Bu çalışma, Wellcome Trust (WT 0.795.880) tarafından finanse edildi.

Aşağıdaki protokol S. endotel hücre işgali çalışma açıklayacağız aureus ama teorik olarak herhangi bir kültürlenebilen bakteri tarafından hücresel işgali incelemek için de kullanılabilir. S. için özel Aşamaları aureus ve endotel hücreleri gösterilir. 1. Bakterilerin hazırlanması <ol><li> Kültür S. 4-16 saat 37 10 ml Beyin-Kalp İnfüzyon (BHI) suyu (gerekir büyüme aşamasında bağlı olarak) ° C 200 rpm&#39;de sallayarak ile hava aureus suşlarının. Bu büyüme koşulları S. için özel aureus ve diğer bakteriler için adapte edilmesi gerekebilir. </li><li> Oda sıcaklığında (5.000 x g, 10 dakika), DMEM, bir eşdeğer hacmi bakteriyel pelet kültür süpernatant ve tabanda kaybolmasına santrifüj, alternatif tur; bakteri Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Kullanıcı orta üç kez (Invitrogen DMEM) yıkayın. Bakterilerin gerektiği gibi ayarlanabilir süspansiyon optik yoğunluk ölçülür. S için aureus, ~ 10 9 kob ml -1 karşılık gelen OD 600 = 1, bir süspansiyon hazırlamak. </li></ol> 2. Endotel hücre kültürü <ol><li> 37 ° ve L-glutamin (2 mM) ° C,% 5 CO 2; Kültür DMEM endotel hücre hattı EA.hy926 1 fetal sığır serumu (% 10 FBS) ile desteklenmiştir. Alternatif olarak, havuzlu birincil insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVECs) Lonza (Basel, İsviçre) satın alınmış ve 37% 2 FBS, sığır beyin ekstraktı (heparin dahil), insan endotelyal büyüme faktörü ve hidrokortizon ile desteklenmiş endotel bazal orta kültürlü olabilir ° C,% 5 CO 2, üreticinin talimatlarına (Lonza) göre . Bu büyüme koşulları, bu hücreler için spesifik ve diğer ev sahibi hücre türleri için adapte edilmesi gerekebilir. </li><li> T75 şişeler endotel hücreleri, göz tarafından doğrulanmadı confluency tamamlamak büyütün. </li><li> Lamelleri yerleştirilmesi için 24-iyi bir tabak hazırlayın. Güzel forseps (alev steril) bir opak ve parlak bir yüzeye sahip lamelleri taşımak için ihtiyaç vardır. Lamelleri, hücre tutunmasını sağlar yukarı bakacak şekilde opak yüzeyi ile 24 plaka kuyular yerleştirin. </li><li> 3 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile T75 balon hücreleri özgürleştirmek ve ilgili kültür ortamı 10 ml ekleyin. </li><li> Manox cam lamelleri içeren 24 kuyucuğu yeniden süspanse hücreleri 500 ul ekleyin. Bir T75 konfluent balon hücre yaklaşık 5 × ortalama 10 5 hücreleri (500 inoküle), iki adet 24-kuyucuğu için yeterli hücreleri sağladı . </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 48 saat süreyle inkübe plakaları, ve ters ışık mikroskobu ile confluency% 100 hücre doğrulamak. </li><li> Dip-yıkama PBS içinde lamelleri ve her biri de% 10 FBS içeren 490 ul DMEM içeren yeni 24 kuyucuğu eklemek. </li><li> Hücre işgali belirli metabolik süreçlerin rolünü incelemek için inhibitörleri saat önce tahlil sırasında tutulan bakteri ve konsantrasyonlarının yanı sıra kültür hücreleri 1 eklenebilir. Örneğin, S. aktin düzenlenmesi rolünü belirlemek için endotel hücreleri aureus işgali, 50 mcM cytochalasin D eklenebilir; veya caveolae, 5 rolü için mM metil-β-siklodekstrin eklenebilir. </li></ol> 3. Invasion Testi <ol><li> Her biri% 10 FBS içeren 490 ul DMEM konfluent tabaka endotel hücreleri ile yıkanmış lamel içeren yıkanmış bakterilerin 10 ul (yaklaşık 2 × 10 7 kob ml -1 S. aureus) ekleyin . </li><li> 15-90 dakika boyunca 37 ° ° C&#39;de% 5 CO 2. </li><li> Lamelleri bakteri hücreleri (yapışık ve içselleştirilmiş) ile ilgili toplam sayısı ölçmek için, PBS içinde üç kez dip yıkayın ve PBS içinde 500 ul% 0.5 Triton X-100 içeren taze kuyu eklemek. Hücrelerin tam olarak içselleştirilmiş tüm bakteri lyse ve serbest sağlamak