We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

NOT: protokol üç parça larva sivrisinek, doğurganlık etkisini incelemek için yetişkin kadın için DZNep bir kan-tabanlı maruz kalma DZNep ilacın sulu pozlama tarif ve DZNep tarafından SAK hidrolaz önleme basit bir kolorimetrik tekniği kullanılarak ölçüldü. Bu tahlillerin bir şematik temsilidir, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Olgunlaşmamış Sivrisinek Geliştirme ve Sağkalım Tahliller NOT: Bu kısım, sivrisinek larvaları gelişimi ve hayatta kalma etkileyen bir suda çözünür ilaç kullanımını açıklar. <ol><li> Hatch A. 28 ° damıtılmış su içinde C (dH 2 O) ve arka onlara 2. evre larvaları ile gambiae yumurta. </li><li> Altı-çukurlu DNAz, RNAse içermeyen bir hücre kültürü plakası almak ve her bir oyuğa 10 mi DH 2 O dökün. </li><li> 2. instar de sivrisinek larvaları seçin ve iyi başına 15 larva ekleyin. Plaka 2. evre larvaları eklemeden önce, sfazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine bunları ut. </li><li> Renk kodlu bantlar ile Etiket kuyu deney rastgele. Her plaka (Şekil 2) test konsantrasyonu başına 2 kuyu etiketleyin. </li><li> DH 2 O, 1 ml, 0.3 mg DZNep eritilmesi ile, 1 mM DZNep hidroklorür (MW = 298,73) stok çözeltisi hazırlayın 0.5 uM ve 5.0 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için etiketli çukurlara DZNep.HCl stok solüsyonu eklenir. NOT: Stok solüsyonu 4 ° C&#39;de saklanabilir Kısa vadede (bir ay 1 gün) veya -20 ° C için Uzun vadede (uzun bir ay) için ° C. NOT: Yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda için stok solüsyonu ilave belirgin kuyulardan su hacmini değişmez. Bununla birlikte daha yüksek konsantrasyonları durumunda, bu bileşiğin herhangi bir gereksiz şekilde seyreltilmesinden kaçınmak için, larva ortam içinde çözülmesi için tavsiye edilir. </li><li> Her kuyuya pul balık yiyecek eşit miktarda ekleyin. Plaka Kapaks ve 28 inkübe Bir kuluçka ° C. </li><li> 24-saatlik maruziyet süresinden sonra DZNep-işlenmiş ve işlenmemiş larva sivrisinekler için mortalite kaydedin. Çıkarın ve herhangi bir ölü larva atın. Tüm larvalar kalıp kadar her gün bu kaydı tekrarlayın veya pupa ve yetişkin olarak ortaya çıkar. Bunlar pupa kadar larva büyüklüğü her iki günde bir, örneğin, gün 0, 2, 4, 6, 8 kaydedin. </li><li> Yeterli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak larva gelişimi ve mortalite verileri analiz. NOT: Çubuk grafik, Microsoft Excel&#39;de ölüm verileri temsil etmek için kullanılabilir. Çok Değişkenli Varyans Analizi (MANOVA) ilacın farklı dozlarının sivrisinek larvalarının önemli ölçüde farklı yaşam neden olmadığını ortaya çıkaracaktır gibi JMP ya da SPSS gibi bir yazılım ile seslendirdi. </li></ol> Kadın Sivrisinekler Yapay Besleyiciye sayesinde İlaç yönetme 2. Verimlilik Testi NOT: Bu bölümde kan a ilacın eklenmesini detaylarınd yapay besleyici sistemini kullanarak yetişkin dişi sivrisinekler için beslenme. <ol><li> Kontrol ve test kafes erkek ve dişi sivrisineklerin eşit sayıda yetişkin sivrisinek kafesleri ayarlayın. Kadın kadar kafesleri hem pamuk topları batırılmış% 10 şeker çözeltisi sağlayın (3-5 gün Anopheles gambiae için optimum olan) beslemek için hazırız. </li><li> 2 saat önce kan beslemeye, kadın aç sağlamak için pamuk topları kaldırmak. </li><li> Bir ters geniş alt cam huni (çap = 50 mm, uzunluğu = 70 mm) ve endüstriyel yapıştırıcı ile kapatılmış bir çevreleyen plastik oluşan iki yapay kan besleyiciler birleştirin. Girişi ve su çıkışı için bağlantı üzerinden iki besleyiciler &#39;çıkışları (çap = 10 mm) plastik borular (çap = 7 mm) takın. &quot;Kontrol&quot; ve iki besleyiciler Etiket &quot;5 mcM DZNep.