Pasteur Enstitüsü, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant &#39;lenfopoiezis&#39;), REVIVE Gelecek Yatırım Programı ve &quot;contre le Kanser La Ligue&quot; tarafından desteklenir.

Etik deyimi: Bütün deneyler Fransız Tarım Bakanlığı tarafından onaylanmış Pasteur Enstitüsü Etik Şartı göre gerçekleştirilen ve AB direktiflerine bulundu. Fransa Tarım Bakanlığı tarafından onaylı küçük kemirgen cerrahisi eğitimi olan bir manipülatör, tüm cerrahi müdahaleler yapar. NOT: 5 aşamalı planı prosedürünü gösteren Ek Tablo 1&#39;de bakın. Embriyolar 1. Seçim <ol><li> 36 C57BL / 6 CD45.2 kadın, 12 kadın CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 erkek ve 12 C57BL / 6 CD45.2 erkekler kullanın. Erkek genotip ile ya kadın Geçiş embriyolar CD45.1 / 2 ve CD45.1 alıcı timik lobların bir kaynak olarak kullanılabilir veya TSP CD45.2 bir kaynak olarak kullanılabilir üretecektir. Ev tek bütün erkekler. </li><li> , E18 TSP izolasyonu için embriyolar elde 21 gün aşılama deneyden önce 06:00, az bir erkek CD45.1 ile bir kafes içinde 2 kadın yerleştirmek için. Öğleden önce, ertesi gün bir vajinal fiş varlığını kontrol edin. Sepatakılı kadın oranı. </li><li> E14 embriyolar elde etmek için TSP tarafından kolonize edilmesi, 17 gün aşılama deneyden önce erkek CD45.2 kullanarak, (1.2) Yukarıdaki işlemi tekrarlayın. </li><li> E13 TSP izole etmek için embriyolar elde etmek için, 16 gün aşılama deneyden önce, erkek C57BL / 6 CD45.1 kullanarak, (1.2) Yukarıdaki işlemi tekrarlayın. </li></ol> Bir yatay Laminar Flow Hood altında Embriyolar 2. diseksiyonu NOT: aşılama deneyden önce iki gün. <ol><li> Bir doyurarak kapalı bir odada, en az 5 dakika boyunca, servikal dislokasyon ile veya CO2 gazı aşamalı uygulama hamile kadın Kurban. Kardiyo-solunum hareketlerinin kesin tutuklama ile ölüm sağlayın. % 70 etanol ile karın ıslak. </li><li> Orta hat karın derisinde uzunlamasına bir kesi yapmak ve birbirinden cilt çekerek açın. Sindirim sistemi dokunmadan forseps ve makas ile periton açın. Bifid uter çekinBizim makas ile vajinadan ayırmak ve. </li><li> 40-50 ml DPBS içeren 90 x 15 mm Petri kabındaki rahim yerleştirin ve her embriyonun desidua arasında enine kesti. </li><li> Ince uçlu makas çifti ve ince forseps ile rahim kas membran kaldırmak plasenta ve yolk kesesi arasındaki kesim tarafından embriyoların almak ve embriyoların istinat olduğu amnios kaldırmak. </li><li> Petri kabı embriyolar yerleştirin HBSS +% 1 fetal buzağı serumu içeren 90 x 15 mm (FCS) üretildi. E15 daha embriyolar yaşlı için, başka diseksiyonu önce bir makas ile kafaları çıkarın. </li></ol> Thymus 3. İzolasyonu <ol><li> Binoküler büyütücü mercek altında, ıslak bir gazlı yatak üzerinde, yatar pozisyonda (ventral görünüm) yatan, embriyo yerleştirin. </li><li> Uzunlamasına sternum kıkırdak boyunca bir forseps yerleştirin çimdik ve göğüs ızgara açın. Kavisli bir forseps ile t görselleştirmek için bir kenara göğüs duvarı çekintrakea her iki tarafında hymic loblar. </li><li> Dikkatle ince bir forseps ile altında sıkıştırılarak her lob tutun ve 1 ml HBSS +% 1 FCS içeren bir Petri kabındaki koyun. Lobları yalıtmak ve kapsül zarar vermeden, iki 1 ml şırınga + 26 G ⅜ &quot;iğneler ile çevresindeki bağ dokusu çıkarın. </li><li> Kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için HBSS +% 1 FCS, 3 ml loblar yıkayın. Not: E15 önce, timik loblar iki-lob organı teşkil etmek ortasında trakea ve daha sonra sigorta her iki tarafında yer almaktadır. </li></ol> 4. Hücre