We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Monitoraggio transcellulare Diffusione delle proteine ​​prioniche come in vivo Time-lapse imaging NOTA: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) e linee transgeniche secondo metodi standard e controllare attentamente la temperatura di coltivazione 47. <ol><li> Generare linee transgeniche di C. elegans esprimere la proteina prionica simile, taggati con proteina monomerica fluorescente rossa (MRFP). Guarda questo video che illustra come utilizzare microiniezione 48. Per ulteriori dettagli e metodi che descrivono come integrare queste linee extracromosomici, vedi 49. </li><li> Preparare popolazioni sincronizzati da deposizione delle uova o imbianchimento secondo metodi standard 50. <ol><li> La sincronizzazione per la deposizione delle uova <ol><li> Transfer 10-20 adulti gravide su un piatto e lasciarli depongono le uova per 1 - 2 ore. Rimuovere gli adulti dalla piastra e lasciare che la progenie crescere fino all&#39;età desiderato. </li></ol></li> &lt;li&gt; Sincronizzazione per sbiancamento <ol><li> Raccogliere una popolazione non sincronizzato di adulti gravide e candeggiare con soluzione alcalina ipoclorito (NaOH 250 mM e 1: 4 (v / v) diluizione del candeggiante commerciale in H 2 O). Lavare le uova due volte (218 g per 1 min) con tampone M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, aggiungere dH 2 O fino a 1 L). </li><li> Consentire loro di schiudono in tampone M9 con agitazione O / N a 20 ° C. Sviluppo Worm arresterà nella fase L1 in assenza di una fonte di cibo, lasciando una popolazione sincronizzato. Trasferire L1S sul fresco nematodi crescita media (NGM) piastre seminati con OP50 E. coli, batteri e lasciare che la progenie di sviluppare fino a quando il 47 di età desiderata. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare 2% agarosio (pastiglie in H 2 O) su un vetrino 50 come descritto. <ol><li> Preparare due kmvetrini croscope con nastro etichettatura posto sopra tutta la loro lunghezza da utilizzare come distanziatori. Inserire un terzo vetrino da microscopio tra loro. </li><li> Sciogliere 2% agarosio in H 2 O e pipetta una goccia sul vetrino pulito. </li><li> Inserire una quarta diapositiva perpendicolare agli altri tre slitte sulla cima della goccia agar. Premere delicatamente il basso per appiattire il pad allo stesso spessore del nastro di etichettatura. </li><li> Lasciare asciugare per 1 minuto prima di rimuovere i distanziali e tirando delicatamente le diapositive a parte. Il pad agar si attacca a uno di loro. </li></ol></li><li> Deporre circa 10 ml di anestetico (levamisolo 2 mM in tampone M9) per il pad e trasferimento ~ 10 animali con un pick filo di platino. Coprire con un vetrino (~ 22 x 22 mm) e prendere le immagini entro 1 ora. </li><li> In alternativa, per acquisire i filmati su un periodo di tempo più lungo o di ridurre ulteriormente la possibilità di qualsiasi movimento degli animali, utilizzare una combinazione di anestetico e tallone di immobilizzazione 51. <ol><li> Preparare 10% agapastiglie rosa (in tampone M9) come descritto 51 e aggiungere vermi a 3 ml soluzione standard di dimensioni nanosfere (perle di polistirene, 100 nm) più 3 ml di anestetico (levamisolo 4 mM in tampone M9). Coprire delicatamente con un vetrino. Per evitare la disidratazione, sigillare il vetrino con VALAP (miscela di uguali quantità di vaselina, lanolina e cera di paraffina). </li></ol></li><li> Immagine immobilizzato vermi utilizzando un microscopio confocale. NOTA: I risultati sono ottenuti utilizzando un Spinning disco AF confocale microscopio equipaggiato con una fotocamera EM-CCD e di un software di Microscopia Automation &amp; Image Analysis come MetaMorph e delineano le specifiche di seguito, ma altri sistemi comparabili di imaging confocale possono anche essere utilizzati. <ol><li> Utilizzare l&#39;obiettivo olio 63X o 100X / 1.4NA e posizionare il vetrino contenente vermi nel supporto microscopio. </li><li> Aprire il software. Regolare potenza del laser e filtri per l&#39;imaging MRFP. Utilizzare il laser 561 nm al 10% di potenza e delle emissioni filtro&gt; 600 nm. </li><li&gt; Apri &quot;MultiDimensional Acquisition&quot;. Nella scheda &quot;Principale&quot;, selezionare le caselle per &quot;Timelapse&quot; e &quot;Run Journals&quot; (Hardware Auto Focus: off). </li><li> Nella scheda &quot;Salvataggio&quot; selezionare o creare la cartella directory in cui devono essere salvati i file. Assegnare un nome al file. </li><li> Nella scheda &quot;Lunghezza d&#39;onda&quot;, selezionare l&#39;illuminazione adeguata e regolare l&#39;esposizione e il guadagno. Utilizzare &quot;YokoQuad Red&quot; (o un&#39;impostazione illuminazione equivalente per l&#39;imaging MRFP) con una esposizione tra 100 e 300 msec e un guadagno telecamera tra 100 e 300, a seconda del singolo campione (valutata utilizzando l&#39;immagine dal vivo). </li><li> Nella scheda &quot;Timelapse&quot; selezionare &quot;Numero di punti di tempo&quot; = 301, &quot;Durata&quot; = 5 min e &quot;Time / Intervallo&quot; = 1 sec. </li><li> Sotto la &quot;Journals&quot; tab selezionare Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; e &quot;AFC Return to Z HOLD&quot;, Type: &amp;# 8220; Speciale &quot;(due volte), punto di partenza:&quot; Inizio ora point &quot;e&quot; End of time point &quot;. Questa opzione autofocus è importante per l&#39;immagine della stessa sezione su un periodo di tempo più lungo. </li><li> Quando il setup è stato fatto, premere il tasto &quot;Acquisisci&quot;. Il video timelapse è Safed come file TIFF separati. </li><li> Aprire tutti i file TIFF di una data serie storica in ImageJ. Andare su &quot;Immagine&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Immagini Stacks&quot;. Facoltativamente, regolare la luminosità e il contrasto, aggiungere bar dimensioni, ecc esportare il filmato in &quot;File&quot; → &quot;Salvo&quot; → &quot;AVI ...&quot; (per un esempio, vedere Video 1 e 2 corrispondente alla figura 1). </li></ol></li></ol> 2. Utilizzando pieghevoli Sensori e Reporters stress per Indagare cellulare autonoma e non cellule autonoma influisce sulla Proteostasis e tossicità <ol><li> Generare linee transgeniche che coesprimere un sensore di piegatura o stress reporter insieme con la proteina prionica simile. Per i metodi su come stabilire croci o generare linee transgeniche, vedi 48,49,52. Vedere la Tabella 1 per un elenco di C. ceppi elegans che possono essere utilizzati. </li><li> Preparare popolazioni sincronizzate di animali transgenici e di farle crescere fino all&#39;età desiderata come descritto in precedenza (punto 1.2) 50. </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, esaminare il relativo fenotipo del sensore di piegatura o stress giornalista. <ol><li> Per il sensore di piegatura, determinare il numero di animali ospitano aggregati di ciascun giorno dopo la sincronizzazione (per esempio, vedere la Figura 2E e F). </li><li> Per il giornalista stress, prova se la coespressione dei risultati proteina prionica simile a un aumento di fluorescenza del reporter (per esempio, vedere la Figura 3). </li></ol></li></ol> 3. Schermo Genome-wide per soppressione di tossicità Prion-indotta in C. elegans<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figura 4. Rappresentazione schematica del protocollo di screening RNAi. Vedere sezione Protocollo 3 per una descrizione dettagliata delle singole fasi. <ol><li> Sincronizzazione di C. worm elegans e duplicazione di biblioteca RNAi <ol><li> Per lo schermo RNAi, utilizzare la libreria Ahringer RNAi (o la libreria Vidal RNAi) 53,54. Rearray biblioteca RNAi dall&#39;originale 384 format e in 96 pozzetti riempiendo le piastre con 100 microlitri LB-amp media (50 mg / ml ampicillina in LB) integrati con il 10% di glicerolo e inoculare con un replicatore 96-pin. Coltivare a 37 ° CO / N con agitazione e conservare a -80 ° C. </li><li> Mantenere C. elegans WT e linee transgeniche a 20 ° C su NGM piastre seminate con OP50 E. coli secondo metodi standard 47. </li><li>Sincronizzare transgenici dominio prione e WT (controllo) nematodi sbiancamento (vedi sezione 1.2). </li><li> Lo stesso giorno che i vermi sono sbiancati, preparare mezzi LB integrato con 50 mg / ml di ampicillina. Utilizzare un distributore automatico di reagente per erogare (o pipetta manuale) 65 l di media LB-amp in tutti i pozzetti di una piastra ben 96. </li><li> Rimuovere 96 e piastre di libreria Ahringer RNAi da -80 ° C e portarli ad una cappa sterile, foderato con carta da cucina. Rimuovere immediatamente la guarnizione nastro tenendo la piastra capovolta mentre piastre sono ancora congelati, avendo cura di evitare la contaminazione da ghiaccio sulla parte esterna delle piastre. Reinvert i piatti e lasciarli scongelare per circa 30 min. </li><li> Immergere una sterile 96 pin replicatore in un RNAi piatto biblioteca, e poi in una nuova piastra LB-amp. Utilizzare un replicatore fresca sterile per ogni piatto. Sigillare tutti i piatti con adesivo nastro di alluminio e restituire le piastre di libreria a -80 ° C. I replicatori possono essere immersi in candeggina, risciacquati,e sterilizzati in autoclave per essere usato di nuovo. </li><li> Lasciare piastre RNAi duplicati di crescere O / N in un incubatore a 37 ° C e 300 rpm. Per utilizzare HT115 E. coli batteri ospitanti il vettore vuoto (L4440) come controllo, crescono separatamente in una provetta di coltura e quindi pipettare 65 ml di coltura con una pipetta multicanale in un quarto dei due piastre da 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Induzione della produzione dsRNA batterica e l&#39;aggiunta di vermi <ol><li> Diluire isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ad una concentrazione di 5 mM in DDH 2 O. Utilizzare una workstation automatizzata con una testa multicanale per erogare (o pipetta manuale) 10 ml di IPTG diluito in tutti i pozzetti dei batteri RNAi e le piastre di controllo. Richiudere e posizionare le piastre di nuovo nel incubatore. Lasciate che agitare per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Mentre i batteri sono agitazione, preparare i vermi. Mescolare la / sospensioni verme M9 bene, e pipetta un piccolo campione (~ 5-10 microlitri) di un vetrino da microscopio in vetro. Contareil numero di vermi allo stereomicroscopio e calcolare il numero di worm per ml. </li><li> Usando una tecnica sterile, preparare una soluzione integrata M9 (M9 +) con le seguenti concentrazioni finali: 0.20 mg / ml IPTG, 8,0 mg / Colesterolo ml, 50 ug / ml ampicillina, 9,6 ug / ml tetraciclina, 0,0835 mg / ml Fungizone, e 15 vermi per 50 ml. <ol><li> Fai soluzioni separate per transgenici dominio prioni e vermi WT. Il volume finale della soluzione verme M9 + necessario dipenderà dal numero di piastre RNAi copiati (vedi sotto), oltre a ~ 30 ml di volume morto che rimarrà nel serbatoio, se viene utilizzato un distributore automatico. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;induzione 3 ore di produzione dsRNA batterica, prendere i piatti fuori dell&#39;incubatore e lasciarli raffreddare a RT (~ 30 min) per evitare il calore stress agli animali. </li><li> Pipettare 50 microlitri dominio prionica soluzione verme transgenico M9 + a ciascun pozzetto di piastre RNAi e una delle piastre di controllo vettoriale vuoti. FareAssicurarsi di miscelare la soluzione verme prima ogni passo come gli animali tendono a sedimentare sul fondo del serbatoio. </li><li> Dispensare vermi WT nella seconda piastra di controllo. Lasciare le piastre non sigillati per consentire l&#39;aerazione. Per mantenere la coltura liquida di evaporare, impilare 4 - 5 piatti insieme e avvolgere con un tovagliolo di carta umido e un foglio di alluminio. Incubare a 200 rpm a 20 ° C per 4 giorni. </li></ol></li><li> Punteggio NOTA: Dopo 4 giorni in incubatrice, i vermi saranno al secondo giorno di età adulta e sono pronti a schermo. Lasciate che gli animali si abituano a condizioni non si stringono per 30 minuti prima di screening per assicurare botte indisturbati. <ol><li> Usando una telecamera Falcon 4M60 collegata a un computer con un monitor, schermo visivo per una maggiore botte rispetto di controllo trattati dominio prioni animali transgenici. </li><li> Compilare un elenco di visite preliminari per confermare con wrMTrck (vedere la sezione successiva). </li></ol></li></ol> 4. Conferma di preliminareHits schermo <ol><li> Motilità test su lastre solide <ol><li> Preparare piatti con NGM integrati con 100 mg / ml di ampicillina, 12,5 mcg / ml tetraciclina e 1 mM IPTG, secondo metodi standard 47. Se possibile, utilizzare una macchina-piatto versando per assicurare tutte le lastre hanno la stessa altezza dei media, che consentirà un processo di acquisizione di video più snello. </li><li> Grow diversi cloni RNAi in ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampicillina, O / N a 37 ° C e 250 rpm. </li><li> Il giorno successivo, indurre l&#39;espressione del dsRNA con 1 mM IPTG per 3 ore. Seed le piastre con 150 ml di ogni clone batterico RNAi, si sviluppa in uno strato sottile. Lasciate che i batteri a secco per 2 giorni a temperatura ambiente al buio. Preparare 3 piastre per RNAi clone. </li><li> Sincronizzare la popolazione verme sbiancando secondo metodi standard 50 (vedere paragrafo 1.2), e lasciare che le uova si schiudono O / N in M9 media. </li><li> Prelevare un campione della sospensione senza fine e determinare la quantità di nematodes per microlitri al stereomicroscopio. Poi, pipetta la quantità corretta di M9 più vermi in ogni piatto sperimentale in modo che contenga 25-30 vermi L1. Crescere i nematodi a 20 ° C per 4 giorni, fino a raggiungere i vermi giorno 2 di età adulta. </li></ol></li><li> L&#39;analisi quantitativa del verme motilità con il plugin wrMTrck per ImageJ NOTA: I video sono stati registrati usando uno stereomicroscopio a 10X di ingrandimento con un Hamamatsu Orca-R2 fotocamera digitale C10600-10B e il software di imaging PCI Simple Hamamatsu. <ol><li> Accendere la fotocamera e il software semplice di imaging PCI. Clicca su &quot;Live&quot; per consentire la regolazione delle condizioni di imaging. </li><li> Impostare le condizioni video come segue: Guadagno = 0; Light Mode = Alta; Velocità Index = 1; Binning = 2. Fare clic su &quot;Auto Exposé&quot; e quindi regolare le condizioni di luce, spostando gli specchi microscopio e di luminosità e contrasto quadranti. NOTA: Il video deve avere un alto contrasto senza essere Sovraesposed, in modo che gli animali appaiono come figure nere su sfondo luminoso. </li><li> Clicca su &quot;Time Scan&quot; e scegliere una cartella e un nome di file. Impostare &quot;Campo Delay&quot; a 20 msec e &quot;Stop a Time&quot; per 30 sec. Premere &quot;Live Review&quot; per scegliere la zona della piastra di registrazione (dove la maggior parte vermi). Toccare la piastra 3 o 4 volte sul palco, subito confermare la sua posizione nel campo della visualizzazione e premere &quot;Start&quot;. </li><li> Dopo il film termina la registrazione, fate clic destro sull&#39;immagine e scegliere &quot;Esporta Montage Sequence&quot; per esportare il filmato da un formato ad un .cxd .avi. </li></ol></li><li> Analizzando i video motilità <ol><li> Aprire il software ImageJ, vai alla scheda &quot;Plugins&quot;, poi &quot;wrmtrck&quot; e selezionare &quot;Batch wrMTrck&quot;. Selezionare la directory contenente tutti i file da analizzare. </li><li> Nella finestra di immissione principale wrMTrck_Batch, caricare i valori di input, come specificato nel Figure 5C. Spiegazione per ciascuno dei parametri si trovano nelle istruzioni che accompagnano il plugin. Fare clic su &quot;OK&quot; e consentire l&#39;esecuzione di analisi del movimento. </li><li> Per curare i risultati e confermare che tutte le tracce rilevate sono da vera C. elegans ed eliminare artefatti, aprire tutti i file .txt creati per ogni film e copiare le informazioni in un file di software di analisi dei dati. Aprire le &quot;* _labels.zip&quot; i file creati ed eseguire il conseguente &quot;* _labels.tif&quot; per controllare manualmente ed eliminare le tracce di vermi falsi. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

I metodi descritti qui aiutano a illustrare la diffusione e la cella di tossicità autonoma cella complesso autonomo e non di proteine ​​prioniche-like. Abbiamo recentemente scoperto che un dominio citosolico prioni aggregazione incline è ripreso in vescicole di membrana in un processo di autofagia correlato. Un sottoinsieme specifico di queste vescicole trasporta il dominio prione all&#39;interno e tra cellule e tessuti 40. La chiave per monitorare il loro movimento nel animale vivente è che la protein...

Molte malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer (AD), malattia di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), sono associati con le proteine ​​di aggregazione a rischio e sono, quindi, noti collettivamente come misfolding disturbi (PMD ). EST o malattie da prioni costituiscono una classe unica di PMD in che possono essere infettivi in entrambi gli esseri umani e gli animali 1. A livello molecolare, i prioni replicano reclutando e convertendo monomerico α-elica-ricchi PrP cellulari host-codificato (PrP C) nel patologico β-sheet-ricchi PrP Sc conformazione 2,3. Aggregati auto-propagazione della proteina sono stati individuati nei funghi, che condividono caratteristiche importanti con prioni mammiferi 4,5. Inoltre, prioni mammiferi sono in grado di muoversi da cellula-cellula e infettare le cellule naïve 6,7. Mentre PMD OTHer di TSE non sono infettive, condividono un principio patogenetico comune con malattie da prioni 8,9. Sebbene le proteine ​​legate a ciascuna delle PMD non sono collegati in struttura o funzione, che tutti gli aggregati di forma tramite un processo di cristallizzazione simile chiamati nucleate o seminate polimerizzazione; inoltre semi proteici crescere reclutando i loro isoforme solubili 2,10,11. L&#39;efficienza di auto-propagano varia in vivo, a seconda delle proprietà intrinseche della proteina, che insieme con fattori cellulari aggiuntive come chaperon molecolari fine determinano tassi di nucleazione aggregata, semina, frammentazione e diffusione 12-15. Quindi, deve esistere un equilibrio tra questi fattori, che permette la propagazione efficiente di aggregazione proteica. Questo potrebbe anche spiegare il motivo per cui solo alcuni aggregati amiloidogenici ospitano le caratteristiche di un prione, e, quindi, non tutti i PMD sono infettive. I prioni sembrano rappresentare o &#39;top-performer&#39;fa ampio spettro di aggregati proteici auto-replicanti, che li rende un potente strumento per studiare PMD 8,13. Curiosamente, la tossicità associata con aggregati correlati alla malattia ha spesso una componente autonoma non cellulare 16,17. Ciò significa che influenzano cellule vicine che non esprimono il gene corrispondente, in contrasto con un effetto strettamente cella autonoma, il che implica che solo le cellule che esprimono il gene mostra il fenotipo specifica. Ciò è stato dimostrato dal convincente espressione tessuto-specifica o abbattere delle rispettive proteine ​​in numerosi modelli di malattie neurodegenerative 18-26. Diversi meccanismi sono stati proposti come base per questo non-tossicità delle cellule autonome in PMD, compresa la fornitura di nutrienti diminuita, squilibrio nella segnalazione neuronale, glutammato, e neuroinfiammazione 16,27,28. Inoltre, un movimento prione-come aggregati malattie legate tra cellule might contribuiscono a questo aspetto 29,30. Una crescente evidenza suggerisce che le inclusioni proteiche diverse da prioni possono trasmettere dalla cella-a-cella, il che può spiegare la caratteristica diffusione della patologia osservata in molti PMD 30-36. Tuttavia, è ancora da stabilire se vi sia un chiaro nesso causale tra movimento intercellulare di proteine ​​di malattia e l&#39;effetto tossico sulle cellule vicine. Pertanto, una migliore comprensione delle vie cellulari che sono alla base della trasmissione cellula-cellula e cellula tossicità non autonoma è necessaria ed essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Tuttavia, molti aspetti della prionica simile diffusione e cellulari fattori che influenzano la trasmissione da cellula a cellula proteine ​​mal ripiegate in metazoi non sono ben compresi, in particolare a livello degli organismi. Il nematode Caenorhabditis elegans ha diversi vantaggi che forniscono il potenziale per scoprire nuove sfaccettature di prioni come spreading in metazoi 17. È trasparente, consentendo in vivo inseguimento proteine ​​di fluorescenza contrassegnati nell&#39;organismo vivente. Inoltre, molti processi cellulari e fisiologici colpite dalla malattia sono conservati dai vermi per la salute umana, e C. elegans è anche suscettibile di una grande varietà di manipolazioni genetiche e le analisi molecolari e biochimiche 37-39. Esattamente 959 cellule somatiche formano il ermafrodita adulto con un piano di corpo semplice che ha ancora diversi tipi di tessuti diversi, tra cui muscolari, neuroni e intestino. Per stabilire un nuovo modello di prione in C. elegans, abbiamo scelto di esprimere esogenamente il ben caratterizzato glutammina / asparagina (Q / N) ricchi di prioni NM dominio del citosolico proteina prionica Sup35 lievito, poiché non ci sono noti proteine ​​prioniche endogene in vermi 4,40. Prioni di lievito sono stati inestimabili nel chiarire i meccanismi di base della replicazione prionica 41-44. Inoltre, NM è l&#39;abetest citosolica proteina prionica simile che ha dimostrato di ricapitolare l&#39;intero ciclo di vita di un prione in colture cellulari di mammifero 45,46. Analogamente, quando espresso in C. elegans, il dominio prione Sup35 adottata notevolmente bene alle diverse esigenze di propagazione in cellule metazoi rispetto alle cellule di lievito, caratteristiche principali esposti di prioni biologia aggregazione 40. NM era associato con una profonda fenotipo tossica, compresa la rottura dell&#39;integrità mitocondriale e dell&#39;aspetto vari vescicole autofagia relative a livello cellulare, così come arresto embrionale e larvale, ritardo dello sviluppo, e un disturbo diffusa dell&#39;ambiente ripiegamento proteico a livello organismal. Sorprendentemente, il dominio prione presenta cella cella tossicità autonome autonomo e non, che colpisce i tessuti adiacenti, in cui non è stato espresso il transgene. Inoltre, il trasporto vescicolare del dominio prione all&#39;interno e tra celle è monitorata in tempo reale &lt;em&gt; in vivo 40. Qui si descrive come esaminare prioni come la diffusione in C. elegans. Spiegheremo come monitorare il trasporto intra e intercellulare di vescicole che contengono il dominio prione con time-lapse microscopia a fluorescenza. Noi sottolineare l&#39;uso di sensori pieghevoli tessuto-specifici e ubiquitariamente espresso ai giornalisti di stress per valutare gli effetti delle cellule cellule autonome autonome e non sul fitness cellulare. Infine, descriveremo la procedura di uno schermo recentemente eseguito genoma ampio RNA interference (RNAi) per identificare nuovi modificatori di tossicità prioni indotta. In combinazione, questi metodi possono aiutare a prendere in giro a parte percorsi genetici coinvolti nel movimento intercellulare delle proteine ​​e la loro non tossicità delle cellule autonome.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Monitoraggio intercellulare diffusione di proteine ​​prioniche come in vivo time-lapse imaging Transgenici C. Linee elegans esprimono il dominio prione sono particolarmente adatti per l&#39;analisi di alcuni aspetti di proteine ​​prioniche come, ad esempio, la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomo. La trasparenza degli animali consente il monitoraggio di fluorescente contrassegnati proteine ​​dall&#3...

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Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K Views.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Video: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell&#39;ipossia sulla<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello

Indagare le proteine prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello