This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.

1. Advance hazırlayın <ol><li> 37 ° C sıcak bir steril fosfat tamponlu tuz (PBS). </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Eagle Medium (DMEM) ve Minimal Essential Medium (MEM) Sıcak Dulbecco modifikasyonu, 100 lU / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, 37 ° C arasındadır. Not: Bunlar sırasıyla RAW ve HeLa hücreleri için normal Büyüme Medya (NGM) temsil eder. </li></ol> Hücreler 2. Hazırlık <ol><li> NGM içinde% 70-90 confluency RAW 264.7 hücreleri büyümek. <ol><li> Nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de hücreler muhafaza edin. </li></ol></li><li> NGM içinde% 70-90 confluency HeLa hücreleri büyür. <ol><li> Nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de hücreler muhafaza edin. </li></ol></li><li> Toplanmadan önce steril PBS ile bir kez, hücre tekli tabakası yıkayın. </li><li> Steril konik bir tüp içinde önceden konfluent hücreler toplanır. <ol><li> Yavaşça RAW hücreleri kazıyınPBS içinde, bir lastik policeman ile tekrar pipetleme hücre toplamalardan dağıtmak için. </li><li> Görsel muayene kültür yüzeyinden ayrışma gösterene kadar% 0.25 tripsin solüsyonu ile HeLa hücreleri ayırmak. Örneğin, T-75 balonuna için 2-3 ml kullanılır. Tripsin çözüm tüm büyüme yüzeyini kaplayan sağlamak için buna göre ses seviyesini ayarlayın. <ol><li> NGM,% 10 FBS içeren ayrılma reaksiyonu söndürün. </li><li> Hücre toplamalardan dağıtmak için tekrar pipetleme ile, tripsin için NGM en az iki hacim kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> Hafif 4 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Steril PBS kullanarak tripsin / söndürme çözüm olarak aynı hacimde süspanse. </li><li> Hemasitometre veya parçacık sayacı kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Hafif 4 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> 5,5 x 10 6 6 10 x 6.0 hücre / ml PBS yeterli hacimde süspanse. Not: Örneğin, bir T-75 şişe approxim verecektirulaştırılması 7.5 x 10 6 hücre 29. </li><li> Elektroporasyon kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li></ol> Elektroporasyon 3. Hazırlık <ol><li> Buz Öncesi soğuk elektroporasyon küvetler (0.4 cm boşluk). </li><li> Elektroporasyon aparatı açın ve 0,3 kV gerilim ayarlayın. NOT: Kapasite ve direnç (üretici tarafından 10 iF ve 600 Ω ayarlı) bizim elektroporatörü ayarlanabilir ayarları değildi. </li><li> NGM ile geri kazanım plakaları, doldurun ve 37 ° C de, nemlendirilmiş bir% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde dengeye </li></ol> 4. Elektroporasyon <ol><li> Önceden soğutulmuş küvet içinde hücre süspansiyonu 400 ul koyun ve küvetin (ug / ml 50 ug) seçilen proteinin 20 ug ekleyin. </li><li> Flick küvet hafifçe ~ 10 kez hücrelere zarar vermeden karıştırın. Not: küvet de iyice karıştırın birkaç kez ters olabilir, ancak yukarı pipetlemeyin yok ve aşağı ya da vorteks hücreleri zarar vermemek için. </li><li&gt; Kağıt havlu veya diğer silecek ile küvetin kuru dış Elektroporatör elektrik arkı önlemek için. </li><li> 1.5-1.7 msn 0.3 kV electroporate örnek. Not: Bu, bu çalışma için tipik oldu. </li><li> Hemen elektroporasyon fiske küveti sonra yavaşça ~ 10 kat iyice karıştırın. </li></ol> Hücreler 5. Kaplama <ol><li> Hazır olana kadar buz üzerinde Electroporated hücreleri ile mağaza küvet kurtarma plakalarda yer. </li><li> En mansap analizler için, yabancı efektör protein kaldırmak için önceden ısıtılmış NGM ile hücreler 1x yıkayın. <ol><li> Analiz için hücreleri kaldırmak ve NGM 3-5 ml askıya. </li><li> 4 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Istenen plaka boyutuna (örneğin 35 mm tabak için 2 mi) için NGM yeterli hacmi içinde süspanse. </li></ol></li><li> Mansap analizi için hücrelerin uygun miktarda çıkarın. <ol><li> Örnek 1: mikroskopi analizi için cam alt yemekleri içine plaka. </li><li> Örnek 2: levha intBöyle afinite saflaştırma gibi protein analizi için o hücre kültürü plastik. </li></ol></li><li> Hücrelerin en az 4 saat 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferde dengelenmiş plakalarda kurtarmak için izin verin. </li></ol> 6. Mikroskopi Analizi 6.1) Sabitleme / İmmünofloresan Boyama <ol><li> Yıkama hücreleri 4 saat iyileşme döneminden sonra steril PBS ile 1x. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 100 metanol hücreleri saptamak. Tamamen hücreleri (örneğin 2 ml 35 mm çanak için) karşılamak için yeterli metanol kullanın. </li><li> Steril PBS ile yıkayın 3x. </li><li> 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.4 Triton X-100 ile hücrelerin geçirgenliği. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha 1 ml kullanılır. <ol><li> Epitop ile hedef proteinin konumuna göre, Triton X-100 geçirgenliği ve gücü uzunluğunu ayarlayın. Not: En iyi sonuçları ancak yukarıdaki koşullar çoğu c yeterli olmalıdır, ampirik her hedef için belirlenen gerekecektirytosolic hedefler. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 5 sığır serum Albumin (BSA) ile bloke edin. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha 1 ml kullanılır. </li><li> PBS ile yıkayın 3x. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca antikor bağlayıcı çözelti içinde birincil antikor (PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 1 BSA) inkübe &#160; Hafifçe çalkalanarak ° C. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha için 0,5 ml kullanılır. <ol><li> Antikor seyreltme için üreticinin tavsiyelerini uygulayın. Not: 200 seyreltme: PKN1 antikoru 1 kullanıldı olurken, 1000 seyreltme Örneğin, streptavidin bağlayıcı peptit etiketi (SBP-etiket) antikoru 1 kullanılmıştır. </li></ol></li><li> PBS ile yıkayın 4x. </li><li> Işıksız bir ortamda oda sıcaklığında 1 saat süre ile antikor bağlama çözeltisi içinde uygun floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. <ol><li> Örneğin, oda sıcaklığında 1 saat süre ile Alexa 488 veya Alexa 647 kullanır. <ol><li> Karıncanın üreticinin önerilerini izleyinibody seyreltme. (Örneğin, yaklaşık 1: 1000, bu çalışma için). </li></ol></li><li> Örneğin, gerekli olan diğer lekeler ekleme, 5 uM Buğday agglutinnin (WGA) ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üreticinin tavsiyesine göre Alexa 647 veya DAPI birleştirilir. </li></ol></li><li> Görüntü hazır olana kadar ışıktan korundu PBS ile 4 ° C &#39;de deposu ile yıkayın 5x. </li></ol> 6.2) Konfokal Mikroskopi ve Görüntü Analizi <ol><li> 63x immersiyon yağı hedefi kullanarak bir ters konfokal mikroskop görüntü örnekleri. <ol><li> 492-542 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile argon lazer 488nm hattını kullanarak görüntü yeşil kanal. </li><li> 640-718 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile 633 nm diyot lazer kullanarak görüntü kırmızı kanalı. </li><li> 407-453 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile 405 nm diyot lazer kullanarak görüntü mavi kanal. </li><li> Z-yığınları hücresel hacmi bütününü kapsayan çoklu kanal emin olun. </li></ol></li><li> Uygun görüntü işleme yazılımı ile Süreç görüntüleri. </li></ol> 7. Affinity Arıtma <ol><li> 4 saat iyileşme süresinden sonra 4 ° C&#39;de iki kez PBS ile elektroporasyona hücreleri yıkayın. </li><li> Ile lizleyin ~ liziz tamponu buz üzerinde (PBS içinde proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü ile% 1 Triton X-100) ve 1.0 mi. Üretici talimatlarına göre inhibitörleri kullanın. Not: Örneğin, her ikisi de bu çalışmada kullanılan fosfataz ve proteaz inhibitörleri 100x de temin edilmiştir, ancak diğer formülasyonlar eşit derecede iyi çalışmasıdır. </li><li> Derhal lastik polis hücreleri kazıyın ve konik tüpler içine toplamak. </li><li> Güçlü döndürülerek ve sonikasyon ile lizleyin. Not: Diğer lizis yöntemleri eşit olarak iyi çalışabilir, ancak verimlilik ampirik tahlil gereksinimleri uygunluğu tespit edilecek gerekecektir. <ol><li> Aralıklı vorteks 3 x 30 sn sonikasyon. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin toplamakHücresel enkaz ve çözünmeyen agrega; süpernatant kaydedin. </li><li> Sonu aşırı uç rotasyon ile bir gece boyunca 4 ° C &#39;de Streptavidin agaroz reçinesi süspansiyonuna 50 ul ile elektropore edildi hücre lizatının eşit hacimleri (~ 1.0 mi) birleştirin. Not: Bu reçine olan streptavidin bağlama peptidi afinite etiketi ile elektropore protein (ve ilişkili kompleksler) yakalar. </li><li> 2 dakika için 2.500 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> 40 yatak hacmi (~ 1 mi) iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> 30 ul 4x LDS yükleme tamponu (141 mM Tris baz,% 2 LDS,% 10 gliserol, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Mavi G kırmızı 0.175 mM fenol, pH 8.5), 20 ul diH 2 O ve 1 ul ekle bir hacim sağlayan, 0.5 M tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP); boncuk içinde kalması beklenir. </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C de ısı ve buz üzerinde soğutulur. </li><li> Sıkma 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de&gt; 10,000 xg. </li><li> Süpernatant toplayın. </li><li> Uygun antikorlar Not kullanarak batı leke gerçekleştirin: OYeniden anti-PKN1 birincil antikor kullanılır. </li></ol>

<ol>
	<li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+injection+kit:+type+III+secretion+systems.">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li><li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+secretion+machines:+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells.">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li><li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants.">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li><li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems.">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li><li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria.">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li><li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection.">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li><li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disabling+surveillance:+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity.">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li><li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+GEFs:+a+common+theme+for+bacterial+pathogens.">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li><li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors.">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li><li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+ex+vivo/in+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+(AAV1-9)+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype.">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74 (2013).</li><li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+effector+protein,+VopQ,+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux.">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus.">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li><li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells).">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li><li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly(ADP-ribose)+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori.">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li><li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells.">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li><li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells.">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li><li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease:+electroporation+experiments.">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li><li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+antibodies,+DNA,+and+other+macromolecules+into+cells:+a+highly+efficient+method.">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li><li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery.">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li><li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements.">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li><li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation.">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li><li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake.">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li><li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells.">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li><li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+Basic+principles,+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology.">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li><li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+electroporation:+A+review.">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms.">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li><li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+techniques.">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li><li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GtgE,+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li><li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants.">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li><li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella.">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li><li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+PKN1.">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images.">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li><li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Patojen bakterilerin salgılanan efektörleri konak hücre ortamında çalışabilmesi için geliştiğini ve böylece konak içinde in situ bunları incelemek yararlı olacaktır. Konakçı hücrelere özel ilgi efektörlerinin giriş ilgili patojen-konakçı etkileşimleri bakteriyel proteinlerden müdahalesi olmaksızın tek başına ele sağlar. amaç, böylece transfeksiyon ya da transdüksiyon ile bağlantılı bazı zorluklar kaçınarak ökaryotik konakçı hücrelere bakteriyel efektör proteinler kat?...

Bir çok Gram-negatif bakteriler, doğrudan konakçı hücreler 1-5 içerisine (efektör olarak anılacaktır) hastalık oluşturma ilişkili proteinler enjekte özel salgılama sistemleri kullanılmaktadır. Ev sahibi dokunulmazlık baskılanması, hücre iskeleti değişiklikler, hücre içi ticareti ve sinyalizasyon, transkripsiyon değişikliklerin modifikasyonu ve ev sahibi proteasome değişiklikler 6-9: Bu efektörleri dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları geniş bir yelpazesi var. Bazı efektörlerinin işlevleri ancak ev sahibi hedefleri ve diğerleri biyokimyasal eylem (ler) belirlenecek kalır bilinmektedir. Vahşi tip ve yeniden birleştirici bakteriyel enfeksiyonların karşılaştırılması hücre içi efektör hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için geçerli bir yaklaşım olsa da, konakçı hücre içerisine bağımsız bir efektör tanıtmak için sıklıkla yararlıdır. Böylece, konakçı hücreler bağlamında bakteriyel efektör proteinler katma ve karakterize edilmesi için basit bir yöntem arzu edilmektedir. Deneysel analiz wi BasitleştirmeTek bir efektör kritik inci diğer efektörler karşı ya da gereksiz işlevlere sahip olabilir. Bu basitleştirme gerçekleştirmek için, araştırmacılar, daha önce kazıma 12,13 yükleme viral transdüksiyon 10, mikroenjeksiyon 11 de dahil olmak üzere birçok farklı yöntemler ile hücrelere makromolekülleri getirmiştir, kimyasal olarak teşvik mikroenjeksiyon 14, özel bir protein &quot;transfeksiyon&quot;, reaktif 15, kalsiyum fosfat çöktürme ile hücre füzyonu 16 ve elektroporasyon 17-20. kişiye moleküller, hücre içi hedefleri 21,22 protein, hücre-geçirgen olmayan boyalar ve antikorlar, DNA, RNA ve RNAi türler dahil olmak üzere nükleik asitler arasında değişir. Bazı yöntemler dahil edilebilir makromolekül Çeşidi dahil kısıtlamaları vardır ve özellikle alt-analizler, yüksek hücresel toksisite, etki zarar mekanizmaları, düşük etkililik ve giriş verimliliği ile sınırlı olabilir. Transfeksiyon, bir ofteaynı zamanda makrofajlar ve birincil hücre gibi uygun bir ev sahibi hücre tipi, transfeksiyon karşı özellikle dirençlidir sınırlama uğrar, memeli hücrelerinde bakteri genleri ifade etmek için bir yöntem, n-kullanılmıştır. Bunun ötesinde, yabancı DNA&#39;nın sokulması üzerine üretilen bakteriyel protein seviyelerini kontrol etmek zordur. Çok iş bilinen bir laboratuvar tekniği olarak bakteriyel ve memeli yaratıkların hücrelerine nükleik asit elektroporasyon kurdu; Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, hücre içine proteinlerin verilmesi için en iyi yöntem devam etmekte olan bir araştırma vardır. Protein transfeksiyon üzerindeki raporlar umut vericidir, ama pahalı reaktifler ve optimizasyon gerektirir. minimum maliyet ile hücre hedefleri çeşitli içine potansiyel toksik bakteri efektörler tanıtmak arzusu in vivo bu proteinleri eğitim için bir yöntem olarak elektroporasyon dikkate götürdü. Protein elektroporasyon 23-25 ​​bir araya geldi iseAyrıca elektro-transfeksiyon veya elektro-enjeksiyon 26 olarak bilinen electropermeabilization üzerinden canlı hücreler içine proteinleri tanıtmak hod. Bu teknik, hücre zarlarında gözenekleri oluşturmak için yüksek yoğunluklu elektrik darbeleri kullanır. Bu geri dönüşümlü gözenekler normal hücre içi alandan dışlanan makromoleküllerin hücreye girmesine izin. Dış elektrik alanının çıkarılması üzerine, zar, hücre gözenekler 27,28 geçirilir molekülleri korumak için izin kapatın olabilir. Standart bir Electroporator sürekli fare makrofaj-benzeri hücreleri ve insan epitel hücreleri hem de içine bakteri efektör tanıtmak için bu çalışmada kullanılmıştır. yöntem hücresel canlılığı hiçbir kayda değer azalma ile, hızlı, verimli ve ucuz. kişiye proteinler immünofloresan mikroskopi ile görüntülenmiştir veya fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu aynı zamanda, bir toksik-olmayan, standart olarak yeşil floresan proteini (GFP) ile gösterilmiştirİki Salmonella efektör proteinler, SspH1 ve GtgE. Bu ökaryotik konakçı hücrelerde bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri ve işlevlerin çalışması için repertuarında ek bir araç olarak, protein elektroporasyon önerilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">Material or Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-050-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Methanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Culture Plastic</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>E. coli Pulser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent confocal microscope&#160;</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Model&#160; LSM 710&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Dishes for Microscopy</td>
			<td>Wilco Wells</td>
			<td>HBSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HALT Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">78430</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HeLa Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDS 4X Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (MEM)&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Against Target of Interest</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Chill to 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Agarose Resin Suspension&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">646547</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8585</td>
			<td>Irritant, Toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of functional bacterial effectors into mammalian cells

canlı hücrelerin bağlamında protein etkileşimleri çalışma lokalizasyonu, dinamikleri ve etkileşim ortakları hakkında kritik bilgiler üretebilir. Bu bilgiler, evsahibi-patojen etkileşimlerinin bağlamında özellikle değerlidir. Birçok patojen proteinleri, hücre içi bir ortam içinde konak bağışıklık sistemi ve hayatta kalma kaçırma sağlayan, bu gibi bir şekilde çeşitli konak hücreleri içinde çalışır. Bu patojenin protein konukçu hücre etkileşimini incelemek için çeşitli yaklaşımlar sık dahil olmak üzere kullanılır: in vivo enfeksiyon transfeksiyon ya da transdüksiyon ile etiketli veya mutant protein ya da patojen genlerin katılması eksprese eden bir suşu ile. Bu yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bu direkt olarak hücrelere ekzojen proteinleri katılması için bir araç çalıştı. Elektroporasyon yaygın hücrelere nükleik asitlerin dahil edilmesi için kullanılabilir, ancak biyo-fiziksel temeli tam olarak aynı olmasına rağmen daha nadir proteinlere uygulanmıştır.Standart bir Electroporator memeli hücrelerine afinite etiketli bakteriyel efektör tatbik etmek için kullanılmıştır. İnsan epiteliyal ve fare makrofaj hücreleri, geleneksel metodlarla kültürlenmek sureti ile ayrılır ve ilgi dahilindeki bir eksojen bakteriyel patojenin proteini (örneğin, Salmonella Typhimurium GtgE) ile 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvetler içine yerleştirilmiştir. Elektroporasyon (0.3 kV) ve kısa (4 saat) geri kazanım süresinden sonra, hücre içi protein, flüoresan olarak afinite etiketi ile protein etiketleme ve konfokal mikroskopi ile mekansal ve zamansal dağılımının incelenmesi ile doğrulanmıştır. Elektroporasyona protein aynı zamanda hücre içinde işlevsel ve doğru hücre içi ticareti ve protein-protein etkileşimi yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Ekzojen proteinler hücrelerin yüzeyi üzerinde birikme eğiliminde iken, elektroporasyona örnekler sadece kuluçkalama için hücre içi efektör konsantrasyonda büyük artışlar vardı. protokol ap yapılacak basit ve yeterince hızlıhücre içi hedefleme ve hastalık oluşturma proteinlerin işlevine de dahil olmak üzere, konakçı hücrelerde patojen proteinlerinin yüksek verimli bir karakterizasyon için izin arallel moda.

Kavramının bir ilk kanıtı olarak, saflaştırılmış yeşil flüoresan proteini başarıyla elektroporasyon ile memeli hücrelerine dahil edilmiştir. GFP, yaklaşık 27 kD molekül ağırlığına sahip protein özel genellikle önemli hücresel toksisite olmaksızın moleküler biyoloji aracı olarak (normal olarak plasmid DNA ifade edilen), memeli hücreleri içine dahil edilir. HeLa hücreleri (Şekil 1A) kuluçkalanmıştır veya floresan GFP sinyali kontrol etmek için imüno-konfokal mikrosk...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells at JoVE.com

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Görüntüleme.  Pacific Northwest National Laboratory. Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells. 