için, doğrudan lamel yüzeyinde pipet ucu işaret ederek, birkaç kez pipetle. </li><li> TSA plakaların yüzeyine sıvı süspansiyon (veya bu gerekli dilüsyonları) kaplama ile bakteri numaralandırılamıyor. TX-100 birçok Gram-negatif bakteriler lyse beri, saponin yerine 2 kullanılabilir. </li><li> Içselleştirilmiş bakteri sayısını ölçmek için, her bir kuyunun içeren bağlanmamış bakteri kültürü süpernatant kaldırmak ve 200 mg ml -1 gentamisin ile desteklenen 500% ul DMEM/10 FBS ile değiştirin. Biz rutin olarak daha ucuz olduğu gibi burada oldukça lysostaphin daha gentamisin kullanımı ve bize deneysel protokol değiştirmek zorunda kalmadan, farklı bakteri türleri (örneğin Stafilokok ve Lactococci) kullanarak deneyler arasında geçiş yapmanıza olanak tanır. </li><li> 37 ° plakaları inkübe ° C ekstrasellüler bütün bakterileri öldürmek için 60 dakika süreyle% 5 CO 2. </li><li> Lamelleri PBS içinde 3 kere yıkayınTSA üzerine kaplama lyse ve numaralandırmak yapışma testi için yukarıda anlatılan. </li><li> Bazı durumlarda, görsel ışık mikroskobu kullanılarak bakterilerin sayısını saymak için tercih edilebilir. Bu durumda, özel S. aureus hücre işgali, fiziksel ekstraselüler bakterileri yok etmek için lysostaphin yerine gentamisin (10 mg ml -1) kullanmak. </li><li> 37 20dk için lamelleri inkübe ° C CO 2 lysostaphin çözüm, sonra durulayın ve Cytopath (Cellpath) ile düzeltmek. </li><li> 5min lamelleri kristal viyole (% 0.5 w / v) ile boyayın. </li><li> Su, hava-kuru Dip-durulayın ve cam slayt üzerine monte. Konfluent endotel hücreleri mm 2 başına bakteri sayısı, ışık mikroskobu kullanılarak belirlenebilir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: S. yüzey fibronektin bağlayıcı proteinlerin Anlatım (FnBPA ve FnBPB) aureus endotel hücreleri istila yeteneği bahşeder. Son çalışmalar, FnBPA 3 fibronektin bağlayıcı bir etki ortaya koymuştur. Wild-tip (WT), S. aureus 8325,4 yüksek verimlilik ile endotel hücreleri işgal FnBPA ve B (Δ FNB) olmayan bir yük önemli ölçüde azaltılmış internalizasyonunda düzeyleri (Şekil 1A) gösterdi iken. Plazmid bir kodlama FNB mutant tamamlama bir eksi fibronektin bağlayıcı etki alanı (pFnR0) (Şekil 1A) işgali teşvik etmedi . Buna karşılık, mutant bir plazmid kodlama tüm FNB WT düzeyleri (Şekil 1A) işgali restore geni (pFnBA4) ile tamamlama. Endotel hücre işgali FnBPA rolü de heterolog ifade host Lactococcus lactis kullanarak ortaya konabilir. L. plazmid kodlanmış FnBPA Açıklanması lactis (pRM9 9) anlamlı hiçbir FnBPA (KVK) (açık barlar, Şekil 1B) ifade bakterilere göre endotel hücrelerine yapışma geliştirmek vermedi. Buna karşılık, L. FnBPA-ifade lactis olmayan ifade suşu (kapalı bar, Şekil 1B) göre anlamlı derecede yüksek düzeyde endotel hücreleri istila etti. Deneyler, iki nüsha halinde dört kez ve ortalama ± standart sapma sunulmaktadır yapıldı. * WT veya CTL değerleri (p &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı derecede farklı verileri temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1, EA Invasion . S. Hy926 endotel hücreleri aureus (A) veya L. lactis (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

