This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

<ol>
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Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li><li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1,+NS2,+SH,+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo.">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li><li>Karron, R. 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W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. 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W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ce document fournit un protocole expérimental pour la préparation et l&#39;analyse d&#39;oligomérisation d&#39;une petite protéine membranaire dans un détergent en utilisant l&#39;équilibre sédimentation échantillon. Le protocole décrit est également valable pour simpler- -et protéines solubles, comme l&#39;étape d&#39;adaptation de la densité ne est pas nécessaire. En effet, le système est constitué par un mélange de détergent et de protéines. Pour réaliser des études de sédimentation, le déterge...

Ultracentrifugation analytique 1-5 est une des méthodes les plus importantes pour étudier les interactions des macromolécules dans des conditions physiologiques, étant accessibles à la fois aux interactions faibles et forts. Le procédé est sans marqueur et utilise l&#39;absorption de lumière ou d&#39;interférences, et même des systèmes optiques de fluorescence peut être utilisée pour accéder à des plages de concentration de plusieurs ordres de magnitude 6. Cette méthode est particulièrement utile étant donné que la plupart des processus biochimiques dépendent des interactions réversibles. La stoechiométrie et la force de ces interactions doivent être caractérisée quantitativement à comprendre des processus biologiques, et un certain nombre de méthodes existent à cette fin 7, 8. Cependant, les interactions transitoires sont difficiles à étudier neuf. Le choix d&#39;une méthode pour caractériser les interactions macromoléculaires dépend de sa nature statique ou dynamique. Dans le premier cas, Sedim<html> vitesse de entation (SV) est utilisé, où le taux de transport radial est mesuré et complexes sont fractionné sur la base des différences de masse flottante et la forme. En revanche, les associations dynamiques qui sont réversibles sur l&#39;échelle de temps de l&#39;expérience ne peuvent pas être physiquement séparés. Dans ce cas, l&#39;auto-hétéro ou interactions conduisant à des interactions non covalentes sont dans un équilibre qui dépend de la concentration totale en protéines. Ces interactions dynamiques peuvent être étudiés à la fois l&#39;équilibre de sédimentation (SE) et de la vitesse de sédimentation (SV) 10. Toutefois, le premier procédé est plus simple à réaliser et est décrite ici. Dans SE, la centrifugation est réalisée à une vitesse suffisamment basse de sorte qu&#39;un équilibre est atteint entre la diffusion et la sédimentation. À ce stade, le profil d&#39;équilibre d&#39;un signal optique (UV-VIS) en fonction de la distance radiale, peut être analysé en utilisant des modèles thermodynamiques prédéfinis pour les associations 11. ve_content &quot;&gt; Dans le présent document, une étude de sédimentation à l&#39;équilibre est présenté de l&#39;auto-association d&#39;une protéine de membrane virale qui forme canaux ioniques. En raison de son caractère hydrophobe, l&#39;expérience est conduite en présence d&#39;un détergent, et dans ce cas, la densité de solvant doit être adaptée à celle du détergent. Cependant, le protocole décrit serait identique dans le cas d&#39;une protéine soluble dans l&#39;eau, à l&#39;exception qu&#39;aucun solvant de recherche de densité serait nécessaire. La protéine utilisée est codé dans le virus respiratoire syncytial humain (hRSV), un pneumovirus enveloppé dans la famille de paramyxoviridae qui cause la maladie des voies respiratoires inférieures chez les nourrissons, les personnes âgées et les populations immunodéprimées dans le monde entier 12. Jusqu&#39;à 64 millions de cas déclarés d&#39;infection hRSV et 160 000 décès surviennent chaque année. Le génome de hRSV transcrit 11 protéines, y compris les trois protéines membranaires F, G, et petite hydrophobe (SH). protéine SH est impliquédans la pathogenèse de l&#39;infection par le VRS. RSV dépourvu du gène SH (de RSVΔSH) était viable, a provoqué la formation de syncytia et a grandi ainsi que le type sauvage (WT) virus 13-16. Cependant, le virus RSVΔSH reproduit 10 fois moins efficace que le WT dans le tractus respiratoire supérieur 15, 16. En outre, le virus a été atténuée dans RSVΔSH chez la souris in vivo et des modèles de chimpanzés 13, 17. La protéine SH est un groupe (sous-groupe de RSV A) 64 ou 65 (VRS sous-groupe B) acides aminés II protéine de membrane intégrale qui se accumule principalement dans les membranes de Golgi le compartiment 18 de type long. protéine SH a une seule prédit une hélice transmembranaire (TM) domaine 19 qui est hautement conservée 20,21. Les domaines de extramembrane C- et N-terminales sont orientées lumenally / extracellulaire et cytoplasmique, respectivement. Les deux domaines TM synthétique (résidus 18-43) Et pleine longueur de protéine SH ont été représentés pour former homopentamers dans une variété de détergents. La forme homopentameric est responsable de l&#39;activité du canal dans des bicouches lipidiques planes 22,23. L&#39;orientation correcte des monomères de TM dans la bicouche lipidique a été déterminée en utilisant le site dichroïsme infrarouge spécifique 23, qui a montré Sa-22 pour être dans un luminal, près de inter-hélicoïdale, l&#39;orientation. Le même domaine TM orientation a été confirmée par des études de RMN qui reconstruit le pentamère un faisceau en hélice de la protéine de pleine longueur dans dodécylphosphocholine (DPC) 22 micelles. Dans ce modèle de «micelles», un seul domaine de TM hélicoïdale a- était flanqué N-terminale par une hélice, et C-terminale par un b-épingle prolongée. Les deux résidus protonables de protéine SH, His-22 et His-51, se trouvent dans le domaine TM (orienté lumenally), et à l&#39;extrémité de la extramembrane β épingle C-terminal (loin du pore du canal), respectivement. Dans un enviro bicellarnement, cependant, la TM α-hélice se étend jusqu&#39;à His-51, et les deux résidus His, sont disponibles à la lumière du canal 24. Structure de canal adopte une architecture en forme d&#39;entonnoir 22, où la région étroite (Ser-29 à Cys-45) 22 est revêtu avec des chaînes latérales hydrophobes (Ile-32, Ile-36 Ile-40 et Leu-44), et Ile-36 définit le point le plus étroit dans la lumière du canal. His-22 est située à la plus grande ouverture de cet entonnoir, alors que His-51 est à l&#39;extrémité de la plus petite ouverture. Dans le présent document, la centrifugation analytique dans un mode de sédimentation à l&#39;équilibre a été utilisée pour déterminer si sa protonation affecte la stabilité de la protéine pentamère SH. Dans ce cas, la protéine SH a été solubilisé dans un détergent C14-bétaïne, qui a été utilisé précédemment pour montrer que les formes de la protéine SH oligomères 22 pentamères.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1345">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:448px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Deuterium oxide 99.8%</td>
			<td style="width:147px;">Cambridge Isotope</td>
			<td style="width:119px;">DLM-4-99.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell housing</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">334784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window holder</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window gasket</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">327021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window liner</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Sapphire window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">307177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Quartz window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw-ring washer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw ring</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Spinkote</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">306812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Torque stand assembly</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Counterbalance</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">360219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell alignment tool</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDNTERP</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HeteroAnalysis&#160;</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDFIT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedfit.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDPHAT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedphat/default.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Ultracentrifugation analytique (AUC) peut être utilisé pour étudier les interactions entre macromolécules réversible sur une large gamme de forces d&#39;interaction et dans des conditions physiologiques. Cela rend AUC une méthode de choix pour évaluer quantitativement stoechiométrie et thermodynamique des homo- et hétéro-association qui sont transitoires et réversibles dans les processus biochimiques. Dans la modalité de l&#39;équilibre de sédimentation (SE), un équilibre entre la diffusion et la sédimentation présente un profil en fonction de la distance radiale qui dépend d&#39;un modèle d&#39;association spécifique. Ici, un protocole détaillé est décrit SE afin de déterminer la taille et de monomère-monomère association énergie d&#39;une petite oligomère de protéine de membrane en utilisant une ultracentrifugeuse analytique. AUC-ES-étiquette est libre, basé uniquement sur des principes physiques, et peut être utilisé sur les deux protéines solubles et membranaires eau. Un exemple est illustré de celle-ci, la petite hydrophobe (SH) à la protéine de virus syncytial respiratoire humain (hRSV), Un polypeptide de 65 acides aminés avec un seul transmembranaire (TM) de domaine α-hélicoïdale qui forme des canaux ioniques pentamères. Sur la base des données de structure RMN montre que la protéine SH a deux résidus His protonable dans son domaine transmembranaire qui sont orientés face de la lumière du canal. SE expériences ont été conçues pour déterminer comment le pH affecte constante d&#39;association et de la taille oligomères de la protéine SH. Bien que la forme pentamérique a été préservée dans tous les cas, sa constante d&#39;association a été réduite à un pH faible. Ces données sont en accord avec un pH dépendance similaire observée pour l&#39;activité des canaux SH, conformément à une orientation luminale des deux résidus His dans la protéine SH. Ce dernier peut éprouver une répulsion électrostatique et la stabilité d&#39;oligomères réduite à faible pH. En résumé, cette méthode est applicable à chaque fois que des informations quantitatives sur les changements subtils association protéine-protéine dans des conditions physiologiques doivent être mesurés.

Le profil radial de distribution de C14SB micelles de détergent dans du Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7,3, forme un exponentielles très peu profonde qui pourrait être montée sur un modèle linéaire (figure 7A). La pente de cette distribution est inversement corrélée à la concentration de D 2 O (Figure 7B). Le point où la pente est nulle, ce est à dire l&#39;appariement D 2 O concentration, se est révélée être de 32,3%. <p class="jove_content...

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Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

L&#39;équilibre de sédimentation d&#39;une Membrane Protein Petit Oligomer formation: Effet de l&#39;histidine Protonation sur pentamériques stabilité

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

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10.5K vues.  Nanyang Technological University. Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).