&quot; </li><li> Beslenmesi için program kurmak, piyasada mevcut ısıtma elemanı kullanılması. &quot;Menü&quot; &quot;Ayarlar&quot; gidinve &quot;Ayar Noktaları&quot; seçeneğini seçin; Önceden yüklenmiş programlar görünecektir. &quot;SP1&quot; seçiniz ve 37 sıcaklığını ayarlamak ° C. NOT: ısıtma elemanı uygulanan kan, sabit bir sıcaklıkta muhafaza edilmesini sağlar. Ek program ayarları farklı sivrisinek ya da böcek türleri için de kullanılabilir. </li><li> Su ile bir kova doldurun ve suya ısıtma elemanı batırmayın. </li><li> Parafilm bir kare parça (50 mm x 50 mm) kesin ve ince bir zar film yapmak için streç. Parafilm ile yapay besleyiciler alt örtün. Parafilm (50 mm x 10 mm) başka bir parça kesin, onu germek ve besleyiciler kenarları mühür. </li><li> Tüpler tarafından besleyiciler ve ısıtma elemanı bağlayan, sistemi monte edin. Tamamlandığında, sistem üzerinde geçiş ve &quot;SP1&quot; seçeneğini seçin. Basın sistemini başlatmak için &quot;Enter&quot;. NOT: Su 37 ısıtılmış alacak C ° ve bu sıcaklıkta muhafaza edilmiştir. </li><li> Inci Monitörsu kova bir termometre kullanarak su e sıcaklığı. NOT: konnektörleri ve tüpler kan sıcaklığı 37 ° kalır, böylece sistem üzerinden sürekli bir su sirkülasyonu korumaya yardımcı ° C. </li><li> Herhangi bir kan dökülmemesi temizlemek için kullanılan olacak% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile bir düz dipli tepsiyi doldurun. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpüne defibrile koyun kan 2 ml ekleyin. &quot;Kontrol&quot; olarak etiketleyin. &quot;5 mcM DZNep&quot; &quot;5 mcM DZNep&quot; etiketli deneysel tüp DZNep stok solüsyonu (adım 1.5 bakınız) .Add 6 ul olarak etiketlenmiş deneysel tüp için işlemi tekrarlayın yavaşça bunu birkaç kez ters yüz edilerek kan ve ilaç karıştırın. Oda sıcaklığında tüpü 10 dakika kuluçkalayın. </li><li> Bir pipet kullanarak, uygun şekilde etiketlenmiş besleyiciler üstüne kontrol ve test kan 2 ilave edin. Çamaşır suyu çözeltisi içinde pipet atın. Karanlık bir çanta ile kafesi örtün ve f teşvik etmek periyodik kafesine havayı solumakbeslenmesi için emales. </li><li> Sivrisinek yaklaşık 30 dakika boyunca besleme olsun. Besleme tamamlandıktan sonra, besleyiciler almak, ısıtma elemanı kapatın ve Parafilm şerit. Yaklaşık 5 dakika için ağartıcı çözeltisi içinde besleyici daldırın ve iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın. </li><li> Besleyiciler çıkarın ve 48 saat için kafesleri şeker su ile pamuk topları koymak. Yumurtlama kolaylaştırmak için bir gecede kafeslerde su ve filtre kağıdı içeren bir yumurta yemek yerleştirin. Ilgili test veya kontrol konsantrasyonu her yumurta yemek etiketleyin. </li><li> Stereo mikroskop altında yumurta sayısını ve yapısını ertesi gün yumurta yemek çıkarın ve inceleyin. Q-colors5 yazılımını kullanarak görüntüleri edinin. Yumurta sayısını. Test ve kontrol kafesleri elde edilen yumurtaların sayısı farkı analiz edin. NOT: t-test yumurta sayısı (p ≤0.05) önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. </li></ol> Sivrisinek Enzim Önlemesinin 3. Biyokimyasal Deneyiİlaç tarafından NOT: Bu kısım, yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak DTNB kullanılarak, bir enzim aktivite deneyi tarif eder. <ol><li> DH 2 O 1 L HPO 4 Na 2 14.19 gr eklenerek bir 0.1 M Na-2 HPO 4 (dibazik sodyum fosfat) çözeltisi hazırlayın Daha sonra, DH 2 O, 1 L PO 4 NaH 2 13.79 gr eklenerek 0.1 M NaH 2 PO 4 (monobazik sodyum fosfat) bir çözelti hazırlamak </li><li> PH 8.5, 0.1 M NaH 2 PO 4 çözeltisi, 0.1 M Na-2 HPO 4 çözelti titre edilir. Not: Bu, 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) çalışma stok çözeltisi olacaktır. </li><li> % 0.3 Triton X-100 ilave edilerek 0,1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) içindeki bir homojen hale getirme çözeltisi hazırlayın. NOT: homojenizasyon çözelti 4 O ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Prepare 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5), 10 ml SAK 6.15 mg çözülmesiyle 1.6 mM SAK (MW = 384,4) çözeltisi eklendi. </li><li> 0,1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5), 10 ml DTNB 6.3 mg çözülmesiyle 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) çözeltisi hazırlayın. Kullanılana kadar buz üzerinde taze DTNB çözümü tutun. </li><li> 1 ml dH 2 O. DZNep 0.3 mg çözülmesiyle 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) çözeltisi