Name: epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay at JoVE.com

The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

NOT: tanımların listesi için ek malzemeler bölüm S1 bakın. USEPA Yöntem 1615 ile ilişkili QA prosedürleri ek malzemeler bölümünde S2 açıklanmıştır. 1. Filtre Elüsyon Prosedürü <ol><li> Birinci akıtmada <ol><li> tamponlu% 1.5 sığır özü, pH 9.0, 500 ml yerleştirin dereceli bir silindire, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı. Filtre kartuşu konut açın ve tamamen elektropozitif filtreyi kapsayacak şekilde sığır özü yeterli miktarda ekleyin. Filtre gövdesi kapağını değiştirin ve steril bir behere kalan sığır özü dökün. </li><li> temas süresi 1 dakika sonra, bir basınç kabı veya peristaltik pompa kullanılarak yavaş yavaş filtre ile steril bir beherde kalan birlikte gövde sığır özü solüsyonu geçirir. 2 L&#39;lik bir cam kabın içine eluat toplayın. </li></ol></li><li> İkinci elüsyon <ol><li> Tekrarlayın tamponlu% 1.5 sığır özü ilave 500 ml kullanılarak 1.1 AdımlarıAncak 15 dakika Adım 1.1.2 de temas süresini artırır. </li><li> Birinci akıtmada o ihtiva eden 2 L&#39;lik bir kap, ikinci elüsyon sığır eti ekstresi ekleyin. behere steril bir karıştırma çubuğu ilave edin. </li></ol></li></ol> 2. Organik Flokülasyonu Konsantrasyon Prosedürü <ol><li> en az 5 dakika boyunca 0,525% sodyum hipoklorit ile kombinasyonu tipi pH elektrodu sterilize edin. Steril dH 2 O ile elektrot durulayın ve sonra 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 4 ve 7 standartlarını kullanarak pH metre kalibre. </li><li> bir heyecan plaka üzerinde eluatın içeren behere koyun. plaka açın ve bir girdap oluşana kadar karıştırma hızını artırmak. </li><li> yavaş yavaş eluata 1.2 M HCl damla damla ilave edilerek 3.5 ± 0.1 eluat pH ayarlayın. Hızlı ekleme virüsü inaktive çünkü HCI damla damla ekleyin. Bir çökelti oluşmaya başlar Bu süre boyunca elüat parçalı hale gelir. </li><li> Karıştırma spe azaltmakDaha sonra yavaş karışmasına Ed ve 30 dakika için oda sıcaklığında 3.5 ± 0.1 de eluat pH&#39;sini izlenmesi ve bakımı ve devam eder. </li><li> 4 ° C&#39;de 2,500 x g&#39;de 15 dakika boyunca çökelen sığır özü bir veya daha fazla santrifüj şişelerine süspansiyon ve santrifüj dökün. santrifüj ve her iki aspirat şişeleri kaldırmak veya yavaş topak haline çökelti kaybını önlemek için süpernatant süzün. süpernatant atın. NOT: çökelti miktarı ve kalitesi sığır özü sürü arasında önemli farklılıklar olabilir. Diğer birçok o güçlükle erirken bazı sürü üretilen çökelti hızla eriyecektir. </li><li> çökeltiyi ihtiva eden bir santrfuj şişesine 0.15 M sodyum fosfat, 30 ml ekleyin. <ol><li> 0.15 M sodyum fosfat, 5 dakika içinde çözülür sığır özü partiden çökeltiler için pH 9.0 kullanın. Çökelti tamamen eritilir sonra 10 dakika süre ile karıştırılır ve daha sonra 2.7 aşamasından hemen gidin. </li><li> Diğer tüm çökeltiler için 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanın. , Ya da daha zor çökeltiler erimesi için 10-15 dakika karıştırın orbital bir karıştırıcı üzerinde 160 rpm&#39;de çalkalanarak çökelti, bir pipet ile karıştırılır sırasında tekrar tekrar yukarı ve aşağı çözeltisi çizerek, steril bir spatula ile ayırmak, veya bu prosedürlerin bir kombinasyonu ile. Not: birden fazla santrifüj şişesi kullanırken, sodyum fosfat az 30 ml kullanılarak çökeltiler birleştirmek ve daha sonra, bir şişe ya da kap içine çökeltiler birleştirildikten sonra şişe durulama 30 ml geri kalan kısmı kullanır. </li><li> Birleştirilen çökelti düz tabanlı bir santrfuj şişesine ise, şişeye bir karıştırma çubuğu ilave edin. 2.6.5 Adım gidin. </li><li> Birleştirilen Çökelti konik bir tabana sahip bir santrfuj şişesine ise, küçük bir cam beher içine aktarın ve beher bir karıştırma çubuğu ilave edin. </li><li> Bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe veya behere koyun ve pr kadar karıştırınecipitate tamamen çözülene. </li><li> 0.525% sodyum hipoklorit ile bir kombinasyon tipi pH elektrodu yeniden sterilize ve Aşama 2.1&#39;de tarif edildiği gibi 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 7 ve 10 standartlar kullanılarak pH metre kalibre. Yavaş yavaş 1 M NaOH ile 9.0&#39;a tamamen çözünmüş çökelti pH oranını ayarlamak ve daha sonra 10 dakika boyunca karıştırılmıştır. </li></ol></li><li> karıştırma çubuğu çıkarın ve 4,000-10,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca çözülmüştür çökelti santrifüj. </li><li> Dikkatlice pelet bozmadan bir cam behere süpernatant dökün. beher bir karıştırma çubuğu ekleyin ve pelet atın. </li><li> Bir manyetik karıştırıcı üzerine behere koyun ve çözüm karıştırın. 