RAN peptidler Huntington hastalığı gibi tekrar genişleme nörodejeneratif bozuklukların bir özelliğidir, amiyotrofik lateral skleroz, ve frontotemporal demans. Bu protokoller, C.elegans model sistemindeRAN peptid toksisitesinin ölçülmesi için önemli bir standart yaklaşım sağlamaktadır. Açıklanan teknikleri öğrenmek için basit ve ucuz, hızlı bir şekilde yapılabilir ve hareket ve üreme gibi C.elegans sisteminin tekrarlanabilir özellikleri kaldıraç.
Bu protokolü denerken, en büyük zorluk tutarlı RAN peptid toksisitesi ve ekspresyonu elde etmektir. Kontrol etmek için önemli faktörler ilaç sıcaklığı, sıcaklık kaymaları zamanlaması ve adeneyplakaları hazırlanması içerir. Deneycilerin bu yaşa bağlı süreçte hayvanların fenotiplerini sürekli olarak sınıflandırmaları önemlidir.
Bu tekniğin görsel gösterimi sınıflandırma kriterlerini gösterir. 24-iyi plakalar içine bir milimoler IPTG ve mililitre carbenicillin başına 25 mikrogram ile standart nematod büyüme ortamı dökerek başlayın. LB carbenicillin agar üzerine HT115 bakteri conları besleme RNAi dışarı Çizgi ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece onları büyümek.
Ertesi gün, LB carbenicillin sıvı medya bir mililitre içine tek bir koloni almak ve 250 rpm sallayarak 37 santigrat derece 18 saat boyunca bakteri büyümek. Metin el yazmasında açıklandığı gibi 20 mikrolitre gecelik bakteri kültürüyle NGM RNAi 24 kuyunun dört ayrı kuyusu yerleştirin ve RNAi bakterilerinin bir gecede çift iplikçikli RNA üretimini teşvik etmesine izin verin. Entegre RAN peptid transgeni ifade eden yetişkin C.elegans'tan yumurtaları izole etmek için standart hipoklorit yöntemini kullanın.
Daha sonra 24 kuyulu tabağın her kuyusuna yaklaşık 30 yumurta tohumlayın ve tabağı yedi gün boyunca 20 derecede kuluçkaya yatırın. Video hız analizi yapmak için, tek renkli kamera ile donatılmış stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak her RNAi durumu için iki ayrı kuyudan iki video edinin. Kuyular arasında tutarlı edinme ayarlarını kullandığınızdan emin olun.
Her video için süreyi 10 saniye ve zaman aralığını 76 milisaniye olarak ayarlayın. Görüntü pozlama süresini dört milisaniyeye ayarlayın ve 1,49 yakınlaştırma ayarını kullanın. Sonra ikiyi ikişer ikişer seçin.
Çözünürlüğün 800'e 600 piksel olduğunu doğrulayın ve kaydetmeye başlayın. Satın alma sonra, zorlanma, RNAi durumu ve iyi numarası ile hemen her video etiket. Daha sonra her RNAi durumu için yaklaşık 40 solucan ın incelenmesiyle, video başına 20 farklı hayvan için kat edilen mesafeyi ve her hayvanın uzunluğunu ölçün.
Yazılımda, ek açıklama araçları düğmesini seçin. Sonra metin aracı çizin. Videonun ilk karesinde ölçülen solucanın merkezindeki bir noktaya tıklayın ve bir sayıyla işaretleyin.
Solucanı görsel olarak takip ederken videoyu sonuna kadar ilerletin. Sonra üzerine tıklayın ve bir sonraki karşılık gelen sayı ile işaretleyin. İlk sayıdan ikinci sayıya bir çizgi çizmek ve bir elektronik tabloda kat edilen mesafeyi kaydetmek için çizim ölçeği çubuğu aracını kullanın.
Analiz penceresindeki her bir ölçümü korurken videodaki diğer 19 solucan için bu ölçümü tekrarlayın. Ölçümler tamamlandıktan sonra, verilerin kaynağı olan hayvana kadar izlenabilmesi için tüm ölçüm çizgilerini gösteren son video çerçevesinin anlık görüntüsünü alın. Ardından, birinci sütunun solucan tanımlayıcısı, ikinci sütunun ise hızın olduğu dört sütunlu bir elektronik tablo kullanarak verileri çözümle.
Her videonun zamanı, denemenin altındaki videoya sağ tıklayarak ve özelliklerine giderek bulunabilir. Hız ölçümü normalleştirmek için, her hayvanın uzunluğunu bulmak. C.elegans'ı başın ucundan kuyruğun ucuna kadar serbestçe izlemek için çizim poliline aracını kullanın.
Ardından, tüm poliçizgileri gösteren son video çerçevesinin anlık görüntüsünü alın. Satırların uzunluğu istatistiklere göre kaydedilir. Elektronik tabloya biri hayvan uzunluğu, diğeri normalleştirilmiş hız için olmak üzere iki sütun ekleyin.
Son olarak, normalleştirilmiş hız verilerini, boş vektör RNAi'ye karşı post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanarak analiz edin. Ran peptid GFP'yi altı santimetrelik GFP RNAi plakasına ifade eden 4 ila 6 transgenik L4 C.elegan yerleştirin ve bunları 20 santigrat derecede büyütün. Deney RAN peptid toksisitesi üzerinde genetik etkileri test etmek için RNAi kullanıyorsa, iki boş vektör RNAi GFP RNAi veya gen-özel RNAi plakaları her 10 transgenik gravid yetişkin taşıyın.
Mutantlar RAN peptid toksisitesi üzerindeki genetik etkileri analiz etmek için kullanılıyorsa, iki boş vektör RNAi veya GFP RNAi plakasının her birine aynı RAN transgeniifade eden 10 gravid yabani tip veya mutant hayvan yerleştirin. 48 saat boyunca 20 derecede yetiştirin. RNAi plakalarından 10 adet transgenik L4 seti seçin ve her seti üç santimetrelik Bir RNAi plakası üzerine yerleştirin.
Test için seçilen solucanların yüzeysel olarak normal hareketliliğe sahip olduğundan emin olun. Nemi korumak ve 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için plakaları plastik bir torbaya yerleştirin. 24 saat sonra, diseksiyon mikroskobundaki plakaya dokunarak ve hareket olup olmadığını kontrol ederek hayvanları hareketlilik açısından analiz edin.
Bir solucan bir vücut uzunluğundan daha fazla hareket ederse, onu mobil olarak sayın ve yeni bir üç santimetrelik RNAi plakasına aktarın. Kalan solucanların başını ve kuyruğunu kullanmak için platin bir kazma kullanın. Hayvan bir vücut uzunluğundan daha fazla hareket ederse, hayvanı hareketli olarak sayın ve yeni bir üç santimetrelik RNAi plakasına aktarın.
İkinci güne kadar boş vektör kontrolünde önemli felç gözlenmezse, tetkiki sonlandırın ve baştan başlayın. Hareket etmeyen tüm solucanları bir araya getirin, böylece vücut uzunluğundan fazlasının hareketi kolayca tespit edilebilir. Tüm felçli, torbalı veya ölü solucanları sayın ve tabağı atın.
Beş ila yedi gün boyunca her gün felç için hayvanlar puanlama devam edin. Büyüme testi, G4C2 tekrar genişlemesi olan ALS hastalarında bulunan RAN dipeptidlerinin toksisitesi üzerindeki gen inhibisyonunun etkisini ölçmek için kullanılmıştır. PR50 GFP'nin tek başına ifadesi tam bir büyüme tutuklaması ile sonuçlandı, ancak çeşitli genlerin yıkılması gelişimsel toksisiteyi bastırdı.
Özel gen knockdowns pr50 ifade hayvanların gelişimsel hareketlilik üzerindeki etkisi video hız analizi yöntemi kullanılarak ölçüldü. Beklendiği gibi, PR50 GFP ekspresyonunun inhibisyonu boş vektör RNAi'ye göre hareketlilikte büyük bir artışa yol açtı. Ayrıca, proteozom alt birim RPN7 karşı RNAi PR50 hareketlilik önemli bir artış ile sonuçlandı.
Erişkin fenotipler yaşa bağlı felç analizi ile analiz edildiğinde PR50 GFP beş günlük tefeksme yol açtı. Ancak, RNAi gene cul-6 önemli ölçüde gecikmiş felç bu cul-6 PR50 GFP toksisitesi için gerekli olduğunu düşündüren yönelik. RAN proteinlerinin C.elegans nöronlarında ifade edildiğinde nöropatolojiye neden olup olmadığını belirlemek için komissür talimi kullanılarak nöron spesifik toksisite incelendi.
Gün iki yetişkin, motor nöronlarda PR50 GFP ekspresyonu motor nöron blebbing önemli bir artışa yol açtı. Bu nöropatoloji, insülin IGF reseptör geni homolog DAF-2'deki bir mutasyon la önemli ölçüde baskılandı ve bu mutasyon çeşitli nörodejeneratif proteinlerin toksik özelliklerini geciktirdi. Davranışsal teşbit için, RAN peptidler son derece penetratif fenotip üretmek önemlidir.
Bu tür genler veya ilaçlar RAN peptid hastalıkları için yeni biyobelirteçler veya tedavi seçenekleri sağlayabilir. Bu tahlilleri kullanarak, C9ORF72 ilişkili RAN peptid proin-arginin bastırıcılar için genom çapında RNAi ekran gerçekleştirdik. Bu ekranda tanımlanan genler gelecekteki mekanistik çalışmalara konu olacak birçok yeni ve korunmuş genler içerir.
