Bu protokol, aminopeptidazların farklı oligomerik durumları ve inaktif dimers ve aktif dodecamers arasında dengeli oligomerizasyona bağımlı aktivitelerile incelenmesini kolaylaştırır. Bu geleneksel teknik herhangi bir laboratuvarda kolayca yapılabilir. Ve bir ışın hattı veya x-ışını kristalografi sağlama tesisi gerektiren bir yana, özel cihazlar gerektirmez.
Bazı adaptasyon ile, bu yöntem oliomerizasyon derecesine bağlı bir aktivite veya fonksiyon ile başka bir protein uygulanabilir. X-ışını verilerini işlemek için, kullanıcıların kristalografi konusunda en az bilgiye sahip olması gerekir. Kullanıcıları eğitimleri takip etmeye, XDS Wiki'yi ziyaret etmeye ve Phenix eğitimlerini izlemeye davet ediyoruz.
Bir aktivite tahlil yapmak için, 50 milimolar MOPS 965 mikrolitre 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide 25 mikrolitre ekleyin, 250 mikromolar kobalt iki klorür ve 10%metanol Pre ek MOPS ile bir mikromolar konsantrasyonu son enzim seyreltmeden önce, 75 santigrat derece kuru banyo reaksiyon karışımı inkümed. Daha sonra, reaksiyon karışımına bir mikromolar enzimin 10 mikrolitresini ekleyin ve reaksiyonu bir saatten fazla süreyle 75 santigrat derecekuru banyoya geri döndürmeden önce ortaya çıkan çözeltiyi girdap layın. Çözelti sarıya döndüğünde, reaksiyonu %20 asidik asit mililitreile durdurun ve oda sıcaklığına soğumasına izin vermeden önce karışımı girdaplayın.
Daha sonra reaksiyon karışımının bir aliquot'unu spektrofotometre hücresine aktarın ve emicileri 410 nanometredeki emicileri enzimsiz bir reaksiyon karışımına karşı negatif kontrol olarak okuyun. Apoenzim hazırlama için, 50 milimolar MOPS 890 mikrolitre, 0.5 molar amonyum sülfat ve saftize TmPep1050 100 mikrolitre 10-fenanthroline stok çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin. Kobalt iki klorür ilavesi olmadan gösterildiği gibi aktivite tsay kullanarak aktivite kaybı kontrol edin.
Testten sonra, numuneyi bir diyaliz tüpüne aktarın ve numuneyi 200 mililitre 50 milimolar MOPS ve 4 santigrat derecede 0,5 molar amonyum sülfata karşı diyalize alın. 48 saatlik diyaliz sırasında diyalizi üç kez taze tamponla değiştirin ve diyaliz tüpünden numune alın. 30 kilodalton kesme ile ultra filtrasyon üniteleri kullanarak, geri 100 mikrolitre için örnek konsantre ve 280 nanometre bir nano hacim spektrofotometre konsantrasyonu kontrol edin.
Dimers 50 milimolar MOPS ve 0.5 molar amonyum sülfat bir mikromolar konsantrasyona apoenzim seyreltmek hazırlamak için, ve 75 derece kuru banyoda iki saat boyunca reaksiyon kuluçka. Daha sonra enzim örneğini en az 50 mikrolitre konsantrasyona yoğunlaştırın ve boyut dışlama kromatografisine göre molekül ağırlığını kontrol edin. Protein kristallerinin şeklini, boyutunu ve kristalliğini artırmak için, kristal damlacık hacmini 10 mikrolitreye çıkarmak için bir damla kristale uygun kristalizasyon çözeltisi ekleyin.
Damlacığı 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın ve tohumlu kuyuya 90 mikrolitre daha kristalizasyon çözeltisi ekleyin. Her tohum seyreltmesi için, bir kristalizasyon plaka kuyularının uygun sayıda iyi başına kristalizasyon reaktif 500 mikrolitre ekleyin ve kristalizasyon reaktif iki mikrolitre ve iyi başına bir kristalizasyon desteği tohum 0.2 mikrolitre ile protein örnek iki mikrolitre karıştırın. Sonra kristalizasyon reaktif her kuyuya destekler düzeltmek.
Kristal toplama için, sıvı nitrojen ile bir banyo doldurun ve azot içine örnek işleme için kullanılan herhangi bir şişe veya sepet dalma. Sıvı nitrojen kullanımı tehlikelidir ve şiddetli donmalara neden olabilir. Kriyojenik eldivenler ve koruyucu göz gözlükleri gibi uygun bireysel korumaları taktığından emin olun.
