This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

Görüntüleme 1. 3D Hücre Kültürü ve Hazırlık <ol><li> Kültür, bir uygun hücre hattı, yani, HCT116 kolon karsinomu hücre soyu, iki boyutlu, tek tabakalı kültürü. </li><li> Genellikle birkaç gün sürer, 50-70% konfluansa kadar bir% 5 CO2 inkübatörü içinde +% 10 fetal bovin serumu McCoy&#39;un 5A ortamı bir T-25 balonuna HCT 116 hücreleri büyütün. </li><li> % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile Yayın hücreleri ve bir hemositometre kullanılarak bir hücre kısmı sayısı ve hücre yoğunluğu ve viyabilitede kontrol etmek için mavi boya tripan. </li><li> Sayımının ardından / oyuk 6000 hücre, uygun bir tohum yoğunluğu elde etmek için tam ortam ile hücreleri, seyreltik ya 30,000 hücre / ml olmuştur. </li></ol> 2. Agaroz, 96 gözlü levhalar Kaplı hazırlayın <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde standart ortam, 10 ml (ortam içinde% 1.5 agaroz çözelti) ile 10 agaroz 0.19 g ekleyin. Nazik karıştırma ile birleşmesini sağlamak. Bir su banyosu içinde agaroz otoklav20 dakika karıştırıldı. </li><li> Düz dipli 96 kuyu plaka kültür plakasının 60 merkez kuyulara, agaroz + medya karışımı aspire 50 ul bir çok kanallı pipet kullanarak. Levhanın çevresel kenarları bir kuyu biraz daha yüksek buharlaşma oranları bilgisi olarak, 200 ul 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yerine, bu kenarlarına agaroz ekleyin. </li><li> Agaroz karışım iç oyuklara ilave edildikten sonra, soğumaya kenara plaka ~ 37 Hücrelerin eklenmesinden önce ° C. </li></ol> 3. Tohum ve Üç-boyutlu Kültür meyilliyim Not: Daha fazla veya daha az hücrelerin yer kültür şartlarına bağlı olarak ekilebilir, ancak bu koşulların kültür 10-14 gün sonra çapı yaklaşık 1 mm 3D hücre kültürü yapıların neden olduğu tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir) . <ol><li> Uygun hücre çözeltisinin 200 ul ekle (~ 6.000 hücreler içeren seyreltilmiştir) agaroz kaplı96 çukurlu levha. Plaka örtün ve hücre büyümesi için 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde ayarlanır. </li><li> Hücre Ortam her 48 saat en az değiştirme, ya da medya göründüğünde renk değişiyor gibi. <ol><li> Dikkatle agaroz altındaki (2 gün çıplak gözle görülebilen), küçük 3D hücre kültürü etrafında eski medya aspire medya değiştirin. Yavaşça 3D hücre kültürü üzerinde taze medya 200 ul ekleyin. </li><li> Bu ortam değişiklikleri sırasında (İsteğe bağlı adım), test için kemoterapi ya da diğer ilaçlar ekleyin. Tam ortam ile nihai konsantrasyona kadar tercih edilen bir ilaç seyreltilir ve her bir oyuğa 200 ul gerekli ekleyin. </li><li> 3D hücre kültürleri, çap olarak yaklaşık 1 mm kadar bir optik mikroskop ile 3D hücre kültürü büyüme izleyin. </li></ol></li></ol> 4. Hasat 3D Hücre Kültürleri <ol><li> Yavaşça agaroz yatak 3D hücre kültürü çıkarmak için 2 ml serolojik pipet kullanın. </li> &lt;li&gt; hafifçe bekleyen 24 oyuklu bir plaka içerisinde, yaklaşık 1 ml PBS içine pipetleme PBS ile 3 boyutlu hücre kültürleri yıkayın. </li><li> Transfer protein veya metaboliti çıkarılması için santrifüj tüplerine serolojik pipet aracılığıyla 3D hücre kültürleri hasat, ya da onlara görüntüleme uygulamaları için dilimleme yardımcı bir kesim orta embed. </li></ol> Jelatin 5. Göm 3D Hücre Kültürleri <ol><li> Yüksek saflıkta su içinde ~ 175 mg / ml jelatin içinde bir çözeltisi hazırlandı (18 M tercih edilir). 22,23 kuvvetli bir şekilde jelatin karıştırın. Viskoz ve işlemek için zor hale çözümü gözlemleyin. Çözüm aspirat açık ve kolay hale gelinceye kadar ~ 60 ° C su banyosunda jelatin içeren konik tüp yerleştirin ve ılık. NOT: Sıcak jelatin çözüm soğur hızla sertleşir, bu nedenle hızla dondurmadan önce aşağıdaki adımların tümünü gerçekleştirmek. </li><li> O ısıtılır sonra, hücre kültürü kaputu hemen jelatin almak. Bir bea jelatin ile tüp tutunyaklaşık 60 ° C&#39;de ısıtılmış, su ile ker Jelatin çözeltisi sertleşmesini önlemek için C °. </li><li> 2 ml&#39;lik bir serolojik pipet kullanarak, 24 düz tabanlı plakanın her bir kuyucuğu içine sıcak jelatin solüsyonu, 0.6 ml yatırmak. Bu hacim, ince bir tabaka halinde alt kapak için yeterlidir. Yavaşça derhal 3D yapısının kırılması için değişik bir 2 mi pipet kullanarak jelatin katmanın üzerine 3D hücre kültürleri yatırmak. Not: Bakım jelatin içine PBS yerleştirmek için bu aşamada alınmalıdır. Bu durumda, bununla birlikte, bir 200 ul bir pipet kullanılarak jelatinin en PBS çıkarın. </li><li> 3D hücre kültürleri, jelatin katmanın yüzeyine yerleştirilir sonra kültür konumunu rahatsız etmeyecek şekilde, dikkatli bir şekilde, 3 boyutlu hücre kültürleri üzerinde sıcak jelatin karışımı bir 0.6 mi pipetle. İkinci katman yerleştirildikten sonra, -80 ° C&#39;de jelatin-gömülü 3D hücre kültürleri dondurma. </li></ol> 6. Dilim ve çözülme Dağı incie Kütle Spektrometrik Görüntüleme 3D Hücre Kültürleri Jelatin-gömülü <ol><li> Dondurucu 3D hücre kültürleri içeren 24 plaka çıkarın. Bir cımbız veya bisturi iyi tarafı aşağı hafifçe kaydırın edecek kadar elinizden ısı ile plakanın alt ısıtın. </li><li> Sorunsuz merkezi çözülme olmadan jelatini kurtararak, cımbız veya neşter kaydırın. Kriyostat desteği bir damla su alın ve destek jelatin diski uymak için kullanabilir. <ol><li> Jelatin gömülü 3D hücre kültürleri, -30 ° C de dilimleme en uygundurlar. Kullanmadan önce% 70 etanol ile kriyostat bıçak ve cam temizleyin. Bıçak veya bıçak matlaştırmadan önlemek için her 3D hücre kültürü-jelatin disk için yeni bir bıçağın farklı bir kısmını kullanın. </li></ol></li><li> 3D hücre kültürleri görünür hale gelene kadar sirostat kullanarak, yavaşça aşırı jelatin karşıya. </li><li> Bu noktada yavaş yavaş 12-16 mikron bölümlerde bir yumuşak hareket ile 3D hücre kültürleri dilim. NOT: dilimleme kritik faktörler yüzden tüm bu tutarlı sonuçlar sağlanması için kontrol edilmelidir bıçak cam mesafe, bıçak açısı, kriostat sıcaklığını ve destek diskin açısını içerir. </li><li> Dikkatle dilimleri Çözülme ve uygun şekilde etiketlenmiş indiyum titanyum oksit (ITO) kaplı cam slaytlar onları monte ve bir desikatörde saklayın. Maksimum kalite için mümkün olduğunca çabuk dilim kullanın. </li></ol> MALDI Görüntüleme için 7. Matris Başvuru ve Numune Hazırlama <ol><li> MALDI görüntüleme önce, uygun matris ile dilimleri hazırlamak. <ol><li> Küçük moleküllü analizi için, herhangi bir yıkama basamağı, genel olarak ihtiyaç duyulur. Sağlam protein tespiti için, soğuk% 100 aseton içinde dilimleri yıkama Carnoy sıvı veya% 70 /% 95 izopropanol gibi bir sinyal maske lipidler gibi küçük moleküller çıkarmak için 24 -. 26 </li><li> Yavaşça bir anda en fazla 30 saniye boyunca yıkayın. YapamazHerhangi bir dilim rahatsız. </li></ol></li><li> % 0.1 TFA ile, bir organik çözücü ve sudan oluşan bir çözelti içinde matris hazırlayın. Örneğin α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA) kadar küçük bir molekülü için,% 60 ACN kullanın:% 40 H2O:% 0.1 TFA (10 mg / ml) eklenmiştir. Protein tespiti için bu, daha sonra sinapik asit (30 mg / ml), aynı çözücü solüsyonu kullanın. Sinapik asit optimum çözünürlük için TFA ilave edilmesinden önce asetonitril ilk çözülür: H2O çözeltisi. Diğer matrisler, uygun olarak kullanılabilmektedir. Not: The Matrix çeşitli farklı yöntemlerle uygulanabilir, ancak bazı matrisler kullanılamaz örnek oluşturma, örneğin ferulik asit, jelatin, ile birlikte kristalize olduğu bulunmuştur not edilmelidir. Küçük kristalleri tespit edilir ve biyolojik özelliklerinden ziyade matris etkilerinden kaynaklanmaktadır daha moleküler türler sağlayan, daha tutarlı bir kütle spektrumu üretir. </li><li> Yöntemi handspotting matrisi uygulayın. <ol><li> MATR 0.5 ul uygulamak için ince uçlu şırınga kullanınix 3D hücre kültürü dilim çözüm ve matris kristalize sağlar. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, airbrush yöntemini kullanın. Matris çözeltisi ile ticari sınıf ucu kullanarak doldurun. <ol><li> 8-12 santim uzakta slayt püskürtücü tutun dilim bir ince sprey hedefliyoruz. Geçişler arasında ise, 1 dk en iyi kristal oluşumuna izin vermek için matris kurumasını bekleyin. Havalı fırçalar kadar 10-20 geçer matrisi 22 arasında optimum bir tabaka elde etmek için gereklidir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, yüceltme yöntemi başka ayrıntılı kullanın. 25,27 </li><li> Bağımsız olarak matris uygulama yönteminin önceden MALDI-MSI için en az 30 dakika boyunca bir desikatör içinde kuru kayar. 25 </li></ol> Bir MALDI-TOF Sisteminin Kullanılması 8. MALDI-MSI Analizi (yani, autoflex III) NOT: Bu bölümde MALDI-TOF görüntüleme deney parametrelerini ayarlamak için talimatlar ve tavsiyeler içermektedir. Ins bağlıtrument üretici ve yazılım kullanılan, süreç değişebilir. <ol><li> Güvenli görüntü İTO kaplı slaytlar bağlı 3D hücre kültürü dilimleri 75 mm x 25 mm slayt tutmak için yapılan bir adaptör slaytlar takın. Aracı haline slayt adaptörü yükleyin. </li><li> Söz konusu kitle aralığı için uygun bir kalibrasyon standardı seçerek MALDI-MSI aleti hazırlayın. Küçük moleküllerin sorgulama için, kullanılan matris, α-CHCA uygun bulgulanan sinyaller, kalibranlarla biri ortak bir gruptur. Proteinlerin analizi için, ilgi konusu kütle aralığı bilinen proteini standartları (yani, ubikitin, tripsinojen) seçilebilir ve kalibranlarla 3D hücre kültürleri bitişik fark vardır. Yöntem geliştirme ile devam etmeden önce cihazı kalibre. </li><li> Önceki görüntüleme, cihaz üreticisi tarafından sağlanan yazılım kullanılarak seçim kütle aralığı için veri elde etme yöntemlerini geliştirmek. Bakınız Şekiller 1 ve 2 içinküçük molekül ve protein görüntüleme. Küçük moleküllü görüntüleme için, en yüksek kitle çözünürlük modunu reflektron kullanın. <ol><li> 100-1,000 m / z arasında 8,000- 25,000 m / z arasındaki proteinler için küçük molekül veri toplama için kitle aralığını ayarlayın. Alet ile mümkün olan en yüksek kitle çözünürlük sunarken seçim bölgesini kapsayacak şekilde kitle aralığını ayarlayın. </li><li> Lazer gücü, frekans, kalibrasyon çözümü ve yakındaki bir &#39;kurbanlık&#39; 3D hücre kültürü dilim kullanarak lazer çekim ve spot boyutu sayısını ayarlayın. Ana enstrüman kontrol yazılımı bu ayarları uyun. % 60 güç, 400 lazer çekim, ultra küçük nokta boyutu: tavsiye edilen başlangıç ​​noktası olarak aşağıdaki ayarları kullanın. Bu ayarlar araçlar ve yöntemler arasında değişir, bu yüzden her özel araç için en kaliteli spektrumları vermek için enstrüman parametreleri optimize eder. Ayarlanabilir diğer parametreler dedektör kazanç, örnek oranı, ve elektronik kazanç vardır. Sgörüntüleme yazılımı kullanmak için bu yöntemi ave (yani., AutoExecute Yöntemi FlexImaging üzerine çekecektir ki). Not: tesbitine müdahale etmeyecek şekilde ilgi kütle aralığı altında Bastırma iyonları (yine cihaz kontrolü olarak bulunur). </li><li> Seçim kütle aralığı için protein veri toplama yöntemlerini geliştirin. Yukarıda belirtilen aynı adımları uygulayın, ancak orta-yüksek kütle aralıkları için, yaklaşık 3 kDa üzerinde, doğrusal kipi kullanmak. NOT: Ayarlar küçük molekül yöntemleri için kullanılanlardan farklı olacaktır. </li></ol></li><li> Böyle Bruker MALDI-TOF sistemleri için FlexImaging gibi enstrüman üreticisi tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı kullanarak Kur özgü MS cihazı parametreleri. <ol><li> Yöntemleri önce geliştirilen ve kaydedilmiş kullanarak, yeni bir görüntüleme dosya ve klasör oluşturun. Böyle raster nokta (adım 8.3.2 veya Madde 8.3.3 kurulum) enstrüman kontrol yöntemi kurmak boyutu (yaklaşık 200 um 50 um varsayılan değişim), ve pozisyonlara gibi enstrüman parametreleri seçin3D Hücre kültürü üzerinde tarama yon. </li><li> Sırayla her lazer hareketli, numune üç Uygun öğretmek noktalarını seçin. &#39;Baskı ekranı&#39; kullanarak MALDI-TOF lazer kontrol yazılımı optik fotoğraf edinin. NOT: Birçok görüntüleme yazılımı programları &#39;öğretmek&#39; bir tarayıcı veya sık sık enstrüman kamera ile elde edilebilir lazer bulunduğu yazılımı, numune bir optik fotoğraf gerektirir. </li></ol></li><li> Ardından görüntüleme yazılımı (değil araç kontrolü) den görüntüleme işlemini başlatmak ve her dilim kitle spektrumları kazanır. Belirli alanlarda lokalize çoğu 3D hücre kültürü karşısında kitleleri ve diğerleri uyun. </li></ol> 9. İsteğe Bağlı Veri Analiz Yöntemleri <ol><li> Hedeflenen analizi için, ortalama spektrumunda bir kitle tıklayarak spektrumları manuel analizi gerçekleştirmek, ya da (görüntüleme yazılımı otomatik olarak belirli bir eşiğin üzerinde kitleleri almak için izin örn., Ab zirveleri) Üst% 20 barajını ove. Kalite kontrolü için, matris doruklarına dağıtım veya ortalama spektrumunu incelemek. </li><li> Ar veya Matlab gibi matematiksel yazılım ekstre veri setleri ile istatistiksel analizler gerçekleştirin. <ol><li> Seçim yazılımı içine yüklemek için ASCII formatında, bir okunabilir bir metin dosyasına, İhracat tek spektrumları. </li><li> , Birkaç farklı yazılım programları tarafından 28 okuma mzML formatında ASCII, mzXML, bireysel spektrumları dönüştürme -. 31 ya da analiz (.img) dosya biçimi, MRI gibi diğer görüntüleme uygulamaları için kullanılan ortak bir biçimi olarak veri ihracat 32 analizi için iki açık kaynak seçenekleri MSiReader ve BioMap 32,33 vardır. </li><li> Dosyaları yazılım tarafından okunabilir bir biçime ihraç edildikten sonra, ilgili yazılım talimatları yoluyla veri kümesini yükleyin. Yükleme sonrasında, bu tür temel çıkarılması ve normalleşme gibi, alım sonrası işlem gerçekleştirmek. </li><li> Bu veri kümesi ile, Amerika gerçekleştirmekörneğin Matlab 18 gibi yazılım algoritmaları inşa özel komut dosyaları veya kullanarak hiyerarşik kümeleme temel bileşen analizi gibi STICAL tedaviler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., R&#246;mpp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+imaging.">Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).</li><li>Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-FTICR+imaging+mass+spectrometry+of+drugs+and+metabolites+in+tissue.">MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue.</a> Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).</li><li>Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+drug+candidates+in+tissue+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).</li><li>Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+molecular+analysis+of+whole-body+animal+tissue+sections+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).</li><li>Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).</li><li>Guenther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+by+mass+spectrometry:+label-free+tissue+characterization+obtained+from+high-accuracy+bioanalytical+imaging.">Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).</li><li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+mass+spectrometry--looking+beyond+classical+histology.">Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. a., Kreutz, M., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids:+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+to+study+tumour+biology.">Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology.</a> Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Fernandes, T. G., Kwon, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li><li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry:+From+tissue+sections+to+cell+cultures.">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li><li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+three-dimensional+cell+culture+systems.">Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems.</a> Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li><li>Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Therapeutics+in+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry.">Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).</li><li>Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Confocal+Raman+Microscopy+for+Studies+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Sections.">Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections.</a> Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).</li><li>Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures.">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PloS one. 6 (5), 18940 (2011).</li><li>Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. a. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein+in+3D+neural+stem+cell+culture:+a+hybrid+visualization+methodology.">Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology.</a> J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).</li><li>He, W., Kuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Comparison+of+3D+and+2D+Glioma+Models+Reveals+Increased+HLA-E+Expression+in+3D+Models+is+Associated+with+Resistance+to+NK+Cell-Mediated+Cytotoxicity.">Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).</li><li>Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Imaging+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).</li><li>DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).</li><li>Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+paper+based+tissue+washing+method+for+mass+spectrometry+imaging:+localized+washing+and+fragile+tissue+analysis.">An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Sublimation/Recrystalization+for+Imaging+Proteins+by+Mass+Spectrometry+at+High+Spatial+Resolution.">Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).</li><li>Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections.">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li><li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules.">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li><li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML:+a+single,+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output).">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li><li>Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

Yukarıda belirtilen yöntemler kullanılarak, 3D hücre kültürleri büyütülmüş ve MALDI-MSI ile analiz edilebilir. Ne zaman uygun bir şekilde. 9,10 Tedavi, yani, çok fazla kez geçen düşük geçiş numaraları edilmemiş hücrelerin kültive edilmesi için alınması gereken bir çok kültürlenmiş ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri 3D yapılar oluşturacaktır. Genel olarak, on ve alt geçişi numaraları ile hücreler 3D hücre kültürlerinin yetiştirilmesi için uygun bulunmaktadır. Geleneksel agaroz destek 3D hücre kültürleri Büyüyen bu sistemi denemek için 3D hücre kültürü ile ilgilenen araştırma grupları için uygun maliyetli bir yol sağlar. Bu yöntem değildir zaten çoğu memeli hücre kültürü laboratuvarlarında birkaç bileşenleri kullanır. Dikkat dikkat büyümesi için agaroz levhalardan hazırlanması dikkat edilmelidir 3D hücre kültürleri bir boyut ve şekilde tutarlı olacak şekilde; dikkat edilmesi gereken bazı yönleri herhangi bir hava kabarcığı karışımına ilave edilir ve uygun bir menisküs her birinin alt ağ oluşturulduğu şekilde tutulmuş olduğunu kontrol etmek,ell. Menisküs düzgün formu yoksa, hücreleri, küremsi şekiller ya da küçük topaklar halinde gelişebilir. Ayrıca, bakım sferoidlerle jelatin içine PBS yerleştirmek için dikkat edilmelidir. Bu durumda, 200 ul pipet kullanarak jelatin üst PBS kaldırmak. Fiyatı bir faktör değilse, çok düşük bir bağlanma yuvarlak taban levhaları ticari olarak temin edilebilir ve bu adımların sadeleştirilmesi sunmaktadır. Diğer doku gömme yöntemleri de pahalı olmayan kütle spektrometrisi uyumlu olabilir, jelatin gömme ucuz ve çok yönlü hem de olduğu gösterilmiştir. 3D hücre kültürleri yüksek kalitede veri elde etmek için, yukarıda özetlenen Hazırlık stratejileri optimize edilmiştir. Jelatin gömme kütle spektrometresi analizi ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiş olmakla birlikte, bu işlem, yardımcı-kristalleştirme için uygun matrisler dar yapar. Dondurulmuş sonra, 3D hücre kültürleri sürece dondurularak çözülmüş değildir gibi ay boyunca stabildir. jelatin donmuş zaman opak olur, ve 3D cepKültürler benzer bir renk vardır, bu yüzden dilimleme yardımcı olmak için 3D hücre kültürü yerleştirme belgelemek için dondurmadan önce tavsiye edilir. Slaytları hazırlanırken, matris çeşitli farklı yöntemlerle uygulanabilir, ancak bazı matrisler kullanılamaz örnek oluşturma, örneğin ferulik asit, jelatin, ile birlikte kristalize olduğu bulunmuştur unutulmamalıdır. Daha küçük matris kristaller daha tutarlı kitle spektrumu üretir. Handspotting matris uygulamasının basit bir yöntem olmasına rağmen, daha büyük bir çözücü hacmi daha büyük kristal boyutlarının ve önemli analit göç neden olabilir. Kütle spektrometresi olarak, başlangıç ​​analizleri için gerekli olan uzmanlık azalttı MALDI-MSI teknolojileri gelişmeler. Veri toplama ve analiz ITO kaplı slaytlar yüksek kaliteli bilgi edinmek için bile bir acemi izin Çoğu sistemde, üzerinde basittir. Yakındaki olmayan görüntü layık 3D cep Kültür optimize cihaz parametrelerinin dikkatli seçimi,es, yüksek kalitede veri elde etmek için önemlidir. Örneğin, lazer gücü artan pik yoğunluğunu artırabilir ancak lazer gücü azalan çözünürlüğü artırmak ve daha simetrik pik şekilleri verebilir. 3D hücre kültürleri, uygun örnek kalitesini sağlamak için dilimleme sonra hızlı bir şekilde kullanılmalıdır. Protein sinyalinin bozulması (20 kDa üstünde) özellikle yüksek kütle bölgesinde, uygun saklama (Desikatör / -80 ° C dondurucu olmadan) daha az bir hafta içinde görülebilir. Nedeniyle artan talep nedeniyle, birçok farklı görselleştirme yazılım programları geliştirildi ve araştırma halka ücretsiz edilmiştir. Çoğu görüntüleme kitle spektrometre her cihazda kullanılan tescilli formatları ile tek kitleleri görselleştirmek için gerekli yazılım yüklü. Bu yazılım programları verileri tek kitle görüntüleri elde etmek ve ihracat için kullanılabilir. Çoğu yazılım da ilgi iki veya daha fazla kitlelerin kaplamayı sağlayacaktır. Ayrıca, MSI verileri birçok farklı izleyiciler gibi MSiReader An gibi, indirmek için ücretsizd BioMap. Ayrıca ön plana daha yararlı bilgiler getirerek, kolaylıkla alım sonrası işlenebilir elde edilen 32,33 kütle spektrometresi veri. Proteinlerine lipidlere farmasötik kaynaktan, yukarıda belirtilen sistem 3B hücre kültürü yapısı boyunca, ilgi konusu moleküllere dağılımını değerlendirmek için hızlı veri edinimi için izin verir. Seri kesitler 3D hücre kültürü bir dilim her 2D görüntü oluşturarak görüntünün tamamını 3D yapıyı alınabilir. protokol teknikleri ve notlar tek tabakalı kültürü ve hayvan modelleri arasında bir köprü olarak üç boyutlu hücre kültürü başlamak isteyen araştırmacılara yararlı olacaktır. Hakim sonra, bu teknikler, bu hangisi örnekleri görüntünün araştırmacılar izin 3D hücre kültürleri, doku ve hücre çok tip için uygulanabilir.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

MSI görüntüleme 3D hücre kültürlerinde çok farklı moleküler dağılımı ortaya çıkarmak için bir potansiyele sahiptir. Yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak, küçük moleküller, büyük proteinleri (Şekil 1) (Şekil 2) gelen türler kültür boyunca izlenebilir. Bu sonuçlar MSiReader. 32 Sonuçlar ilgi bir bölge ya da tüm taranan bölgede ya görselleştirme yazılımı ile 3D hücre kültürü üzerinde ilgi tek iyonları için analiz edilebilir ücretsiz araç ile tek iyon görselleştirme göstermektedir. Ayrıca çoğu yazılım otomatik keşif çalışmalarını yardımcı olabilir kullanıcı tarafından belirlenen belli bir eşiğin üzerinde iyonları görselleştirmek olacaktır. Tek iyon haritaları elde edildikten sonra, çoğu yazılım iyonlarının ko görmek görüntüleri bindirmek için bir yeteneğini de içerir. Ya yaklaşımları keşif-tabanlı veya hedeflenen bir şekilde, kütle spektrometresi görüntüleme 3D hücre kültürleri analiz etmek için güçlü bir araçtır. Şekil 3D hücre kültürü büyümesi ve kesit. Sol) önce hasat gün 14 inceledi gibi sağlam bir kolorektal HCT-116 3D hücre kültürü yapısının Optik görüntü 1. Temsilcisi sonuçları. Sağ) bir kolorektal 3D hücre kültürü çözülme yaklaşık ekvator dilim Optik görüntü görüntüleme için bir ITO kaplı slayt üzerine monte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Şekil 3D hücre kültürü. Üst) düşük kütleli (küçük molekül) aralığında α-CHCA ile elde ortalama kütle spektrumları bir ekvator bölümünde küçük molekül MALDI-MSI 2. Temsilcisi sonuçları. Bottom) Temsilcisi görüntüleriTek bir kütle: 327.8 m / z esas olarak 3D hücre kültürü ve iç lokalize 429,7 m / öncelikle 3D hücre kültürünün kenarına lokalize z. Kesikli çizgi sfero yaklaşık kenarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Şekil 3D hücre kültürü. Üst) yüksek (protein) kütle aralığında sinapik asit ile elde ortalama kütle spektrumları bir ekvator bölümünde MALDI-MSI protein görüntüleme 3. Temsilcisi sonuçları. Altta) tek bir kitle Temsilcisi görüntüleri: öncelikle sfero kenarına lokalize 10.871 m / z ve daha sfero içine doğru lokalize 12.184 m / z. Kesikli çizgi sfero yaklaşık kenarını belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models at JoVE.com

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre çizgileri, 3D hücre kültürleri, biyolojik araştırmaları için değerli bir model olarak yetiştirilebilir. Bu protokol numune hazırlama platformu gelişmeler de dahil olmak üzere 3D hücre kültürleri, kütle spektrometresi görüntüleme açıklanır. Bu protokolün amacı kütle spektrometresi görüntüleme analizi için 3D hücre kültürleri hazırlamak için kullanıcılardan etmektir.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.0K Görüntüleme.  University of Notre Dame.  Ölümsüzleştirilmiş kanser hücre çizgileri, 3D hücre kültürleri, biyolojik araştırmaları için değerli bir model olarak yetiştirilebilir. Bu protokol numune hazırlama platformu gelişmeler de dahil olmak üzere 3D hücre kültürleri, kütle spektrometresi görüntüleme açıklanır. Bu protokolün amacı kütle spektrometresi görüntüleme analizi için 3D hücre kültürleri hazırlamak için kullanıcılardan etmektir. 

Video: Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Biyomühendislik

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

3D Stromal-Endotelyal Hücre Ko-Kültürünün Kurulması

3D Akustik Montaj Cihazı Kullanarak Tek Tip Hücre Sferoidlerinin Ölçeklenebilir Üretimi

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Yazar Spotlight: Yüksek Kaliteli 3D Hücre Küresel Kültürü için İskelesiz Akustik Montaj Yönteminin Geliştirilmesi 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Hücre sferoidlerinin seri üretimi için üç boyutlu akustik montaj cihazı

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...