7,0-7,5 pH ayarlamak için akıllıca 1.2 M HCI damla ekleyin. </li><li> Filtre% 1.5 sığır özü, 15 ml, 0.05 M glisin, pH 7.0-7.5 ile önceden tedavi edilmiş bir ön filtre ihtiva eden bir sterilizasyon filtresi yardımıyla geçirilerek süpernatant sterilize edin. </li><li> Deney Örnek Volume (S) hesaplamaları: <ol><li> Kullanım Denklem 1, Lab Müstahkem Boş ve Boş Lab reaktifi dışındaki tüm test numuneleri için S hesaplamak için <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> denklem 1 D (Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi) Yeraltı 500 L olduğu, TSV (Toplam Örneklem Hacmi) laboratuvar tarafından alınan 5-inç elektropozitif kartuş filtreden geçirilir alan numune hacmi ve FCSV (Final Konsantre Örnek Hacmi) Adım 2.10 filtrasyon aşağıdaki birimdir. Bir örnek tamamlayıcı malzemeler Bölüm S4.1 gösterilmiştir. </li><li> Ve Boş Lab Reaktif (LRB; yani reaktif dereceli su kullanarak negatif kalite kontrol) 0.3 ile FCSV çarpılarak; Blank Lab Müstahkem (yani seribaşı reaktif dereceli su kullanılarak bir pozitif kalite kontrol LFB) için S hesaplayın. </li></ol></li><li> thre içine FCSV BölE alınan örnekler. <ol><li> 1.04 kat Testi Örnek Hacmi eşit bir hacmi ile alınan örnekler 1 ve 2 hazırlayın. ; Veya altında -70 ° C, toplam kültürlenebilir virüs tahlili (alt örnek 1, Adım 4) kullanılarak analiz veya 24 saat içinde (gösterilmemiştir) moleküler deneyleri için işlenemez eğer bu Alt-numûnelerin Freeze aksi halde, 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> veya altında kalan hacmi (alt örnek 3) Freeze -70 ° C. </li></ol></li><li> 10 ile S bölerek Aşı Volume hesaplayın. </li></ol> 3. Toplam kültürlenebilir virüs Quantal Deneyi NOT: Tüm adımlar her zaman hücre tek tabaka rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde çözüm eklemek için. <ol><li> Durusu veya 3-6 gün sonra bölme de BGM hücrelerinin bir tek tabaka içeren test gemilerden aspirat medya ve sonra kaldırılır medyaya eşit dengeli tuz çözeltisi hacmi ekleyin. </li><li> Durusu veya hücre kültürü te gelen dengeli tuz çözeltisi aspirest gemiler kullanılan ve daha sonra hücre kültürü testi damarları aşılamak olan <ol><li> Toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4) ile birlikte Aşı Cilt eşit alt örnek 1 hacminde her test numunesi için 10 test damarları aşılamak. </li><li> (LFSM, yani, tohumlanmış sulu ortam örneği) LFB ve Lab Kuvvetlendirilmiş Örnek matris için bir seyreltici olarak alt örnek 3 ve 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanılarak 5-, 25- ve 125-kat seyreltiler hazırlanır. seyreltileri yapmak için bir yöntem örneği, ek malzemeler bölümü S3 verilmiştir. Aşama 3.2.1 içinde seyreltilmemiş alt örnek 1 ile aşılanmış kaplara ek olarak, her bir test kabına bir inokülüm hacimde kullanılarak her bir inceltilmiş serileri için 10 yıkanmıştır hücre kültür testi damarları inoküle. </li><li> inkübasyon 14 gün sonra 10 tekrarlı CPE vardır (Adım 3.2.2 aşılandı dışındaki) Adım 3.2.1 herhangi bir test örneği için, önceden (Adım 3.3)alt örnek 3. 5-, 25- ve 125- ve 625-kat seyreltme pare inoküle 10 toplam kültürlenebilir virüs quantal yeni bir dizi ile birlikte her bir test gemide bir Aşı Volume kullanarak her seyreltme serisi için hücre kültürü testi gemileri yıkanır tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4). </li><li> ileri ve geri damarları eğerek hücre mono tabakaları yüzeyi üzerinde inokulum dağıtın. 1-5 titreşimler / dakika ya da mevcut olan herhangi bir virüs hücrelere tutunmasını sağlamak için kapların her 15-20 dakikada bir sallanan mekanik sallanan bir platform üzerinde 80-120 dakika için oda sıcaklığında test kapları inkübe edin. </li><li> önceden ısıtılmış bakım orta ekleyin ve sonra 36.5 ± 1 ° C&#39;de deney gemileri kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> ayarlanmış bir dondurucuya ≥75% CPE gösterir herhangi bir test gemiler gün 14. Transferi kadar onları her 2-3 günde incelemek sonra ilk 3 gün günde bir mikroskop kullanılarak her test kabında CPE görünüm için bakın ve ya-70 ° C&#39;nin altında ° C. veya altında kalan tüm kültürleri ve toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri Freeze -70 ° C son gününde gemileri inceledikten sonra. </li><li> tüm kültürleri çözülme ve 0.2 mikron sterilizasyon filtresi yardımıyla her CPE-pozitif test kabından orta ≥15% filtre. Belirtilen hacim 1,500-18,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile tıkanması, santrifüj, filtre içinden geçerek orta geçirilir ve filtrasyona 4 ° C önceden edilemezse. </li><li> Yıkanmış BGM testi gemileri kullanarak tüm 1. geçiş testi gemilerin ikinci geçişini gerçekleştirin. <ol><li> Tüm negatif test damarlardan ve olumlu damarlardan süzülmüş ortamdan çözülmüş ortamın% 10 temsil eden bir aşılama hacmi ile yeni test damarları aşılamak. </li><li> Tekrarlayın 3.2.4-3.4.3 adımları, ancak adım 3.3 tarif edildiği gibi 2 nd 1 st geçit üzerinde olumsuz ve olumlu oldu herhangi bir test gemi dondurmak. Bir 3. geçmek gerçekleştirinYalnızca negatif tahlil kontrolleri ve 2. pasajda 1. geçişi sırasında negatif ve pozitif hücre kültürleri kullanılarak 2. geçişi için tarif edildiği gibi yaşı. </li></ol></li><li> Onlar 1. ve 2. pasaj ya da her ikisi de CPE gösterdiğinizde CPE 2. pasajda kadar hem 2. ve 3. geçitleri oluşmaz durumunda, virüs pozitif olarak bireysel test damarları belirleyin. </li><li> Tüm test numunelerinin virüs titreleri hesaplamak için Tablo S2 gösterildiği gibi ayarlanan varsayılan program ayarları ile USEPA En Muhtemel Sayı Hesaplama kullanın. <ol><li> Giriş MPN / ml değeri (M mL) ve üst (CL UML) ve alt (CL lmL)% 95 güven sınırları / ml değerlerini belirlemek için hesap makinesi içine her bir test numunesi için adım 3.6 virüs pozitif çoğaltmak testi gemilerin sayısı . </li><li> ODenklem 2 kullanılarak ilgili test örneğinin EMS / L değeri (M L) btain. <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> denklem 2 M ml Adım 3.7 EMS / ml değeri, S Deneyi Numune Hacmi ve D Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğunu. </li><li> M ml değeri CL UML değerini ikame ederek üst güven sınırı / L hesaplayın. M ml değeri CL lmL değerini yerine göre alt güven sınırı / L hesaplayın. Bir örnek hesaplama ek malzemeler Bölüm S4.2 gösterilmiştir. </li><li> 0 / D 1 ≤ olarak Raporu M ml değerleri. Örneğin, yeraltı suyu örnekleri için 0.002 EMS / L (≤ 1/500 L) ≤. </li><li> Sert her Lab MPN ve% 95 güven sınır değerlerini hesaplamak Boş ve Lab Reİlk S tarafından hesap elde edilen değerler / ml çarpılması ve daha sonra 0.3 ile sonuç bölerek Boş ajan. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells.">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li><li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters.">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li><li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico.">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+surveillance--United+States.">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li><li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+infections:+diagnosis+and+treatment.">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li><li>Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteroviruses:+an+emerging+infectious+disease?+The+real,+the+speculative+and+the+really+speculative.">The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative.</a> Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).