Kristal boyutuna göre farklı boyutlarda örnek toplama döngüleri ayarlayın ve kristaliçeren bir damla seçmek için bir dürbün kullanın. Sonra yavaşça bir kuyudan izole kristal seçmek ve hemen uygun bir şişe içinde döngü yerleştirmeden önce sıvı azot döngü dalma için bir döngü kullanın. Kırınım nokta yoğunluklarını ölçmek için, XDS'nin çalıştırılacak bir klasör oluşturun ve görüntülere giden yolu bulun.
xdsme çalıştırmak için, bir terminal penceresinde komutu girin. XDS iş sona erdikten sonra doğru lp dosyasını kontrol edin ve boşluk grubu belirleme olasılığını, veri bütünlüğü, en yüksek çözünürlük, kristal mozaiklik ve veri kalitesi ne not. Uzay gruplarının olasılığını elde etmek için XDS anlamsız günlük kontrol ettikten sonra, önceki işlemi geçersiz kılmak için ayrı bir klasörde, XDS tarafından önerilen farklı uzay grubu çözümleri ile xdsme yeniden çalıştırmak için komutları kullanın.
Veri istatistiklerine göre en iyi çözümü seçtikten sonra, XSCALE ve XDSCONV'yi çalıştırmak için komutları girin. Anormal bir saçılma öğesi olmayan fazı belirlemek için, moleküler değiştirme için başlangıç modelini hazırlamak için 4P X, Y koordinatlarını kullanın. PDB dosyasından, A monomerini ayıklamak ve amino asitlerini alanin içinde doklamak için Phenix PDB dosya düzenleyicisini kullanın.
X'i XDSCONV tarafından oluşturulan yansıma dosyası ve giriş olarak sırayla üçe katlandı. Xtriage'daki günlük dosyasını kontrol et. Asimetrik birimdeki alt birimlerin sayısı, anizotropi, buz halkalarının varlığı ve eşleştirme oluşumuna dikkat edin.
Moleküler değiştirme için Phenix'te Phaser-MR çalıştırmak için yansıma dosyasını, sırayı ve ilk 4P altı Y modelini seçin ve Polialanin'de kesilmiş başlangıç 4P Y modelini seçin ve Çalıştır'ı tıklatın. tamamlandıktan sonra, bir model bulunup bulunmadığını kontrol edin ve moleküler değiştirmenin skorunu kontrol edin. En az sekiz bir çeviri faktörü Z puanı, çözümün kesin olarak doğru olduğunu gösterir.
Moleküler değiştirme ile aşamayı belirledikten sonra Otomatik Oluştur'u çalıştır'ı seçin ve Çalıştır'ı tıklatın. Gerekli dosyaların tümü otomatik olarak eklenir. Tamamlandıktan sonra, COOT modeli kontrol edin ve oluşturmak ve el ile modeli rafine, COOT elektron yoğunluğu haritasına göre.
Bu modeli, diziyi ve kırınım verilerini giriş olarak kullanarak Phenix'te el ile seçilmiş modeli hassaslaştırArak doğru stratejiyi seçmenize yardımcı olun. Arıtma sonuçları kontrol ettikten sonra, arıtma ücretsiz ve arıtma çalışmaları azaltmak gerekir. MolProbity göstergeleri saygı ve düşük reel alan korelasyon ile aykırı, sınırlı olmalıdır.
En iyi rafine model oluşturulduğunda, sunucuda MolProbity çalıştırın ve program tarafından tanımlanan aykırı lıkları kontrol edin. Boyut dışlama kromatografisi saflaştırılmış proteinin görünür molekül ağırlığını belirlemek için kullanılabilir. Peptitin kristalizasyon durumu, dimer durumu etrafında PEG konsantrasyonu karşı pH değiştirerek optimize edilebilir.
Örneğin, en iyi TmPep1050 H60A H307A kristalleri, mikro kristaliniteliği artırmak için mikro tohumlama bir döngü sonra, 5.2 ve% 20 PEG 3350 konsantrasyonu bir pH ile 0.1 molar sodyum sitrat elde edildi. Bu analizde, veri indeksleme TmPep1050 H60A H307A kristal uzay grubu C2221 olduğunu gösterdi, ancak XDS başka bir çözüm önerdi, MP uzay grubu. TmPep1050 H60A H307A yapısı, otomatik ve manuel arıtma birkaç döngüleri sonra tamamlanabilir.
1, 710 kare angstromlar bir arayüz yüzeyi ile oligomerik durumu doğrulayan hem monomerler ve mol başına eksi 16.2 kilokalori arayüz oluşumu serbest bir enerji. Burada, TmPep1050 H60A H307A aktif sitenin bir yakın çekim TmPep1050 dimer ve dodecamer aktif siteye göre görülebilir. Bir model oluştururken yorumlama üzerinde önlemek için elektron yoğunluğu nda gördüğünüz sadece ne oluşturmak için dikkat edin, veri, ve modeli parlatmak için zaman ayırın.
Dimer ve dodecamer'ın moleküler ağırlığı yerli kütle spektrometresi ile de belirlenebilir. Ve yöntemler geçiş oligomerleri tespit etmek için yararlı olabilir.
