</li><li>Lahiji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+TCR-alpha+gene+locus+control+region+activity+in+T+cells+derived+in+vitro+from+embryonic+stem+cells.">Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells.</a> J Immunol. 191, 472-479 (2013).</li><li>Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+embryonic+stem+cells+into+endothelial+cells+in+an+in+vitro+model+of+vasculogenesis.">Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.</a> Blood. 93, 1253-1263 (1999).</li><li>Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+lineage+analysis+by+cell+sorting+and+culture+identifies+FLK1+VE-cadherin++cells+at+a+diverging+point+of+endothelial+and+hemopoietic+lineages.">Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages.</a> Development. 125, 1747-1757 (1998).</li><li>de Pooter, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+requires+GATA-2+to+inhibit+myelopoiesis+from+embryonic+stem+cells+and+primary+hemopoietic+progenitors.">Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors.</a> J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).</li><li>Watarai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+NKT+cells+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+bearing+rearranged+invariant+Valpha14-Jalpha18+TCRalpha.">Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha.</a> 115, 230-237 (2010).</li><li>Pipkin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+transfer+activates+and+delineates+a+locus+control+region+for+perforin.">Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin.</a> Immunity. 26, 29-41 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

OP9-DL1 ko-kültür sistemi, kök hücreleri, kan hücre tiplerinin gelişimi esnasında, gen rolünü incelemek için kullanılmıştır. 8,12,13 Ayrıca gen düzenleyici DNA fonksiyonlarını incelemek için etkin bir modeli olduğu kanıtlanmıştır hücre farklılaşması sırasında. 9,14 zaman ve hematopozun birçok temel soruları deneylerin maliyeti önemli ölçüde tasarruf elde edebilirsiniz tüm fare modellerine alternatif olarak bu yaklaşımı kullanarak. Bununla birlikte, bu amaçla...

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.1 This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.2 The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells3 with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).4 Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture &#8220;microenvironment&#8221; that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models5 and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.6 The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals. 
We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.7 We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos8 and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.9 We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this &#8220;day 5&#8221; passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Stem cell qualified FBS</td><td>Gemini</td><td>100-125</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>TMS-003-C</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &amp;mu;m PES membrane</td></tr><tr><td>Cell Culture Grade Water</td><td>Corning</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12000-022</td><td>Powder, reconstitute per manufacture recommendation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>SH 30396.03</td><td>Testing of individual lots required&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Flt-3 Ligand</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-7</td><td>PeproTech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>LIF&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Utrapure water with 0.1% gelatin</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEFs mitomycin C treated</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>Any mitotically arresteded MEFs can be used</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40 &amp;mu;m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100 x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6-well</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td>Tubes for FACS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ES R1 cells</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td></td></tr><tr><td>OP9 cells</td><td></td><td></td><td>Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).</td></tr><tr><td>OP9-DL1 cells</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Cells can be requested from the Z&amp;uacute;&amp;ntilde;iga-Pfl&amp;uuml;cker laboratory.</td></tr><tr><td>FlowJo software&amp;nbsp;</td><td>Tree Star</td><td></td><td>FACS data analyses</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab</td></tr></tbody></table>

derivation of t cells in vitro from mouse embryonic stem cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

LİF mevcudiyetinde MEF&#39;ler üzerinde yetiştirildiğinde, mESCs farklılaşmamış bir halde muhafaza edilebilir. İdeal koşullar altında, bunlar faz kontrast mikroskopisi parlak bir halosu ile çevrili olan hücrelerin yoğun kolonileri (Şekil 1) olarak görünür. Bu kültürler günlük olarak takip edilmelidir. Hücrelerin birleştiği bağlı olarak, ortam değiştirilebilir ya da hücre ayrılabilir. Komşu Mesc koloniler birbirleri ile temas noktasına gelmemeli. Farklılaşmamış mESCs ...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

derivation-of-t-cells-in-vitro-from-mouse-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

10.9K Görüntüleme.  City University of New York. Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Video: Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biyoloji

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Kanser Araştırmaları

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

<meta charset="utf8"></head><body>Akış Sitometrisi Kullanılarak Naif CD4+ T Hücrelerinden Th17 Hücre Farklılaşması

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Sitokin Konsantrasyon Modülasyonu Kullanarak Th17 Hücrelerinin Yüksek Saflıkta İn Vitro Farklılaşmasının Elde Edilmesi

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Farede Naif CD4+ T Hücrelerinin Patojenik Th17 Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

T hücrelerinin türetilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler