Bu eser Tıp Wake Forest Üniversitesi ile ortak araştırma anlaşması kapsamında RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) tarafından finanse edilmektedir. GL Prasad RJRT tam zamanlı çalışanı.

NOT: Yazılı onam bu çalışmayı yapmak İyi Klinik Uygulamaları başına, IRB onayı altında yerel bir klinik araştırma birimi elde edilmiştir. Kan işleme, PBMC&#39;ler ve diğer hücre kültürü izolasyonu mikrobiyolojik steril malzemeleri ve reaktifler kullanılarak steril koşullar altında gerçekleştirilir. 1. WS-CM Hazırlık <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 12 WS-CM oluşturun. <ol><li> 35-60-2, ml puf hacmi, saniyede puf aralığı, ve puf süresi: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Aşağıdaki sigara rejimi kullanan kırmızı fenol olmadan 1640 aracılığıyla dört 3R4F referans sigara dumanı geçirerek WS-CM hazırlayın sırasıyla saniye içinde. Her preparasyon bir 20 ml lik bir numuneyi oluşturur. </li></ol></li><li> Tarih, tamamlanmış zaman ve sigara adı ve numarası ile Etiket tüp (ler). -80 ° 500 ul tümbölenleri hemen sigaradan sonra tamamlanır C saklayın. </li><li> Dondurulmuş WS hacimde analizDaha önce açıklandığı gibi 12 -CM nikotin, tütün özel nitrosamine ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar düzeylerini belirlemek için. </li></ol> PBMC 2. izolasyonu <ol><li> (Tütün ürünlerinin olmayan tüketiciler) sağlıklı donörlerden taze kan toplayın Wake Forest Baptist Sağlık IRB 15 ayrı onayı altında aşağıda açıklandığı gibi taze kan PBMC&#39;leri izole. <ol><li> Kan torbasının varmadan önce, 500 ml şişe, makas, izolasyon tampon ve Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) (RT), bir biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) hücre kültürü kaputu hazır. İzolasyon tampon ışıktan korunmalıdır. </li><li> Baş aşağı kan torbasını tutun ve sadece borunun en az 3 cm bırakarak kenetlenmiş olan yerin altındaki tüp kesti. </li><li> 500 ml şişe kapağını çıkarın ve şişe açıklığının üzerindeki tüp tutun. Kan torbası Pick up ve kan t içine çantasından serbestçe akmasına izin için tersçanta boş dek şişe. Kan hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için düz aşağı olarak karşı şişenin iç duvarına üzerine akmasına izin verin. </li><li> Kana izolasyon tamponunda 5: 1 oranında bir şişeye yalıtım tamponu dökün. Sonu aşırı uç, 10 kere, sıkıca şişe kapağı ve yavaşça çevirin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, ışık ile kapalı inkübe hücre kültürü kaputu şişe bırakın. </li><li> Bir ışık, saman renkli tabaka kan üzerine kuracaksınız. 50 ml konik tüpler içine 25 ml serolojik pipet kullanarak bu katmanı kaldırın. Kan bağışında konuya bağlı olarak, 300 ml - toplanan miktar 50 arasında değişebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. </li><li> Koyu kan renkli pelet bırakarak, saydam süpernatant aspire. Pelet gevşek ama viskoz olacaktır. </li><li> Pipet 15 ml konik tüpler içine izolasyon tampon 3 ml. </li><li> Tekrar süspansiyon pelet, S toplanan saman renkli bir sıvı, her 50 ml DPBS 20 ml ilave2.1.5 TEP. Vortex iyice karıştırın, ve birden tüpler yeniden süspanse sıvıyı pekiştirmek için. Bu sıvı, kan hücreleri askıya içerir. </li><li> Bir transfer pipeti, Aşama 2.1.8 yalıtım tamponu, 3 ml üzerine bir transfer süspansiyon kan hücreleri, 5 ml. İki ayrı katmanlar oluşturmak için yavaş ve nazikçe hücre süspansiyonu içeren 15 ml konik tüp eğin. Minimal ivme ile ve frensiz oda sıcaklığında 40 dakika için 400 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> 50 ml konik tüp içine PBMC&#39;leri içeren ortaya çıkan bulutlu orta tabaka (buffy coat) kaldırmak için bir transfer pipeti kullanın. Bunun altındaki diğer açık katmanları çizim kaçının. Her biri 50 ml konik bir tüp içine en fazla 25 mi aktarın. </li><li> Hücreleri yıkamak için (50 ml konik tüp, tüm kalan hacminin doldurulması için ya da daha fazla) akan soğuk tampon maddesi 25 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Tampon çalışan 10 ml pelletini. Bu PBMC içerir. Hücreleri saymak ve im kullanındolaylı olarak ya da yer dondurma buz üzerinde. </li></ol></li></ol> 3. Dondurma ve PBMC&#39;leri Çözülme <ol><li> Santrifüj 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca aşama 2.1.13 toplandı PBMC&#39;ler. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropil alkol ile dondurma doldurun. DİKKAT: izopropil alkol yanıcı ve akut toksik. </li><li> % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ihtiva eden RPMI 1640 ortamı (4 ° C) pelet yeniden süspanse edin. Bu RPMI 1640 donma ortamıdır. 5 x 10 7 hücre / ml içeren bir süspansiyon ile sonuçlanacaktır orta dondurma bir miktar ile pelletini. Donma için kullanılabilir hücre sayısı değişecektir. </li><li> 2 mi cryotubes hücre süspansiyonu, 1 ml&#39;lik numuneler koyun ve dondurma kapta cryotubes yerleştirin. O / N depolamak ve daha sonra cryotubes çıkarın ve depolamak aktarmak için -80 ° C&#39;de bir dondurucuda cryotubes ile dondurma kap yerleştirin-190 ° C -150 ° C arasında, kriyojenik dondurucu. </li><li> Derin dondurucudaki depolamadan alınan cryotube çıkarın ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde, hafifçe çalkalanarak bunun hızlı bir şekilde eritin. </li><li> Hemen,% 10 FBS,% 1 Pen / Strep ve% 1 L-glutamin içeren 10 ml RPMI 1640 ortamında (4 ° C) bir 15 mL konik tüp içine cryotube eritilir PBMC&#39;ler aktarın. çözülmüş cryotube içeriği maksimal hücre canlılığı 15 elde etmek mümkün olduğunca çabuk transfer edilmelidir. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de PBMC&#39;leri santrifüj. </li><li> 5 ml RPMI 1640 tam orta ile pelletini tekrar ve hücreleri saymak. </li><li> Böyle tripan mavisi dışlama yöntemi olarak kurulan yöntemlerle hücre canlılığı ölçün. % 95 - Genel olarak, bu yöntemle hücre canlılığı ile ilgili 90&#39;dır. PBMC&#39;ler şimdi deneylerde kullanmak için hazır. </li></ol> 4. Hücre Ölümü Tespiti NOT: Burada listelenen Seyreltmeler bu stu amaçlıdırdy. seyreltikleri buna göre değiştirilebilir. <ol><li> 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM veya nikotin seyreltin / oyuk, aşağıda belirtildiği gibi. </li><li> Aşağıdaki konsantrasyonlara WS-CM seyreltilir: 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM nikotin içeriğine göre) eş-nikotin birimlerin 2,5, 3, 4, ve 5 mg / mL 12. </li><li> Aşağıdaki konsantrasyonlara RPMI ortamında nikotin seyreltilir: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 ve 3000 ug / ml. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu. </li><li> , 1 x 10 6 hücre / çukur konsantrasyonu ile her komple RPMI ortamı içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle. hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak. </li><li> Bu çalışmanın amaçlan için, yukarıdaki gibi plakalar iki takım hazırlanır. Levhaları kapatılır ve 24 saat ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 için, bir plaka, bir plaka inkübe edin. Gerektiği gibi zaman noktaları ayarlayın. </li&gt; <li> Buz gibi soğuk çalışan tampon 200 ul hücrelerin tekrar asılı tutulmasından son olarak, 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks tarafından oda sıcaklığında hücreleri yıkanır ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> / Oyuk 100 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa 7-aminoactinomycin D (7AAD) 5 ul ve ardından çalışan tampon 95 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> Küme tüplerine çalışan tampon 100 ul ekle. Küme tüplerine plakanın her kuyudan hücre süspansiyonu tüm hacmi aktarın ve akış sitometresi ile örnekleri kazanır. </li><li> Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi 7AAD-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. </li></ol> 5. EC50 belirlenmesi <ol><li> WS-CM ve nikotin EC50 değerleri PBMC&#39;lerin 7AAD pozitif boyama ile belirlenir. </li><li> EC50 değeri konsantre olarak tanımlanmaktadırentration olan hücrelerin% 50, 24 saat tahlilinde artık yaşayabilir halde olmuştur ve değerler eş-nikotin birim / ml ug olarak ifade edilir. </li><li> Bu çalışmanın amaçları için EC50 değerleri, sırasıyla, WS-CM ve nikotin 1.56 ug / ml ve 1650 ug / ml olarak tespit edildi. </li></ol> 6. Salgılanan sitokinler NOT: Burada listelenen Seyreltmeler Bu çalışmanın amacı içindir. seyreltme, uygun olarak ayarlanabilir. <ol><li> / Göz konsantrasyonunda 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM seyreltilir 0.3, 1.56, eş-nikotin birimleri 3 ve 5 ug / ml olmuştur. </li><li> Aşağıdaki konsantrasyonlara nikotin seyreltilir: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 ve 3000 ug / mL &#39;dir. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu. </li><li> , 1 x 10 6 hücre / çukur konsantrasyonu ile her komple RPMI ortamı içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle.hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak. </li><li> Plakası kapatılır ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> , 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks ve son olarak buz gibi soğuk 200 ul tampon çalışan ve yıkama adım bir kez daha tekrar eden süspansiyona, oda sıcaklığında hücreleri yıkayın. </li><li> RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Her bir oyuğa 10 ug / ml LPS ortamı 200 ul ekle. </li><li> Plaka Kapak ve 4 saat, 24 saat, 48 saat ya da 37 ° C&#39;de 72 saat% 5 CO2 inkübe edilir. Gerektiğinde inkübasyon sürelerini ayarlar. </li><li> 3 dakika boyunca 300 × g plaka Santrifüj. </li><li> Adım 7 ve 8 &#39;de tahlilleri yapmak için -80 ° C&#39;de bir dondurucuda her bir ve deposundan süpernatan 175 ul al. </li></ol> 7. Sitometrik Boncuk Dizisi Testi &lt;ol&gt; <li> CBA tahlilde adım 6.10 ve kullanım hazırlanan hücre süpernatantlar çözülme. Üreticinin talimatlarına göre sitometrik boncuk dizisi (CBA) deneyi gerçekleştirmek. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> IL-8 ELISA adım 6.10 ve kullanım hücre süpernatantlar çözülme. Üreticinin talimatlarına göre ELISA testi yapın. </li></ol> 9. Hücre içi Boyama ve Sitometrisi NOT: Burada listelenen Seyreltmeler Bu çalışmanın amacı içindir. seyreltme, uygun olarak ayarlanabilir. <ol><li> / Göz konsantrasyonunda 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM seyreltilir 0.3, 1.56, eş-nikotin birimleri 3 ve 5 ug / ml olmuştur. </li><li> Aynı plaka aşağıdaki konsantrasyonlara nikotin seyreltik: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 ve 4000 ug / ml. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevre hazar olduğunudous. </li><li> / Oyuk 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda RPMI tam ortam içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle. hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak. </li><li> Plakası kapatılır ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> Buz gibi soğuk çalışan tampon 200 ul hücrelerin tekrar asılı tutulmasından son olarak, 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks tarafından oda sıcaklığında hücreleri yıkanır ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Plaka RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Komple RPMI ortamı kullanılarak 2 ul / ml GolgiPlug çalışma konsantrasyonunu ve 10 ug / ml LPS hazırlamak ve her bir oyuğa 200 ul ekle. </li><li> 37 ° C&#39;de 6 saat ve% 5 CO2 plaka inkübe edin. </li><li> Aşama 9.8 sonunda tampon (4 ° C) çalıştıran ve 300 ile iplik hücreleri yıkayın4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca x g. </li><li> Her bir oyuğa Cytofix 100 ul ilave edin ve 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de 1x Permwash (4 ° C) ile adım 9.9 de tarif edildiği gibi hücreler 3 kez yıkayın. </li><li> Aşağıdaki antikorların birisi her birinden 5 ul her bir göze, ardından 45 uL 1x Sitoperm ekleyin her bir göze: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500 MIP-1α PE. 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1x Permwash (4 ° C) ve 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de tamponu (4 ° C) ile çalışan bir kez aşama 9.9 de tarif edildiği gibi hücreler iki kez yıkayın. </li><li> % 2 paraformaldehit (4 ° C) 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. 12 × 75 mm tüpler içine hücreleri aktarın ve akış sitometresinde örnekleri analiz. DİKKAT: Paraformaldehyde akut toksik ve bir sağlık tehlikesi, aşındırıcı olduğunu. </li></ol> 10. K562 Killing Testi Not: K562 hücrelerinin yetiştirilmesi gerekenRPMI tam ortam maddesi ile 37 ° C,% 5 CO2 de kültürde bu analizden önce% 80 kaynaşmaya kadar devam edilir. <ol><li> Flakon DMSO 18 ul ekleyerek suksinimidil esteri (KAKE) stok solüsyonu carboxyfluorescein 5 mM hazırlayın. </li><li> / Oyuk her bir için arzu edilen eş-nikotin birimleri veya nikotin konsantrasyonları elde etmek için 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM veya nikotin seyreltin. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu. </li><li> / Oyuk 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda RPMI tam ortam içine PBMC 100 ul ekle. WS-CM veya nikotin ile hücrelerin toplam hacim 200 ul / kuyucuk olacak. </li><li> Plakası kapatılır ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 400 xg&#39;de 10 DPBS ml ve santrifüj ekleyerek K562 hücreleri yıkayın. </li><li> DPBS 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve K562 hücreleri sayın. </li><li> KAKE worki hazırlayın1 ml DPBS için KAKE stok solüsyonu 1 ul ekleyerek ng çözümü. </li><li> 2 x 10 7 hücreleri 1 - ihtiva eden K562 hücre süspansiyonu 1 ml&#39;ye CFSE çalışma çözeltisi 1 ml ilave edilir. Vorteks ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tam inkübe edin. </li><li> Hemen FBS 200 ul ekleyin. Vorteks ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tam inkübe edin. </li><li> RPMI tam ortam, 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj tüpü. </li><li> RPMI Süpernatantı ve pelet kırmak ve RPMI tam orta 10 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve KAKE-etiketli K562 hücreleri saymak. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile plaka PBMC&#39;ler yıkayın. Sıvı boşaltılarak süpernatant aspire. Kapağı yerine takın ve plaka alt vorteks. RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> (: 1.5 x 10 6 PBMC&#39;ler 100,000 K562s) PBMC levha ve ayrıca her i örnek oyuğuna 1:15 oranında CFSE etiketli K562 hücreleri ekleyin37 ° C&#39;de 5 saat ve% 5 CO2 için ncubate. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücre karışımı yıkayın. Sıvı atarak süpernatant aspire. Kapağı yerleştirin ve plaka alt vorteks. </li><li> Tampon çalışan 200 ul ekleyin ve adım 10.14 bir kez daha tarif yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> / Oyuk 100 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa 7AAD 5 ul ve ardından çalışan tamponu 95 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> Her bir oyuğa çalışan tampon 100 ul ilave edin ve küme tüplerine plakanın her kuyudan hücre süspansiyonu tüm hacmi transferi ve akış sitometresi ile örnekleri kazanır. </li><li> Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi 7AAD-pozitif ve CFSE-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).</li><li>Zeller, M., Hatsukami, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strategic+Dialogue+on+Tobacco+Harm+Reduction:+a+vision+and+blueprint+for+action+in+the+US.">The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US.</a> Tob. Control. 18, 324-332 (2009).</li><li>Sopori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+on+the+immune+system.">Effects of cigarette smoke on the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).</li><li>Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tobacco-smoke+on+key+signaling+pathways+in+the+innate+immune+response+in+lung+macrophages.">Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages.</a> J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).</li><li>Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+inhibits+lipopolysaccharide-induced+production+of+inflammatory+cytokines+by+suppressing+the+activation+of+activator+protein-1+in+bronchial+epithelial+cells.">Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells.</a> J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).</li><li>Moodie, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+cigarette+smoke+alter+chromatin+remodeling+but+differentially+regulate+NF-kappaB+activation+and+proinflammatory+cytokine+release+in+alveolar+epithelial+cells.">Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells.</a> Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).</li><li>Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+induces+IL-8,+but+inhibits+eotaxin+and+RANTES+release+from+airway+smooth+muscle.">Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle.</a> Respir. Res. 6, 74 (2005).</li><li>Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+induces+coordinate+activation+of+HSF+and+inhibition+of+NFkappaB+in+human+monocytes:+effects+on+TNFalpha+release.">Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).</li><li>Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+alveolar+type+II+epithelial+cell+chemokine+release:+effects+of+cigarette+smoke+and+neutrophil+elastase.">Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).</li><li>Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+and+nicotine+product+testing.">Tobacco and nicotine product testing.</a> Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).</li><li>Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Regulatory+Science:+Research+to+Inform+Regulatory+Action+at+the+Food+and+Drug+Administration's+Center+for+Tobacco+Products.">Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products.</a> Nicotine Tob. Res. , (2014).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytotoxicity+of+different+tobacco+product+preparations.">Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).</li><li>Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cell-specific+cytotoxic+responses+of+oral+cavity+cells+to+tobacco+preparations.">Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations.</a> Toxicol In Vitro. , (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combustible+and+non-combustible+tobacco+product+preparations+differentially+regulate+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+functions.">Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li><li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry.">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li><li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells:+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay.">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li><li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells.">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li></ol>

The authors declare that there are no conflicts of interest.

Ve biz daha önce TPPs PBMC&#39;lerin tedavi ifadesi ve sitokinler ve hedef hücre 14 öldürme fonksiyonel önlemlerin salgısı dahil olmak üzere çeşitli yanıtları bastırdığını göstermiştir. Bir önceki çalışmada tarif deneysel yöntemler daha uzun kuluçka dönemleri gerektiren ve büyüklüğü 14 mütevazı idi. Temel için bu cazip ex vivo model potansiyel uygulamalarını göz önüne alındığında ve uygulamalı araştırma, bu çok aşamalı biyolojik deneylerde d...

Kardiyovasküler hastalık (CVD), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve kanser gibi kronik 1,2 sigara içiminin olumsuz sağlık etkileri için bilgi noktalarının önemli bir vücut. Kronik sigara içiminin inflamasyon ve immün baskılanması neden olduğu bilinmektedir ve bu değişiklikler sigara içenlerde 3 mikrobiyal enfeksiyon ve kanser riskine katkıda bildirilmektedir. In vitro ve ex vivo teknikleri yararlıdır patofizyolojik etkileri moleküler temelini aydınlatılmasında sigara dumanı 4-9 (Tablo 1) ve çeşitli tütün ürünleri 10,11 ortaya çıkan yönetmelik yönlendirmek için önemli araçlar olarak kabul edilmektedir. Örneğin, biz böyle bütün duman klimalı ortamda (WS-CM) ve toplam partikül madde (TPM) gibi yanıcı tütün ürünü preparatları (TPPs) çok daha sitotoksik ve zarar için olduğunu göstermiştirYanıcı olmayan TPPs veya nikotin 12,13 den DNA. Yayınlanan çalışma ile tutarlı olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs veya nikotin 12,13 olduğu bildirildi. Yayınlanan çalışma ile uyumlu olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs belirgin immunosupresyonun neden olduğunu bildirdi. Bu reseptör (TLR) -ligands gibi Toll- bastırılması ile kanıtlanmıştır, ex vivo modelde 14 PBMC&#39;ler tarafından öldürülmesi (K562) sitokin salınımını stimüle, ve hücre hedefli. Sigara dumanı kaynaklı hastalık süreçlerindeki enflamasyon önemi göz önüne alındığında, sigara dumanı, bağışıklık düzenleyici etkilerini değerlendirmek için test koşulları daha fazla optimizasyon Bu raporda sunulan edilir. Ex vivo tahliller tipik olarak hücre içi ölçülmüş ve sitokinler gibi tahliller 14 öldürme k562 hücresinin sitotoksik T ve NK hücrelerinin sitolitik fonksiyon salgılanan. deneyler, WS-CM ve nikotin ile PBMC&#39;nin sonraki stimülasyonu ile ön inkübasyon söz konusuTLR ile s, 3 günlük bir süre boyunca agonistleri; son okumalar enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) kullanılarak ve / ya da akış sitometrisi uygulanır. Bu TLR-4 reseptörlerine bağlanmakta ve PBMC&#39;ler, hücre içi sitokin ve sitokinlerin sekresyonu üretimi ile sonuçlanan uyaran bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) kullandı. Izole PBMC&#39;ler, hücre ölümü deneyleri ve IL-8 miktar tayini için TPPs, aynı zamanda, bu yöntem immünomodülatör etkisini değerlendirmek için çeşitli deney adımları optimizasyonuna ek olarak. Bu yöntemler, diğer araştırma soruları için uygulanan ve düzenleyici bağlamda, tütün ürünler için özel olarak rafine edilebilir. Tablo 1. in vitro raporları Yayınlandı ve ex vivo yöntemler tütün ürünü hazırlıkları varilus patofizyolojik etkilerini incelemek için kullanılan CS, sigara dumanı ortamı.; CSC, sigara duman yoğunluk; CSE, sigara dumanı özü; ELISA immünosorbent deneyi enzim-bağlı; GADPH, gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz; QPCR, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; RT, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; TS, tütün dumanı. <table><tbody><tr><td> Yazar (Ders yılı) </td><td> Schouwburgplein ve ark. (2004) </td><td> Moodie ve ark. (2004) </td><td> Oltmanns ve ark. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden ve ark. (2004) </td><td> Birrell ve ark. (2008) </td></tr><tr><td> Hücreler kullanılan </td><td> İnsan bronş endotel hücreleri (BEAS-2B), insan nötrofil </td><td> İnsan alveolar epitel hücreleri (A549) </td><td> İnsan solunum yolu düz kas hücreleri (HASMC) </td><td> İnsan premonocytic U937 hücreleri, insan monositleri </td><td> Alveoler tip II epitel hücreleri (ATII) </td><td> İnsan monositikhücre hattı (THP-1), insan akciğer makrofajlar </td></tr><tr><td> DYP kullanılan </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Yöntem kullanılan </td><td> ELISA, QPCR, göç, Elektrodevingenlik kayması </td><td> Immunhisto kimya, elektroforez, Arrayscan seti, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforez </td><td> Jel-mobilite kayma </td><td> Işık mikroskobu, elektron mikroskobu, elektroforez, ELISA </td><td> QPCR ELISA, E-toxate kiti (Sigma), p65, plaka deneyi (TransAM), elektroforez, çeşitli bağışıklık kitleri </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, göç </td><td> Histon asetiltransferazlar histon deasetilazlar, NF-KB, IL-8, ul kB-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaksin </td><td> Isı şok / stres proteinleri (HSP / Hsp70), HF transkripsiyon faktörü NF-KB,TNF-α </td><td> Yüzey Aktif protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α MAPK / JNK / ERK fosforilasyonu, cJun: DNA bağlama, glutatyon, p65: DNA bağlama </td></tr><tr><td> Sonuç </td><td> CSE AP-1 aktivasyonu bastırılması yoluyla sitokin üretimini aşağı-düzenler. </td><td> H 2 O 2 ve CSC farklı olarak, histon deasetilaz etkinliğini azaltmak, histon proteinlerin asetilasyonunu geliştirmek proinflamatuvar sitokin salınımını düzenler. </td><td> Sigara dumanı, sigara dumanı TNF-α,% 20 CSE daha az, IL-8 salıverilmeleri, eotaksin inhibisyonu ve RANTES tarafından geliştirilmiş HASMC IL-8 salıverilmesini neden olabilir. </td><td> TH Hsp70 ekspresyonu ve aktivitesi ve TNF-α serbest bağlanma NFkB&#39;nin inhibe edilmesi ile ilişkili HF transkripsiyon faktörü, aktif. </td><td> Azaltılmış ATII hücresinden türetilmiş kemokin düzeyleri ile uygun düşmek Alveolar onarım, sigara dumanı kaynaklı alveol hasarı ve amfizem katkıda bulunmaktadır. </td><td> Veriler neden sigara arttı solunum yolu enfeksiyonları için mekanistik açıklama. Doğal tepkinin bastırılması, IL-8 bir artış eşlik etmektedir. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

Diğer patofizyolojik değişiklikler arasında, sigara dumanı kronik bir maruziyetin, mikrobik enfeksiyonlar ve tümör insidansı içenlerin artan hassasiyet ile bağlantılı olan enflamasyon ve bağışıklık bastırılması neden olur. Ex vivo insan periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde reseptör aracılı bağışıklık tepkilerinin bastırılması (PBMC) duman bileşenleri ile tedavi mekanizmaları incelemek ve tütün ürünlerine maruz muhtemel uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için cazip bir yaklaşımdır. Burada, bakteriyel lipopolisakarit, bir Toll benzeri reseptör 4 ligand ile uyarılmış PBMC ile eks vivo tahliller yapmak için yöntemler iyi duruma getirilmiştir. Bütün duman koşullu ortam (WS-CM) etkileri, yanıcı bir tütün ürünü preparatı (TPP) ve nikotin ex vivo deneylerde PBMC&#39;ler tarafından sitokin salgılanması ve hedef hücre öldürme etkisi incelenmiştir. Bu göstermektedir ki, salgılanan sitokinler, IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 ve IL-8 ve hücre içi sitokin IFN-47 ;, TNF-α ve MIP-1α WS-CM-maruz kalan PBMC&#39;de bastırıldı. bir K562 hedef hücre öldürme deneyi ile belirlendiği gibi efektör PBMC sitolitik fonksiyon aynı zamanda, WS-CM maruz bırakılarak indirgenmiştir; Nikotin, bu deneylerde minimal bir etkiye sahip olmuştur. Özet olarak, eks vivo deneylerde TPPs etkilerini değerlendirmek için geliştirilmiş deneylerde, bir dizi mevcut ve bu yöntemler, hali hazırda ilgi konusu olan diğer ürünlerin test edilmesi için adapte edilebilir.

Sonuçlar ortalama (dört verici numuneleri), ortalama ± standart hatası olarak sunuldu. işlem görmüş ve görmemiş kontrol numuneleri arasındaki Student t-testi, karşılık gelen kontrol Tüm tedaviler için Excel yazılımı hem de t-testi karşılaştırmaları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık ile tespit edildi: * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005; *** P &lt;0.0005. WS-CM ve nikotin maruz kalma etkisini ölçmek için PBMC, 3 saat ya da 24 saat boyunca f...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations at JoVE.com

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K Görüntüleme.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

Video: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Sepsis kaynaklı bağışıklık bastırma, çekal ligasyon ve delinme ve Intranasal enfeksiyon çift model tasarımı

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...