süspansiyonları <ol><li> HBSS +% 1 FCS 1 ml şırınga üzerine monte edilen iki 26 G iğne ile, binoküler büyütücü mercek altında lobları ayrı kızdırmak. Bir naylon örgü ile hücre süspansiyonu Filtre. </li></ol> Floresan Antikor ve Hücre Sorting 5. Boyama NOT: Tüm antikorlar daha önce nüfus optimal tanımı (titrat elde etmek için titre ediliriyon) antikor, parti ile değişebilir. <ol><li> Soy pozitif hücreleri boyamak için biyotinile edilmiş antikorların bir karışımı içinde bir 100 ul ile 4 ° C sıcaklıkta, 15-30 dakika boyunca timositleri (E13 ya da E18) inkübe (anti-CD19, anti-Gr1 anti-Ter119 anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Antikorlar 7 dakika boyunca 280 xg&#39;de 4 ml HBSS +% 1 FCS tüpler aşağı spin uzakta fazlalığının yıkamak için, süpernatant ortadan kaldırmak ve yeniden askıya taze HBSS +% 1 FCS pelet. Santrifüj tekrarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca streptavidin ile mikro E18 biyotin-etiketli hücreler inkübe ve iki kez HBSS% 1 FCS hücreleri yıkayın. 2 ml HBSS +% 1 FCS hücreleri yeniden askıya. En E13 timositleri soy negatif ve bu nedenle hücre sıralama öncesinde MACS zenginleştirme gerekmez. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre, LS sütun üzerinde hücrelere geçerler. Tüm hücre süspansiyonu girdiğinde sütun 2 ml HBSS +% 1 FCS ekleyin. KurtarmakSütun 4 ml 280 x g&#39;de, 7 dakika boyunca hücreler akmasına ve santrifüjlenir. </li><li> Yeniden askıya tükenmiş E18 ya TSP antikor karışımı, 50 ul (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 ve streptavidin Pacific Blue toplam E13 timositlerin ya pelet ) ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 ml HBSS +% 1 FCS ve hücreleri yıkayın 1 ml HBSS propidium iyodür ile +% 1 FCS hücreleri yeniden askıya. </li><li> Sıralama TSPs Lin - 200 ul komple ortam +% 20 FCS içeren bir 1.5 ml tüpler üzerine (4 lazerler ile) FACS CD44 + CD117 + CD24 düşük CD127 + CD135 + hücreler. FSC ve SSC kanallarda boyutu ve ayrıntı gibi kapı İlk hücre. (Propidyum iyodür ile boyama), ölü hücreleri, kapı dışarı çiftleri ortadan kaldırmak ve üstel ölçeklerde floresan puan. 100 civarında veya 600 TSPs bir E13 ya da bir E18 timus, respectiv elde edilebilirely. </li></ol> Progenitörlerin 6. Kolonizasyon E14 ve Timik lobları: Asma Bırak Tekniği <ol><li> (30 Griler = 30 Gy) CD45.2 embriyolardan E14 timik lobları, kültür önce 3 saat ışın tedavisi. NOT: E14 veya E15 timik loblar başarılı bir şekilde, T hücresi soylarının alıcı olarak kullanılmıştır. Erken gebelik günlerde timik lob kötü geliştirmek ise muhtemelen epitel hücrelerinin eksik gelişimine nedeniyle organın büyük boyutuna erken nekroz sonraki gebelik günler sonuçlarının alıcı timus lobları kullanma. </li><li> Santrifüj TSPs ve yeniden askıya hücreleri kültür ortamında (% 10 FCS ile OPTI-MEM tam ortam, penisilin (50 birim / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve 2β-merkaptoetanol (50 uM)) kriteri şekilde 35 ul 500 TSP içerir. </li><li> 60 de Terasaki plakanın her sıra hücre süspansiyonu, 35 ul damla yerleştirin. NOT: bitişik kuyular yerleştirilir eğer 35 ul damla sigorta olabilir. </li><li> Her damla yüzeyinde biri ışınlanmış lobunu yerleştirin. Terasaki plakasını kapatın ve hücreler yerçekimiyle damla apikal kutbu ulaşmak izin ters plaka çevirin. </li><li> Hit yavaşça ters plakanın üst tarafı damla apikal kenarına slayt lobları zorlamak için. 37 ° C ila +% 5 CO2 seviyesinde 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde ters Terasaki tabağı inkübe edin. Bir alıcı yetişkin fare 8 böbrek kapsülü altında kolonizasyon ya kültür E14 FTOC 7 Thymi veya greft sonra. </li></ol> 7. Fetal Timik Organ Kültürü <ol><li> 35 mm Petri tabağına tam ortam 3 ml yerleştirin. Ortam üzerinde yüzen bir isopore zar filtresi yerleştirin. Forseps (bir membran üzerinde en fazla 8 lob) zarın kenarında yeniden loblar yerleştirin. </li><li> Su sağlama 2. ml içeren, kapaksız, bir 35 mm çanak ile birlikte, bir 90 mm Petri kabı içinde timik lobu içeren Petri kapları yerleştirinr, uygun nem sağlamak. 37 ° C ila +% 5 CO2 seviyesinde 12 gün inkübe edilir. </li></ol> Steril Koşullarda Böbrek Kapsül altında 8. Greftler Not: Böbrek parenşiması bir kapsül oluşturan bağ dokusu ile çevrilidir. Alt kapsül bölge kan ve böylece greft gelişmesi için uygun bir ortam (örneğin timik lobları, pankreas adacıkları veya yenidoğan kalpleri) sağlayan lenfatik damarlarda özellikle zengindir. Doğru böbrek daha erişilebilir olduğundan greftler genellikle sol böbrek yapılır. CD3 - / - erkek fareler E15 önce cinsiyet belirleme kolaylıkla yapılabilir çünkü alıcılar böylece nedeniyle Y kromozomu bağlantılı küçük doku uygunluk antijenleri konakçı tepkimesiyle kaçınarak olarak kullanılmıştır. <ol><li> Aletleri sterilize ve ameliyat boyunca steril eldiven giyin. Ketamin 10 mg / ml + Ksilazin, 1 mg içeren bir çözeltiye içi enjeksiyonu ile fare anestezisi /ml PBS içinde seyreltilmiş (10 g vücut ağırlığı başına 50-100 ul), bir 1 ml şırınga ile. Interdijital reflekslerin eksikliğini kontrol ederek anestezi doğrulayın. Anestezi sırasında kurumasını önlemek için her gözün üzerine hidro-Optimune jel damla yerleştirin. NOT: Çözelti ekstemporane şekilde hazırlanır ve enjeksiyondan önce oda sıcaklığında ısıtılmalıdır. Anestezi en az 20 dakika sürer. Anestezi derecesi, tüm ameliyat boyunca kontrol edilmelidir. Anestezi, her 20 dakikada bir doz devre içi enjeksiyonu ile uzatılabilir. </li><li> Yatay lamina akış kaputu altında, onun sağ tarafta fare yerleştirin. % 70 etanol ve% 10 iyodid dermal çözeltisi ile cerrahi alanında sterilize edin. Bir forseps kısmı ile sadece arka bacak eklem üzerinde 2 cm uzunluğu boyunca fare saç. Cerrahi alan tıraş. </li><li> Bir neşter ile, makas kas dokusu kesim daha sonra, ilk olarak, cilt dokusuna bir insizyon 1.5 cm uzunluğunda tercih. Kesi her iki taraf için hafif bir basınç uygulayın, Karın boşluğu dışında böbrek zorlar hangi. </li><li> Nemli böbreği korumak için pamuk tomurcuğu ile tuzlu su uygulayın. Eğer organa açığa zorluklar varsa, böbrek bağlı olduğu çevredeki adiposit doku çekerek düz forseps kullanabilir. Organın altına yerleştirilen bir pamuklu çubukla ile retroperitoneal boşluğundan dışarı böbrek koruyun. </li><li> İki ince forseps ile, (kanamayı önlemek için parankimi dokunmaktan kaçının) kapsül içinde 2-3 mm&#39;lik bir delik yapmak. Bütün cerrahi işlem sırasında sürekli olarak nemli maruz böbrek kapsülü tutun. </li><li> Açılan kapsülün duvarı koruyarak, böbrek kapsülü altında dikkatlice lobları yerleştirin ve kenar kutup doğru kapsülün altında greft kaydırın. Böbrek başına 6 lobları kadar yerleştirin. </li><li> Retro periton boşluğuna böbrek değiştirin. Kas aponörozlar, bireysel cerrah knot daha sonra deriyi dikin. % 10 iyodür povidon solüsyonu ile yarayı ıslatın. Isıtmalı pa üzerinde fare yerleştirin37 ° C &#39;de, d. </li><li> Kalp, solunum ve bıyık hareketler, kendi tarafından görülen toplam kurtarma hareketleri içeriyordu kadar mukozal renklerin kontrolü ile anesteziden tam iyileşme kadar nakledilen fare Anketi. NOT: Biz sadece cerrahi sonrası analjezik solüsyonu (Buprenorphin, 0.1 mg / kg) içi kas enjeksiyonu tavsiye ve 2 gün ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için ameliyat takip. </li><li> Tamamen iyileşene kadar tecrit işletilen hayvan tutun. Doğrulamak ve enfeksiyonu önlemek için her geçen gün yara dikiş kontrol edin. Bu prosedür takip yara enfeksiyonu gözlendi asla. NOT: CD3, periferal kan hücrelerinin haftalık analizi - / - aşılanmış farenin bize toplumlarında CD45 allotipik işaretleyici ve T hücre soyu spesifik antikorlar (Şekil 3) kullanılarak E13 ya da E18 progenitörlerinin ya kaynaklanan timus algılamasını sağlar. </li></ol> Akış Sitometrisi ile TSP döl 9. Analizi <ol><li&gt; tek hücre süspansiyonları (protokol Bölüm 4&#39;e bakınız) elde etmek için tek tek FTOCs Tease. </li><li> Bir antikor karışımı CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan CD4 APCCy7 CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 tanıyan antikorları içeren ve bölüm 5&#39;de tarif edildiği gibi inkübe bireysel loblar Leke hücre süspansiyonları. </li><li> HBSS +% 1 FCS + propidyum iyodür hücreleri yeniden askıya alma ve (Şekil 2&#39;de B deki sonuçlara bakınız), bir akış sitometresiyle analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+organogenesis.">Thymus organogenesis.</a> Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus.">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li><li>Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus:+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation.">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li><li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic,+context-dependent,+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments.">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li><li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Flt3++lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment.">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26, 678-689 (2007).</li><li>Ramond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+waves+of+distinct+hematopoietic+progenitor+cells+colonize+the+fetal+thymus.">Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus.</a> Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).</li><li>Allison, J. P., Havran, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors.">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+thymus+organ+culture.">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li><li>Barbee, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skint-1+is+a+highly+specific,+unique+selecting+component+for+epidermal+T+cells.">Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).</li><li>Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T/NK+progenitor+in+murine+fetal+liver.">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li><li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene.">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

İki temel deneyler T hücre farklılaşmasını ex vivo olarak analiz etmek için kullanılabilir. En son bildirilen 1 veya 4 12 gibi Noth1 ligandlar, delta ifade BM stromal hücreler, OP9 ile hematopoetik atalarıdır ko-kültür. Bu 2 D tahlili de analiz sağlayan, son derece verimli ve hassas gerçekleştirmek kolay Tek hücreli seviyesi. Ancak, ne timik epitel ile doğrudan etkileşimleri gerektiren her ikisi de DP aşamasında ne γδ DETC 13 nesil ötesinde T hücre gelişimini dest...

T lenfositleri, αβ ya γδ T hücresi reseptörü (TcR) taşıyan, özel bir organ timus ayırt eder. tam gelişmiş timus iki ayrı bölgeye düzenlenmiştir: verimli TcR β ve α zincir genleri yeniden timositleri programlanmış ölüm (pozitif seleksiyon olarak bilinen bir süreç) kurtarıldı olan timik ataları geliştirmek korteks ve; ve öz-ligantlarına çok güçlü reaktivitesi olan timositleri seçilen medulla, (negatif seleksiyon) 1,2 silinir. timus sonra mezenkimal hücreler 3 ile çevrilidir üçüncü faringeal kese endodermal tabakasının kaynaklanır. Bu tarihten sonra, sürekli işe normal T hücre gelişimi 4 için gerekli olan embriyonik gün E12 ve başlayan hematopoetik atalarıdır tarafından kolonize edildi. Timik göçmenler sıkıca düzenlenmiş bir program başlatılan ve mai tarafından orkestra, ardışık gelişim aşamalardan gelişmeye4 gibi bir ligandı ile etkileşimi üzerine timositler ile Çentik sinyal yolunun aktivasyonu, delta ile ntained, timik epitelial hücreler (Tecs) üzerinde eksprese 5. Timosit geliştirme sözde CD4 başlar - CD8 - çift negatif (DN) aşamaları. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) ve DN4 (CD25 - CD44 -) - DN timositleri, daha DN1 (CD44 + CD25) içerisine CD25 ve CD44 ekspresyonu göre bölünebilir. CD24 (HSA) ve CD117 (c-Kit) daha DN1a b erken timik atalarıdır (ETP) karşılık 5 alt içine DN1 bölmesi subdivides. Timositleri DN aşamada TcR δ, β ve α zincirleri yeniden düzenlemek ve pre-TcR seçimi (DN3-DN4 aşamaları) tabi. TcR α zincir pozitif ve negatif sele öncesinde yeniden düzenler CD4 + CD8 + çift pozitif (DP) bölmeye Onlar daha geçişction. Bu aşamada en timositleri ortadan kalkar ve sadece küçük bir yüzdesi (% 3-5) CD4 + ulaşmak veya CD8 + T hücre bölmesini olgun. lenfoid farklılaşma yolu multipotent atalarıdır (MPP) ve eritrosit ve megakaryosit 6 potansiyel kayıp lenfoid hazırlanmış multipotent atalarıdır (LMPP) oluşturmak HKH&#39;lerin aşamalarında ilerler. , C-Kit (CD117) ekspresyonunu, Sca-1 ve Flt3 / flk2 (CD135) ve interlökin saptanamaz düzeylerde yokluğunda (- LMPP fenotipik (soy negatif Lin) farklılaşmış kan hücresi belirleyicilerinin olmaması ile tanımlanır IL) -7 zincir α reseptörü (IL-7rα veya CD127). LMPPs ayrıca bu aşamada tarafından miyeloid hücreleri üretmek için kapasite kaybetmiş ortak lenfoid atalarıdır (CLP) 7 ayırt. CLP lenfosit (B ve T hücresi), NK hücre, DC ve doğal lenfoid hücre (LAK) potansiyelini korumak ve CD1 ifadesi ile LMPP farklılık27 ve Sca-1, yüksek düzeyde olmaması. Timik yerleşme atalarıdır (TSP) doğası yoğun 8&#39;e tartışılan olmasına rağmen, son zamanlarda belli oldu bu gelişme 9 boyunca TSP değişim fenotip, farklılaşma potansiyeli ve fonksiyon. Biz E13 (ilk dalga) ya da E18 (ikinci dalga) arasından sıralama FACS hücre tarafından izole TSP karakterize in vitro ve in vivo deneyler gerçekleştirildi. Eşit E13 ve E18 progenitörlerinin numaraları, farklı alotipik belirteçleri taşıyan tarafından kolonize benzer gelişimsel ortamda döl aşağıdaki izin ve atalarıdır her iki tip arasındaki farklı hücre içsel özellikleri, ortaya ışınlanmış timik loblar fetal timus organ kültürleri (FTOC). E13 veya E18 TSP biri tarafından kolonize timik lob nedeniyle her iki atalarıdır arasındaki rekabete seçim olmadan gelişmesini sağladı. Kolonize timik lobların in vivo nakli daha göstermiştir ki, aynı zamanda tO E13 olgun döl ve E18 TSP in vivo olarak farklı biyolojik özelliklere sahip. Ilk dalganın gelen TSPs hızlı bir şekilde T hücreleri oluşturmak ancak αβ ve γδ T hücrelerinin sayısının az neden olmaktadır. İkincisi arasında biz bir değişmez TcR&#39;ler, onlar yara iyileşmesinde bir işlev uygulamayın ve sadece embriyonik gelişim sırasında 10 üretilen epidermis göç var Vγ5Vδ1 dendritik epitel T hücrelerini (DETC), algıladı. Buna karşılık, TSP ikinci dalga gelen TcR + T hücrelerinin yüksek sayıda üretmek için uzun zaman alabilir ve DETC üretmek mümkün değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.</td>
			<td>TPP</td>
			<td>T93100/T9340</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td>Cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.36</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodide Povidone 10% (Betadine)&#160;</td>
			<td>MEDA Pharma</td>
			<td>314997.8</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 100mg/ml (stock solution)</td>
			<td>MERIAL</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td>Anesthesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution</td>
			<td>AXIENCE</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Morphinic analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>14040-174</td>
			<td>to isolate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS Hanks&#39; Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>24020-091</td>
			<td>to wash out the blood and dissect the embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>51985-026</td>
			<td>Medium for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Calf serum</td>
			<td>EUROBIO</td>
			<td>CVFSVF00-0U</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>Antibiotics for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 b mercapto ethanol</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>31350010</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6 10445111</td>
			<td>Occular W-Pl10x/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold lamp source</td>
			<td>SCHOTT VWR</td>
			<td>KL1500 compact</td>
			<td>Two goose neck fibers adapted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Dissecting Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoon, round and perforated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pairs of fine straight watchmakers&#8217; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-20</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamid thread with needle 6-0&#160;&#160; C-3 3/8c</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>F2403</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-holder</td>
			<td>MORIA/F.S.T.</td>
			<td>12060-02</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100229-100</td>
			<td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Isopore RTTPO2500</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>44210</td>
			<td>For FTOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki 60 wells plates</td>
			<td>FISHER</td>
			<td>1x270 10318801</td>
			<td>For hanging drop technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm</td>
			<td>Hydrex</td>
			<td>11522</td>
			<td>To apply disinfecting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td>
			<td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&#160;</td>
			<td>Clone Number see table below</td>
			<td>Staining cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401/130-048-101</td>
			<td>Cell depletion&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&#160; (CD45.2)</td>
			<td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td>
			<td>Source of cells and thymic lobes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>CDTA Orl&#233;ans, France</td>
			<td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td>
			<td>&#160;Grafting experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

Timik çökelme progenitörlerin karakterize lenfopeni hastada T hücresi değiştirilmesi için stratejiler geliştirmek için gerekli T hücresi gelişiminin önceden timik aşamaları anlamak önemlidir. Biz in vitro tamamlayıcı iki ile fare embriyonik gün 13 ve 18 Thymi gelen atalarıdır yerleşme timus okudu ve in vivo tekniklerin, hem &quot;asılı damla&quot; yöntemine dayalı. Bu yöntem, E13 ve / veya E18 onların soyu takip böylece CD45 alotipik belirteçler ve ayırt timik ataları ile ışınlanmış fetal timus lobları kolonize izin verdi. Nüfusu ile ya kolonizasyon olası rekabet seçici baskıları kaldırır ise karışık nüfusa sahip kolonizasyon atalarıdır biyolojik özelliklerinde hücre özerk farklılıkları analiz sağlar. kolonize timik lobları aynı zamanda t nüfus dinamikleri olarak in vivo olgun T hücre soyu analizi sağlayan bağışık yetmezliği erkek alıcı fareler, aşılı olabilirO bağışıklık sistemini ve farklı doku ve organlarda kolonizasyonu periferik. Fetal timik organ kültürleri E13 ataları içine tüm hızla gelişmiştir CD3 + hücreleri olgun ortaya ve dendritik epitel T hücreleri olarak bilinen kurallı γδ T hücre alt kümesi, doğurdu. Buna karşılık, E18 ataları gecikmiş farklılaşma ve dendritik epitel T hücrelerini oluşturmak için koyamadık. / - - timus aşılı CD3 periferik kan izleme farelerin daha E18 timik çökelme ataları, zamanla, kısa vadeli fetal timus takdir edilemedi bir özellik onların E13 muadillerine göre daha olgun T hücrelerinin büyük sayılar üretmek olduğunu gösterdi organ kültürleri.

Kolonize atalarıdır iyi gelişmesini sağlayan endojen timositlerin timus lobları tüketmek için bir yöntem seçmek için, biz ışınlama sonrası kolonize timik loblarda T hücre sulandırma seviyelerini veya 5 günlük deoksi-guanozin (d-Gua) tedavisi karşılaştırıldı. Sonuçlar kültür 9. günde fark varken, ışınlanmış loblar Böylece 12. gün ile ışınlama sonra T hücresi gelişimini elde etmek üzere D-Gua tedaviden daha uygun olduğunu, d-Gua ile tedavi edilenlerden daha fazla T hücrelerini i?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays at JoVE.com

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K Görüntüleme.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

Video: Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Gelişim Biyolojisi

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.