hazırlayın Daha sonra, dH 2 O. 0.002 uM 1.000 uM konsantrasyonlarda bir seri içinde 1 mM DZNep çözeltisi seyreltik </li><li> DZNep tarafından SAH hidrolaz inhibisyonunu ölçmek için, sivrisinekler ham enzim özü hazırlanması: buz gibi soğuk 0.1 M NaH 2 PO 4 (pH 8.5) ihtiva eden% 0.3 Triton X-1 ml 10-olmayan kan beslenen yetişkin sivrisinekler homojenize 100, bir cam doku homojenleştirici kullanılarak. Bir 1.5ml mikrosantrifüj tüp Homojenat aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca Homojenat santrifüj. Temiz süpernatant aktarın1.5 ml mikrosantrifüj tüp. SAK biyokimyasal analiz için enzim kaynağı olarak supernatant kullanın. </li><li> Boş tedavisi için (yani, DZNep, enzim yok), 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB ve 100 ilave ul 0.1 M Na-2 HPO 96 oyuklu her bir gözeneğine 4 (pH 8.5), düz dipli mikroplaka. </li><li> Kontrol (yani, DZNep) için, 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB ilave, 50 ul 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) ve 50 ul enzim bireye (SAH hidrolaz ham özüt elde edilmiş) kuyular. </li><li> DZNep muameleler için, 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB, tek tek oyuklara 50 ul enzim ve 50 ul seçilen DZNep konsantrasyonu ekleyin. Tedavi ve kontrol başına 4 çoğaltır hazırlayın. </li><li> 96-çukurlu bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 20 saniye aralıklarla, 5 dakika boyunca 405 nm de SAK enzim örneklerin optik yoğunluk (OD) okuyun. </li><li> Kontrol a gelen boş OD çıkarmand tedavi OD de her elde. Aşağıdaki denklemi kullanarak SAK hidrolaz aktivitesini kalan yüzde hesaplayın:% Artık Aktivite = (Tedavi OD / Kontrol OD) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa.">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li><li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases.">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li><li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae.">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147 (2009).</li><li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex.">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li><li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Cancer+Therapeutics.">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless/dSetDB1.">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li><li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster:+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription.">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li><li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation.">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMA-1,+a+Mutant+p53+Reactivator,+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+(DZNep).">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Deazaneplanocin+A+(DZNep),+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase,+promotes+erythroid+differentiation.">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer.">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells.">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li><li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer.">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40 (2011).</li><li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD.">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells.">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes &amp; Development. 21, 1050-1063 (2007).</li><li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokolün başarılı bir uygulama için hayati birkaç adım vardır. Larva deneyi için, bakım doğru etiket ve her test konsantrasyonu çoğaltmak için alınmalıdır. Test örnekleri rastgele ve ilgili test kuyuları ilacın belirlenen miktarda ilave kurmak bu deneysel önemli bir parçasıdır. 96 oyuklu bir mikro-2 nci instar sivrisinek larvaları eklemeden önce, her bir larva fazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine konabilir. Kuruma önlemek için, larva hemen forseps...

Sıtma dünyada böcek bağlı ölümlerin en fazla sayıda sorumludur. Tahminen 219,000,000 olgu, öncelikle, Afrika 1 yaklaşık 660,000 ölüm ile sonuçlanan, dünya çapında yılda görülür. Uyumlu çabalara rağmen, sıtma programları çeşitli sorunlarla karşı karşıya. Insektisit tedavi cibinlik ve programın kapalı kalan püskürtme formu anahtar bileşenleri, yerel topluluklarında insektisit direnci bu çabaları 2 engel iken. insektisit dirençli sivrisinek popülasyonları hızlı artış büyük ölçüde kendi ortamında değişikliklere çabuk adapte ve farklı nişler 3,4,5 sömürmek için sıtma sivrisinek yeteneği atfedilir. Direnç mevcut mekanizmaların üstesinden gelmek için, yeni insektisit hedefleri ve gelecek nesil bileşiklerinin keşif garantilidir. Sıtma m değişik yaşam evrelerinde deneysel insektisitlerin etkinliğini belirlemek için basit bir adım adım protokolüosquitoes ölçüde bu çabalarını artırmak olacaktır. Hücre hatları ve hayvan modellerinde uyuşturucu etkileri Farmakolojik çalışmalar hücrelerin ve organizmaların genetik ve fizyoloji modüle için yararlı bir araç olarak epigenetik ilaçların kullanımını kurduk. DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu altta yatan bir DNA dizisini 6 değiştirmeden çok hücreli organizmalarda gen ifadesini etkileyen iki epigenetik mekanizmalar vardır. Böyle metilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, hücresel bütünlüğü ve gen ifadesini sürdürülmesinde önemli bir rol oynar ve birçok temel süreçleri 7,8,9 etkileyebilir. Bazı böcek türlerine Araştırma hücrelerinin oluşumu ile ilgili işlemlerde epigenetik önemi vurgulanmıştır ve hücre bakım 10, hem de dozaj telafisi 11 kök var. Ancak, hastalık vektörlerinde bu yaklaşım henüz keşfedilecek edilir. Sivrisinekler bu sistemi modüle bir bileşik Kullanımı bize verebiliryeni insektisit hedef yollar içine manzaraları. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), değişik kanser türlerinin üzerindeki etkisi 12,13,14,15,16 incelenmiştir bilinen bir histon metilasyon inhibitörüdür. DZNep dolaylı olarak histon lizin, N -methyltransferase önleyen bir kararlı, suda çözünebilen epigenetik ilaç (EZH2), memeli hücrelerinde Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) &#39;in bir bileşeni. PRC2 çok hücreli organizmalarda kök hücre büyümesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, ve histon metilasyon PRC2 aracılı gen susturma önemli bir yönüdür. Bağışıklık yetersizliği olan fareler içinde DZNep ile ön-muamele edilmiş hücreler, 17 daha az tümörijenik olduğu gösterilmiştir. Bu ilaç gibi EZH2 18 karıştığı olduğu alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi diğer hastalıklar, eğitim için kullanılan hale gelmektedir. DZNep kurulmuş bir S -adenosylhomocysteine ​​(SAK) hidrolaz inhibitörü 19, 20. in SAH hidrolaz sonuçlarının önlenmesiSAK birikimi ve buna bağlı olarak, temin edilebilen metil donör gruplar sınırlayarak metiltransferaz aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. SAK metabolik yollardaki böcekler dahil olmak üzere, pek çok organizmalar tarafından kullanılan bir amino asit türevidir. Yeni yapılan bir çalışmada diapause etkileyebilir ve böcekler 21 gelişimini geciktirebilir düşük dozlarda o DZNep göstermiştir. Burada, sivrisinek çeşitli yaşam sahnelerinde suda çözünür bileşik etkilerini araştırmak için sağlam bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokolün üç parça olgunlaşmamış sivrisinekler, yetişkin kan-besleme kadın ve yetişkin erkek ve dişi sivrisineklerin enzim aktivitesi üzerine bir suda çözünür bileşik etkilerini incelemek için talimatları