We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. İzleme transselüler İn Vivo Time-lapse Görüntüleme By prion-benzeri Proteinlerin Yayılma NOT: C büyütün standart yöntemlere ve dikkatli bir şekilde kültür sıcaklığı 47 kontrol göre elegans vahşi tip (WT) (N2) ve transgenik çizgiler. <ol><li> C transjenik çizgileri oluşturmak elegans monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile etiketlenmiş prion proteini gibi, ifade. Mikroenjeksiyon 48 nasıl kullanılacağını gösterir bu videoyu izleyin. Bu ekstrakromozomal satırları nasıl entegre açıklayan Daha detaylı bilgi ve yöntemleri için, 49 bkz. </li><li> Yumurta standart yöntemlere göre 50 döşeme veya ağartıcı senkronize popülasyonlar hazırlayın. <ol><li> Yumurtlayarak Senkronizasyon <ol><li> Transferi 10-20 gebe bir plaka üzerinde yetişkin ve onları 1 yumurtalarını izin - 2 saat. Plaka yetişkin çıkarın ve döl istenen yaşına kadar büyümesine izin. </li></ol></li> &lt;ağartma tarafından li&gt; Senkronizasyon <ol><li> Gebe yetişkin eşleşmemiş olan bir popülasyon toplamak ve alkalin hipoklorit çözeltisi (250 mM NaOH ve 1: 2 konumundaki H O ticari ağartıcı 4 (h / h) seyreltme) ile, peroksijen ağartıcıdır. 2 O 7H, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, 1 dH 2 O toplayın M9 tampon 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · iki kez (218 xg az 1 için) yumurta yıkayın L) sokuldu. </li><li> Bunları 20 ° C / nazik ajitasyon O ile M9 tampon N yumurtadan izin verin. Solucan geliştirme senkronize nüfusu bırakarak, bir besin kaynağı yokluğunda L1 aşamasında tutuklama olacaktır. OP50 E. ile seribaşı taze Nematodu Büyüme Medya (NGM) plakalar üzerine L1S Transferi E. coli bakteri ve döl istenen yaş 47 kadar geliştirmek verelim. </li></ol></li></ol></li><li> 50 tarif edildiği gibi, bir mikroskop lamı üzerine (H2O)% 2 agaroz pedleri hazırlayın. <ol><li> İki mil hazırlayınbunların tüm uzunluğu boyunca yerleştirilmiş etiketleme bant ile mikroskop slayt ayırıcılar olarak kullanılır. Aralarında üçüncü bir mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Temiz slayt üzerine H 2 O 2% agaroz ve pipet bir damla eritin. </li><li> Agar damla üstüne diğer üç slaytlar dik dördüncü slayt yerleştirin. Yavaşça etiketleme bant aynı kalınlıkta pedi düzleştirmek için bastırın. </li><li> Aralayıcıları kaldırılması ve hafifçe birbirinden slaytlar çekerek önce 1 dakika kurumaya bırakın. Agar ped bunlardan birine sopa olacak. </li></ol></li><li> Pipet ~ 10 ul anestezik pedi ve transfer (2 mM levamizol M9 tampon) ~ bir platin tel çekme kullanarak 10 hayvan. Bir kapak kayma (~ 22 x 22 mm) ile kaplayın ve 1 saat içinde görüntüleri almak. </li><li> Seçenek olarak ise, daha uzun bir süre boyunca film elde etmek için ya da daha fazla, hayvanların herhangi bir hareket olasılığını azaltmak anestezi ve boncuk hareketsizleştirme 51 bir arada kullanımı. <ol><li> 10% aga hazırlayın(M9 tampon) 51 tarif ve 3 ul Nanokürecikli boyutu standartları çözüm solucanlar (polistiren boncuklar, 100 nm) artı 3 ul anestezik (M9 tampon 4mM Levamizol) ekleyin yastıkları yükseldi. Bir kapak kayma hafifçe örtün. Kuruma önlemek için, valap (vazelin, lanolin ve parafin mumu eşit miktarda karışımı) ile kapak kayma mühür. </li></ol></li><li> Görüntü konfokal mikroskop kullanılarak solucanlar hareketsiz. NOT: Sonuçlar bir EM-CCD kamera ve MetaMorph gibi bir Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı ile donatılmış bir İplik Disk AF Konfokal Mikroskobu kullanılarak elde edilen ve aşağıda özelliklerini ana hatlarıyla, ancak diğer karşılaştırılabilir konfokal görüntüleme sistemleri de tercih edilebilir. <ol><li> 63X veya 100X / 1.4NA yağı hedefi kullanın ve mikroskop lamı tutucuya yerleştirin solucanları içeren mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Yazılımını açın. MRFP görüntüleme için lazer gücü ve filtreleri ayarlayın. % 10 güç ve emisyon filtresi&gt; 600 nm 561 nm lazer kullanın. </li><li&gt; Aç &quot;Çok Boyutlu Toplama&quot;. &quot;Ana&quot; sekmesinde, &quot;Timelapse&quot; ve &quot;Run Dergiler&quot; (: kapalı Donanım Otomatik Odaklama) için onay kutularını. </li><li> &quot;Tasarruf&quot; sekmesinde seçmek veya dosyaların kaydedilmesi gereken dizin klasör oluşturun. Dosyaya bir ad atayın. </li><li> &quot;Dalga Boyu&quot; sekmesi altında uygun aydınlatma seçmek ve pozlama ve kazancını ayarlayın. 100 ve 300 ms ve 100 ile 300 arasında bir kamera artışı arasında bir maruz kalma ile &quot;YokoQuad Kırmızı&quot; (ya da MRFP görüntüleme için eşdeğer aydınlatma ayarı) kullanarak, tek tek örnek olarak (canlı görüntü ile değerlendirildi). </li><li> &quot;Timelapse&quot; sekmesi altında &quot;zaman noktalarının sayısı&quot; = 301, &quot;Süre&quot; = 5 dk ve &quot;Zaman / Aralığı&quot; = 1 sn seçin. </li><li> &quot;AFC SET Z TUT&quot; ve &quot;Z TUT için AFC dön&quot;, Türü: &quot;Dergiler&quot; sekmesi seçin Journal altında &amp;# 8220; Özel &quot;(iki kez), Başlangıç ​​Noktası:&quot; Başlat zaman noktası &quot;ve&quot; zaman noktası Sonu &quot;. Bu otofokus seçenek görüntünün daha uzun bir süre boyunca aynı bölümü için önemlidir. </li><li> Kurulum tamamlandığında, basın &quot;Acquire&quot;. timelapse Video ayrı TIFF dosyaları olarak safed edilir. </li><li> ImageJ belirli bir zaman serisinin tüm .tiff dosyaları açın. &quot;Image&quot; → &quot;Yığınlar&quot; → &quot;Yığınlarına Görüntüler&quot; gidin. İsteğe bağlı olarak, → &quot;File&quot; altında film İhracat, vb boyut çubuğu eklemek, parlaklık ve kontrast ayarı → &quot;AVI ...&quot; &quot;olarak Kaydet&quot; (bir örnek için, Video 1 ve 2 Şekil 1&#39;e tekabül bakın). </li></ol></li></ol> 2. Özerk ve Non hücre Özerk Proteostasis ve Toksisite Etkileri Hücre Araştırma Katlanır Sensörleri ve Stres Gazeteciler kullanma <ol><li> Bir katlama sensörü veya stres önce bildirilmiştir birlikte açığa transgenik hatları oluşturunBirlikte prion-benzeri protein r. Çarpılar kurmak veya transgenik çizgiler oluşturmak için nasıl yöntemler için, 48,49,52 bkz. C listesi için bakınız Tablo 1 kullanılabilir elegans suşu. </li><li> Transgenik hayvanların senkronize popülasyonları hazırlayın ve (bölüm 1.2) 50 yukarıda anlatıldığı gibi istenilen yaşına kadar onları büyümek. </li><li> Bir Stereomikroskopta kullanarak, katlama sensörü veya stres muhabiri ilgili fenotip incelemek. <ol><li> Katlama sensörü için, senkronizasyon sonra her gün agrega barındıran hayvanların sayısını belirlemek (bir örnek için, Şekil 2E ve F). </li><li> Stres haberci için, deney habercisinin artmış floresan prion-benzeri protein sonuçları birlikte ekspresyonu (örnek için, bakınız Şekil 3) gösterir. </li></ol></li></ol> C. prion kaynaklı zehirlilik Önlenmesi 3. genom Ekran elegans<img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> RNAi tarama protokolü 4. şematik gösterimi Şekil. Bireysel adımların ayrıntılı bir açıklama için protokol bölümüne 3 Bkz. <ol><li> C. Senkronizasyon elegans solucanlar ve RNAi kütüphane çoğaltılması <ol><li> RNAi ekran için, Ahringer RNAi kütüphane (veya Vidal RNAi kütüphanesi) 53,54 kullanın. % 10 gliserol ile takviye edilmiş 100 ul LB-amp ortamı ile plakaları (LB içinde 50 ug / ml ampisilin) ​​doldurarak 96 gözlü levhalar içine, orijinal 384 gözlü formattan RNAi kütüphane Rearray ve 96 pimli çoğaltıcı kullanarak inoküle. -80 ° C&#39;de ajitasyon ve mağaza ile 37 ° CO / N büyür. </li><li> C koruyun elegans WT ve 20 ° C NGM üzerinde plakaları transgenik hatları OP50 E. ile seribaşı standart yöntemlere göre 47 E. coli bakterisi. </li><li>Ağartma tarafından prion etki transgenik ve WT (kontrol) nematod senkronize (bölüm 1.2). </li><li> Solucanlar ağartılmış aynı gün, 50 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş LB ortam hazırlar. Dağıtmak için otomatik bir reaktif dağıtıcı kullanma (veya pipet el ile), 96 gözlü bir plakanın her oyuğuna LB-amp ortamının 65 ul. </li><li> -80 ° C den 96 de Ahringer RNAi kütüphane plakaları çıkarın ve kağıt havlu ile kaplı steril bir kaput getirmek. Hemen plakaları hala donmuş ise plakaların dış buz kirlenmesini önlemek için dikkatli olmak, baş aşağı plaka tutarak mühür-bandı çıkarın. Plakaları Reinvert ve bunları yaklaşık 30 dakika çözülme sağlar. </li><li> Bir taze LB-amp plaka içine sonra bir RNAi kütüphane plaka içine bir steril 96 pimli çoğaltıcı batırın ve. Her plaka için taze steril çoğaltıcısının kullanın. Yapışkanlı folyo bant ile tüm plakaları Seal ve -80 ° C kütüphane plakaları dönün. çoğaltıcılar, çamaşır suyu ile ıslatılmış çalkalanabilir,ve tekrar kullanılmak üzere otoklavlanmıştır. </li><li> Çoğaltılmış RNAi plakalar 37 ° C ve 300 rpm&#39;de ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde O / N büyümeye izin verin. HT115 E. kullanmak için E. coli, bir kontrol olarak boş bir vektör (L4440) barındıran bakteri, bir kültür tübü içinde ayrı olarak büyür ve daha sonra iki 96 gözlü levhalar dörtte biri bir çok kanallı pipet ile kültür 65 ul pipetle. </li></ol></li><li> Bakteriyel dsRNA&#39;nın üretim ve solucanların ilavesinden indüksiyonu <ol><li> Ile kombine edilmiştir 2 O içinde bir 5 mM konsantrasyona kadar izopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) seyreltin Dağıtmak için çok kanallı bir kafa ile otomatik bir iş istasyonu kullanarak (veya pipeti el ile) RNAi bakteri ve kontrol plakalarının her bir oyuğuna seyreltildi IPTG 10 ul. Yeniden mühürlemek ve geri kuvöz içine plakaları yerleştirin. Bunların 37 ° C&#39;de 3 saat boyunca sallamak olsun. </li><li> Bakteriler sallayarak iken, solucanlar hazırlamak. Bir cam mikroskop lamı - (10 ul ~ 5) küçük bir örnek de M9 / solucan süspansiyon karıştırın ve pipetle. Saymaksteromikroskopla solucanlar sayısı ve ul başına solucanlar sayısını hesaplamak. </li><li> , 0.20 mg / ml IPTG, 8.0 ug / ml kolesterol 50 ug / ml ampisilin, 9.6 ug / ml tetrasiklin, 0,0835 ug / ml Fungizone, ve: Steril teknik kullanılarak, aşağıdaki nihai konsantrasyonları ile desteklenmiş M9 (M9 +) ihtiva eden bir çözelti hazırlamak 50 ul başına 15 solucanlar. <ol><li> Prion etki transgenik ve WT solucanlar için ayrı çözümler olun. Nihai (aşağıya bakınız), kopyalanan RNAi plakalarının sayısına bağlıdır gerekli M9 + solucan çözeltisinin hacmi artı ~ otomatik dağıtıcı kullanılırsa, rezervuar içinde kalır ölü hacim 30 mi. </li></ol></li><li> Bakteriyel dsRNA&#39;nın üretimi 3 saat indüksiyon sonrası, inkübatör dışına plakaları almak ve onları hayvanlar vurgulayarak ısı önlemek için RT (~ 30 dk) soğumasını bekleyin. </li><li> Her RNAi plakaları kuyu ve boş vektör kontrol plakaları birine 50 ul M9 + prion alanı transgenik solucan çözümü dağıtın. Yapmakhayvanlar rezervuar altına birikme eğiliminde her adımdan önce solucan çözüm karıştırmak için emin olun. </li><li> İkinci kontrol plakasına WT solucanlar dağıtın. Havalandırma sağlamak için mühürsüz plakaları bırakın. 5 tabak ve birlikte nemli bir kağıt havlu ve alüminyum folyo ile sarın - buharlaşan sıvı kültürü korumak için, 4 yığını. 4 gün boyunca 20 ° C&#39;de 200 rpm&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Puanlama NOT: inkübatör 4 gün sonra, solucanlar yetişkinliğe ikinci gününde olması ve ekran hazır olacaktır. Hayvanlar rahatsız dayak sağlamak için tarama önce 30 dakika süreyle olmayan sallayarak koşullarına uyum edelim. <ol><li> Kontrol tedavi prion alanı transgenik hayvanlara kıyasla artmış dayak için görsel bir monitör, ekran bir bilgisayara bağlı bir Falcon 4M60 kameranın kullanılması. </li><li> WrMTrck kullanarak onaylamak için ön hit bir listesini derlemek (bir sonraki bölüme bakınız). </li></ol></li></ol> Preliminary 4. OnayEkran Hits <ol><li> Katı plakalar üzerinde Motilite deneyi <ol><li> Standart yöntemlere 47 göre 100 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml tetrasiklin ve 1 mM IPTG ile takviye NGM ile tabak hazırlayın. Mümkünse, tüm plakalar daha akıcı bir video toplama işlemi için izin verecektir medya aynı yüksekliğe sahip sağlamak için bir plaka dökme makinesi kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de ve 250 rpm&#39;de ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampisilin, O / N farklı RNAi klonlar büyütün. </li><li> Bir sonraki gün, 3 saat süre ile, 1 mM IPTG ile dsRNA&#39;nın ifadesini teşvik eder. Ince bir tabaka halinde yayılır, her RNAi bakteriyel klon 150 ul, plak Tohum. Karanlıkta ve oda sıcaklığında 2 gün boyunca kuru bakteri olsun. RNAi klon başına 3 tabak hazırlayın. </li><li> Standart yöntemler 50 (bölüm 1.2) göre ağartıcı solucan nüfus senkronize ve yumurta ambar O / N M9 medyayı izin. </li><li> Sonsuz bir süspansiyon örneği alın ve NEM miktarını belirlemekstereomikroskopta ul başına atodes. 30 L1 solucanlar - 25 içerecek şekilde Ardından, her deneysel plaka içine M9 artı solucanlar uygun hacmi pipetle. Solucanlar yetişkinliğe gün 2 ulaşana kadar 4 gün boyunca 20 ° C&#39;de nematod büyütün. </li></ol></li><li> ImageJ için wrMTrck eklentisi ile solucan hareketlilik kantitatif analizi NOT: Video Hamamatsu Orca-R2, dijital kamera C10600-10B ve Hamamatsu Basit PCI görüntüleme yazılımı ile 10X büyütmede bir skala kullanılarak kaydedildi. <ol><li> Kamera ve Basit PCI görüntüleme yazılımı açın. Görüntüleme koşulları ayarlanması için izin vermek için &quot;Canlı&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Aşağıdaki gibi video koşullarını ayarlayın: Kazanç = 0; Işık Modu = Yüksek; Hız Endeksi = 1; Binning = 2. &quot;Otomatik Açığa&quot; ve ardından mikroskop aynalar ve parlaklık ve kontrast kadranları hareketli, aydınlatma koşulları ayarlayın. NOT: Video overexp olmadan yüksek kontrast olması gerekirhayvanlar parlak arka plan üzerine siyah şekiller görünür, böylece bırakılmıştı. </li><li> &quot;Zaman Scan&quot; seçeneğini tıklayın ve bir klasör ve dosya adını seçin. 20 msn &quot;Alan Gecikmesi&quot; Set ve 30 sn &quot;Zamanda Dur&quot;. (Çoğu solucanlar nerede) kaydetmek için plakanın alanı seçmek için basın &quot;Live İnceleme&quot;. Görünümü ve basın &quot;Başlat&quot; alanındaki konumunu teyit hızlı, sahnede plaka 3 veya 4 kez dokunun. </li><li> Film kayıt tamamlandıktan sonra, resmin üzerine sağ tıklayın ve bir avi bir .cxd formatta filmi ihracat &quot;İhracat Montaj Sırası&quot; seçin. </li></ol></li><li> Motilite videoları analiz <ol><li> , ImageJ yazılımı açın &quot;Eklentiler&quot; sekmesine gidin, ardından &quot;wrmtrck&quot; ve &quot;wrMTrck Toplu&quot; seçeneğini seçin. Tüm dosyaları içeren dizini seçin analiz edilecek. </li><li> Figür detaylı olarak wrMTrck_Batch ana giriş penceresinde, giriş değerleri yüklemekE 5C. Parametrelerin her biri için açıklama eklentisi eşlik kılavuzunda bulunabilir. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın ve hareket analizi çalışmasına izin. </li><li> Sonuçları küratörlüğünü ve algılanan tüm parçaları gerçek C&#39;den onaylamak için elegans ve ortadan kaldırmak eserler, her film için oluşturulan .txt dosyaları her açmak ve bir veri analiz yazılımı dosya bilgileri kopyalayın. Oluşturulan &quot;* _labels.zip&quot; dosyaları açın ve elle kontrol etmek ve yanlış solucan parçaları ortadan kaldırmak için ortaya çıkan &quot;* _labels.tif&quot; çalıştırın. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Burada tarif edilen yöntemler yayılan göstermek için yardımcı ve prion-benzeri proteinler kompleks hücre otonom olmayan hücre otonom toksisitesi. Son zamanlarda, bir agregasyon eğilimli sitosolik prion alan bir Otofaji ilgili süreç içinde membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine alınmış olduğunu keşfettik. Bu vesikül spesifik bir alt kümesi içindeki hücre ve doku 40 ile prion etki taşır. canlı bir hayvanda hareketlerini izlemek için anahtar proteinin, sadece MRFP-etiketli proteinle...

Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve bulaşıcı sünger tipi ansefalopatiler (TSEler) dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıklar, agregasyon eğilimli proteinler ile ilişkili ve dolayısıyla birlikte, protein yanlış katlanması bozuklukları (pmds şekilde bilinmektedir ). Her ikisi de insanlarda ve hayvanlarda 1 enfeksiyona sebep olabilir ki TSEler veya prion hastalıkları pmds benzersiz bir sınıfını teşkil ederler. Moleküler düzeyde, prion alımı ve patolojik β-tabaka zengin PrPSc konformasyonunda 2,3 içine monomerik α-sarmal zengin konak-kodlanmış hücresel PRP (PrP C) dönüştürerek çoğaltmak. Kendi kendine ilerleyen Protein topakları ayrıca memeli prion 4,5 ile önemli özellikleri paylaşan mantarlar içinde tanımlanmıştır. Buna ek olarak, bir memeli, prionlar hücreden hücreye hareket edebilen ve naif hücreleri 6,7 enfekte etmektedir. Pmds OTH daer TSE&#39;ler bulaşıcı değildir, daha onlar prion hastalıkları 8,9 ile ortak bir patojenik ilke paylaşıyoruz. Pmds her birine bağlı proteinler yapı veya fonksiyonunda ilgili olmasa da, bir kristalleşme gibi süreci ile tüm form agrega çekirdekli denir ya polimerizasyonu numaralı seribaşı; üstelik proteinli tohumlar onların çözünür izoformlarını 2,10,11 işe alarak büyür. öz-yayılmasına verimliliği birlikte, moleküler chaperones gibi ek hücresel faktörlerle sonuçta toplam çekirdeklenme, tohumlama, parçalanma ve 12-15 yayılma oranlarını belirlemek protein içsel özelliklerine bağlı olarak, in vivo değişir. Bu nedenle, protein agregasyonu verimli yayılmasını izin veren bu faktörler arasında ince bir denge bulunmalıdır. Sadece bazı Amiloidojenik agrega bir prion özelliklerini barındıran ve böylece tüm pmds bulaşıcı Bu yüzden de açıklayabilir. Prionlar &#39;üst-sanatçıların o temsil görünüyorOnlara pmds 8,13 incelemek için güçlü bir araç yapar kendini kopyalayan proteinli agrega fa geniş spektrumlu,. Ilginç bir hastalıkla ilişkili agrega ile ilişkili toksisite genellikle olmayan bir hücre özerk bileşeni 16,17 sahiptir. Bu durum, sadece hücreler, gen sergilediğini belirli bir fenotip ifade ima katı bir hücre otonom etkisi, aksine, ilgili geni ifade etmeyen komşu hücreleri üzerinde etki anlamına gelir. Bu zorlayıcı dokuya özel ekspresyon gösterdiği veya nörodejeneratif hastalıklar 18-26 çok sayıda model ilgili proteinlerin yıkmak edildi. Çeşitli mekanizmalar azalmış besin kaynağı, nöronal sinyalleşme dengesizlik, glutamat eksitotoksisitesi ve nöro 16,27,28 içeren pmds bu sigara hücrenin otonom toksisite için bir temel olarak önerilmiştir. Buna ek olarak, hücreler arasında hastalığa bağlı agregalar prion-benzeri hareket might Bu açıdan 29,30 katkıda bulunur. Giderek artan kanıtlar, prionlar dışındaki protein inklüzyonlar özelliği de pmds 30-36 gözlenen patolojinin yayılma açıklayabilir, hücreden hücreye iletmek düşündürmektedir. Ancak, henüz hastalık proteinlerin hücreler arası hareket ve komşu hücreler üzerinde toksik etkisi arasında net bir nedensel bağlantı olup olmadığı belirlenecek olan. Bu nedenle, hücre-hücre iletim ve olmayan hücre özerk toksisite altında yatan hücresel yolların daha iyi anlaşılması yeni tedavilerin geliştirilmesi için gerekli ve önemlidir. Bununla birlikte, Metazoan&#39;da olarak yanlış katlanmış proteinler, hücre-hücre iletim etkileyen yayılması ve hücresel faktörlerin prion-benzeri birçok yönü de organizma seviyesinde, özellikle anlaşılamamıştır. Caenorhabditis elegans nematod potansiyeli sağlamak çeşitli avantajları vardır prion-benzeri SPREADI yeni yüzleri keşfedeceksinizMetazoan&#39;da 17 ng. Bu, in vivo canlı bir organizmada floresan etiketli proteinleri izleme sağlayan saydamdır. Ayrıca, hastalıktan etkilenen birçok hücresel ve fizyolojik süreçler insana solucanlar korunmuş, ve C edilir C. elegans, genetik manipülasyon ve moleküler ve biyokimyasal analizler 37-39 çeşitli elverişlidir. Tam 959 somatik hücreler hala kas, nöronlar ve bağırsak dahil olmak üzere birçok farklı doku tipleri vardır basit bir vücut planına sahip yetişkin hermafrodit makyaj. C. yeni bir prion modeli kurmak için elegans, biz solucanlar 4,40 bilinen hiçbir endojen prion proteinleri vardır çünkü dışsal olarak, iyi karakterize glutamin / asparagin (Q / N) sitozolik maya prion proteini Sup35 olan bakımından zengin prion alanı NM ifade seçti. Maya prionların prion çoğaltma 41-44 temel mekanizmaların tanıtılması çok değerli olmuştur. Ayrıca, NM FIRmemeli hücre kültüründe 45,46 bir prion tam yaşam döngüsü özetlemek gösterilmiştir st sitosolik prion-benzeri protein. Benzer şekilde, C olarak ifade edildiğinde elegans, mitokondriyal bütünlüğü ve görünüm bozulması dahil 40. NM toplama derin toksik fenotip ile ilişkili maya hücreleri ve prion biyoloji sergilenen temel özellikleri karşılaştırıldığında metazoan hücrelerde yayılması için farklı ihtiyaçlarına oldukça iyi kabul Sup35 prion alanı Hücresel düzeyde çeşitli otofaji ilgili kesecikler, yanı sıra embriyonik ve larva tutuklama, gelişimsel gecikme ve organizma düzeyinde protein katlanması ortamının yaygın bir rahatsızlık. Çarpıcı, prion etki transgen ifade değildi hangi komşu dokuları etkileyen, hücre özerk olmayan hücre özerk toksisite sergiler. Ayrıca, hücreler içinde ve arasında prion etki vesiküler taşıma gerçek zamanlı olarak izlenir &lt;em&gt; in vivo 40. Burada C prion-benzeri yayılmasını incelemek için nasıl açıklamak elegans. Biz time-lapse floresan mikroskobu kullanarak prion alanı içeren veziküllerin içi ve hücreler arası ulaşım izlemek için nasıl açıklayacağız. Biz doku-spesifik katlama sensörleri kullanımını vurgulamak ve her yerde bulunan hücresel fitness hücre özerk olmayan hücre özerk etkilerini değerlendirmek için stres gazetecilere dile olacaktır. Son olarak, biz prion kaynaklı toksisite yeni değiştiricileri belirlemek için bir süre önce gerçekleştirilen genom RNA enterferans (RNAi) Ekranın prosedürü anlatacağız. Kombinasyon halinde, bu yöntemler, protein arası hareketi ve olmayan hücre otonom toksisite yer genetik yolları ayrı takılmak için yardımcı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

In vivo time-lapse görüntüleme ile prion-benzeri proteinler yayılması hücrelerarası İzleme Transgenik C. Prion domainini ifade eden C. elegans hatları prion-benzeri proteinler, örneğin, hücreden hücreye intikal olmayan hücre otonom toksisite bazı yönlerinin analizi için özel olarak uygundur. sağlayan floresan izleme hayvanların şeffaflık hayatın her aşamasında canlı organizma içinde proteinlerin etiketledi. Bu ya...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans at JoVE.com

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K Görüntüleme.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Video: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.