<html> Tarif tahlil ana hücreleri bakteriler tarafından işgali incelemek için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır gentamisin koruma testi dayanmaktadır. Gentamisin ve diğer hücre içi bakteri öldürmek için antibiyotik edememe Gözlemler bakteri 4-8 ev sahibi hücrelerin işgali erken çalışmalarında kullanılmıştır. 24, 48 hatta 96-kuyucuğu kullanılması büyük miktarda zaman ve nispeten düşük maliyetle kısa bir süre içinde nicel ve tekrarlanabilir veri üretimi sağlar. Hiç uzman ekipman gerektirir, çeşitli bakteri ve hücreleri ile çalışmak için uygun olabilir, ve işgali 9 hem bakteri ve konak hücre süreçlerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir çünkü tahlil de çekici. Gerçekten de, ilk deneylerde bu yana, gentamisin koruma testinin yaygın konak hücre işgali ölçmek için bir dizi farklı bakteri veya bakteri 10,11 bile kombinasyonları istihdam edilmiştir. Temel ilkeler, yöntem aynı, çok ince varyasyonların olsa bildirilmiştir. Bu yazıda bizim sürümü açıklanan ve değişiklikler diğer bakteri veya konak hücreler için gerekli olabilir göstermiştir. Konak hücre işgali, dikkate alınması gereken önemli noktalar vardır bu yaklaşım kullanarak ölçmek için bir deney tasarımı: Gentamisine Bakteriyel hassasiyet. Bu apaçık ortada, ama çalışılan bakteri konsantrasyonu, sıcaklık ve süre boyunca kullanılmak üzere gentamisin duyarlı olmasını sağlamak için önemlidir. Duyarsızlık söz konusu olduğunda, diğer antibiyotiklere 5 kullanmak mümkün olabilir. Parçalayıcı enzimler (lysostaphin, mutanolysin, lizozim) 12 kullanmak için alternatif bir yaklaşım olabilir. Kuluçka ve inokulum ilk kez bu testte yaparken kullanılacak en uygun inkübasyon sürelerinde ve bakteriyel inokulum kurmak için önemlidir. Bu nedenle, ilk deneylerde, zaman içinde yapışma ve invazyon (6 saat 5 dakika) hem de incelemek gerekir. Bu işgali enfeksiyon çokluğu tarafından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için de önemlidir (İçişleri Bakanlığı; hücre başına bakteri sayısı). Genel olarak bu kültür hücrelerinin hasarı azaltacaktır mümkün olan en az sayıda bakteri kullanmak en iyisidir. Uzun kuluçka dönemleri veya büyük inocula 9,13 kullanılması halinde suşlar arasında önemli farklılıklar kaçırmış olabilir. Hücresel hasar kullanmadan önce bakterileri yıkamak önemlidir. Ancak, hücresel hasar toksin üretimi ile sınırlı değildir. Bakteriyel işgali, apoptoz ve normal hücresel işlevlerin bozulması indüksiyon hücre hasarına neden olabilir. Bu içselleştirilmiş bakterileri öldürerek ve işgali 14 oluştu olduğu izlenimi veren, gentamisin hücre içine nüfuz etmesine yol açabilir. İnkübasyon koşulları, sıcaklık ve kültür ortamı bileşimi işgali üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Örneğin, HeLa hücrelerinde Streptococcus pyogenes tarafından işgali, genellikle serum 15 çözünür fibronektin, varlığı bağlıdır . Diğer bir önemli husus, kültür ortamında deney seyri sırasında bakteriyel büyüme. Kültür ve hücre içi bakteri ölçümü. TX-100 hücre içi bakterileri öldürmek olsa da, onların büyüme inhibe edebilir. Gibi, katı ortam üzerinde deterjan varlığında bakteriyel çoğaltma kontrol etmek için önemlidir. Etkilenen nerede, deterjan düşük konsantrasyonlarda kullanmak veya böyle bir saponin alternatif olarak kullanmak mümkün olabilir. Kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil üzerinden gentamisin koruma testinin bir yararı da, yoğun daha az emek olduğunu ve bu algılama ve içselleştirilmiş bakteriler alt popülasyonlarının farklılaşma sağlar. Örneğin, S. aureus (NCT) ya da normal bir koloni tipi veya bireysel bakteri hücrelerinin mikroskobu ile ayırt edilebilir olmayacaktır küçük koloni varyant (SCV) 16, üretebilir. 17 &#39;yaşayabilir ama olmayan kültürlenebilen&#39; devlet tespit edilecektir girmek hücre içi bakteri ve hücre topaklanma muhasebeleştirilir gentamisin koruma tahlil üzerinde kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil bir yararı olabilir. Bakteri istilası konak hücre süreçlerinin rolü incelenmesi. Birçok çalışma, aktin düzenlenmesi ile müdahale cytochalasin D, konak hücre fonksiyonu inhibitörleri istihdam var. Bu tür çalışmalar da antikorlar içerebilir hedef hücre yüzey reseptörleri ve belirli genlerin 18 siRNA demonte . Bu tedaviler kültür hücreleri canlılığını veya ek etkiler veya bakteriler üzerinde toksik etkilere sahip olduğunu sağlamak için hayati önem taşımaktadır. Gelecekteki yönelimler: Bu testte genellikle çok iyi hücre kültürü plakaları yapılır ontent &quot;&gt; Çünkü bu potansiyel hücre fonksiyonu inhibitörlerinin kütüphanelerin incelenmesi, enfeksiyonlar ya da ilgili olabilir, yüksek verimli bir tarama çalışma için uyarlamak için teorik olarak mümkün. hücre içi bakteri hedef için tasarlanmış antibiyotikler. Alternatif olarak, böyle bir yaklaşımın mutant kütüphaneler ekrana yapışma, işgal ya da hücre içi sağkalım ilgili genleri tanımlamak için kullanılan olabilir, bazı durumlarda model sistem kesme kuvvetleri (akış) de istenebilir Örneğin endotel modelleme zaman daha yakından in vivo ortamda taklit etmek için akış hücreleri ve mikroakışkan hücre kültürü sistemleri tasarımı ve üretimi, güncel gelişmeler, kesme kuvvetleri dahil konak-patojen modelleri gentamisin koruma tahlil istihdam imkanı da sağlar . Özetle, burada açıklanan protokol uzun yıllardır kullanılan benzer yaklaşımlar üzerine kuruludur. Bu yaygın kültür hücreleri ve bakteri türlerinin birçok türleri için geçerli olup, hızlı ve nispeten daha az maliyetle büyük miktarda veri oluşturabilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

İşte biz insan endotel hücreleri istila bakteriyel patojen Staphylococcus aureus çalışmanın nasıl anlatacağız. Genel protokol, hemen hemen her kültürlenebilen bakterinin hücre işgali çalışma yapılabilir. Örneğin aktin düzenlenmesi veya caveolae rolü işgali belirli yönlerini ele olabilir hangi aşamaları, vurgulanır. Konak hücrelerine şişeler yetişen ve kullanıma hazır manox lamelleri içeren 24 kuyucuğu içine numaralı seribaşı. Lamelleri kullanarak, kuyulardan (S. aureus eklemek için) tarafı üzerine yatırılır serum proteinlerinin kuyulardan hücrelerinin sonraki kaldırma girişimi azaltılması sağlanır . Bakteriler gerekli yoğunluğu büyüdü ve herhangi bir salgılanan proteinler (örneğin toksinler) uzaklaştırmak için yıkanır. Endotel hücreleri konfluent katmanları ile lameller bakteri eklenmesi önce taze kültür ortamı içeren yeni 24-kuyucuğu aktarılır. Bakteri ve hücreler daha sonra 37 o zaman gerekli miktarı için% 5 CO 2 birlikte inkübe edilir ° C S için aureus bu genellikle 15-90 dakika arasında. Manox lamelleri her kuyudan çıkarılmış ve unattached bakterileri kaldırmak için PBS daldırma yıkanır. Toplam ilişkili bakteriler (yapışık ve içselleştirilmiş) sayısal edilecekse, lamelleri sonra PBS içinde X-100% 0.5 Triton içeren yeni bir kuyu yerleştirilir. Nazik pipetleme hücre parçalama tamamlamak ve bakteriler agara seri seyreltme ve kaplama tarafından numaralandırılan açar. Hücreleri istila bakteri sayısı gerekli ise, tüm dış bakterileri öldürecektir gentamisin ve inkübasyon ile desteklenen 500 ul doku kültür ortamı içeren kuyu 1 saat boyunca devam etti, lamelleri eklenir. Lameller sonra yıkanabilir, parçalanmış hücreler ve yukarıda açıklandığı gibi bakteriler agara kaplama ile numaralandırılan. Deney doğrudan görselleştirme gerektiriyorsa, lamelleri sabit ve lekeli, ışık, floresan veya konfokal mikroskobu veya elektron mikroskobu için hazırlanmış olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir protokol,<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Ve insan endotel hücreleri.

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.6K Görüntüleme.  University of Bath. Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir protokol, Staphylococcus aureus Ve insan endotel hücreleri.

Video: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.