içerir. İlk olarak, DZNep olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma çalışma için su içinde çözülmüştür. Bu ilaç maruziyeti 10 katlık bir artış ortaya çıkan herhangi bir karşılaştırma yapmak amacıyla iki konsantrasyonda yapılır. Yetişkin dişi sivrisinekler, DZNep ilacın etkisini araştırmak içindefibrile koyun kanı ilave ve dişilere yapay kan beslenir. Daha sonra, doğurganlık üzerindeki ilacın sonucu incelenmiştir. Son olarak, bir enzim etkinliği tahlili Yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak 5,5&#39;-ditiyobis- (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile gerçekleştirilir. Bu protokol, bir sıtma sivrisinek Anopheles gambiae ile geliştirilmiştir iken, kolayca sivrisinek ya da diğer böcek herhangi bir türün ilgi bileşiklerinin etkilerinin araştırılması için adapte edilebilir. Bu protokol detaylı teknikler etkili bir şekilde su ya da sulu ortam içinde, sınırlı ya da çözünürlüğe sahip bir ilaç için tatbik edilemez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

İnsektisit direnç sıtma kontrol programları için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sivrisinekler sıtma tropikal ülkelerde bir yerde hazır ve nazır sorunu kontrol yapma, hızlı ortamındaki değişikliklere geniş bir uyum. insektisit dirençli popülasyonların ortaya çıkması vektör sivrisinek kontrolü için yeni ilaç hedef yolları ve bileşiklerin keşif garanti. Epigenetik ilaçlar iyi ancak çok böcekler üzerindeki etkileri hakkında bilinen değil, kanser araştırma kurulmuştur. Bu çalışma sıtma vektörü, Anopheles gambiae üzerine, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), kanser tedavisi için bir deneysel epigenetik ilacın toksikolojik etkilerini inceleyen için basit bir protokol sağlar. Bileşik tedavi kontrole göre yetişkin sivrisinekler doğurganlığını düşük ise mortalite ve boyut olarak azalma konsantrasyona bağlı bir artış DZNep maruz olgunlaşmamış sivrisinek gözlenmiştir. Buna ek olarak, S, bir ilaca bağlı bir azalma vardı -tedavileri kontrol etmek DZNep göreceli maruz kaldıktan sonra sivrisinek adenozilhomosisteine ​​(SAK) hidrolaz aktivitesi. Bu protokoller da, suda çözünür epigenetik ilaçların veya bileşiklerin toksikolojik etkileri keşfetmek için eşsiz bir çoklu-uçlu yaklaşımı göstermek, deneysel ilaç için birden fazla toksikolojik uç noktalar değerlendirmek için basit, adım-adım prosedürü ile araştırmacı sağlamak ve Vektör Sivrisinek ve diğer böceklere karşı ilgi.

Şekil 1, deneylerin bir şematik temsilidir; Bu makalede listelenen prosedürün çeşitli adımları açıklar. Protokol sivrisinek farklı yaşam evrelerinde dayalı olarak, burada ayrıntılı deneyler için takip edilecek belirli bir düzen vardır. Kullanıcı örnek durumuna bağlı olarak, aynı anda bir veya daha fazla deneyleri yapmak için seçebilirsiniz. Şekil 2 olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma deneyleri için ayarl...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Sıtma Sivrisinekler Gelişimi, doğurganlık ve Kalma bir Epigenetik İlaç Test Etkileri Toksikolojik Tahliller

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Görüntüleme.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Biyoloji

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Genetiği Değiştirilmiş Sivrisinekler kullanarak Sıtma ve Dang Ateşi Yayılması Önleme

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Bina daha iyi Sivrisinek: Sıtma ve Dang Ateşi Direnç A. gambiae ve A. aegypti Sivrisinekler etkinleştirilmesi Genler belirlenmesi

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...