</li><li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths+from+norovirus+among+the+elderly,+England+and+Wales.">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li><li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan.">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li><li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+murine+norovirus,+feline+calicivirus,+poliovirus,+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater.">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li><li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water.">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li><li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus,+Coxsackievirus,+Echovirus,+and+Murine+Norovirus.">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li><li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment.">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPA/600/R-95/178.">EPA/600/R-95/178.</a> ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Parts+141+and+142+Revisions+to+the+Unregulated+Contaminant+Monitoring+Regulation+(UCMR3)+for+Public+Water+Systems+Final+Rule.">40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule.</a> Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Part+141+National+Primary+Drinking+Water+Regulations:+Monitoring+Requirements+for+Public+Drinking+Water+Supplies;+Final+Rule.">40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule.</a> Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li><li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+occurrence+and+health+risks+in+drinking+water+.">Virus occurrence and health risks in drinking water .</a> Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).</li><li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).</li><li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters.">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee,+wisconsin,+collected+august+1994.">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

USEPA Yöntem 1615 Kontrolsüz Kirletici İzleme Yönetmelik üçüncü izleme döngüsü (UCMR3) 17 sırasında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve öncelikle yeraltı virüs oluşumunu ölçmek için tasarlanmıştır. Bu Bilgi Toplama Kuralı (ICR) yöntemiyle, 15,18 ile ortak bir takım adımlar paylaşan ancak iki küçük farklılıklar vardır. Hem En Muhtemel Sayı (MPN) hesaplamalara dayalı olan kantitatif ile BGM hücre mono tabakaları üzerinde CPE üretmek virüs ölçmek için quantal tahliller kullanın. Yöntem 1615 çeşitli su matrisleri virüsü konsantre edilmesi için yeni bir elektropozitif filtrenin kullanımını sağlar ve hücre kültür testi kap sayısı 20 ile her iki küçük değişiklikler, genel yöntem maliyetlerini azaltmak 10. seyreltme başına replike azaltır. çoğaltır sayısındaki azalma emek azaltır, ancak biraz daha düşük bir belirleme sınırına yol açar. Yeraltı suları yüzey suları daha virüsün düşük konsantrasyonlarda olması beklenmekle birlikte, 19,20 incitahlil numunenin e miktarı farklılıkların kısmen telafi yüzey suyunun beş katıdır. Daha az çoğaltır kullanımı çoğu yüzey suları için yeterli olacaktır, ancak bazı örnek seyreltme gerektirir. Yöntem 1615 pek çok kritik adımlar ve sınırlamaları vardır. Sığır ekstreler partiden partiye değişebilir. açıklanan ek malzemeler bölümü S2.3 olduğu gibi her yeri virüs elüsyon etkinliği ve ikincil konsantrasyon adımlarda virüs konsantrasyonu için kapasite için test edilmelidir. yöntem BGM hücre kültürleri üzerine aşılamak için ve virüs titreleri belirlemek için numune miktarını hesaplamak için kesin formüller kullanır. Bu formüller titizlikle takip edilmezse hatalı sonuçlar oluşacaktır. Uygun aseptik teknik hücre kültürlerinin bakımı için kullanılmalıdır. 14 günlük kuluçka döneminde sıkıntı göstermek bulaşmamış BGM hücre kültürü kontrolleri olasılıkla hücre kültürü bakımı ile ilgili sorunlar göstermektedir. Büyük bakım da ta olmalıken aşılanması ve çapraz bulaşmayı önlemek için hücre kültürü şişeleri orta eklenmesi ile ilgili adımları pipetle sırasında. Tamamlayıcı malzemeler Bölüm S2 açıklanan kalite kontrolleri titizlikle uyulmalıdır. Bölüm S2 de kalite sorunları için sorun giderme tavsiyelerde bulunur. Filtreleri elektropozitif virüs adsorpsiyon birincil mekanizma filtre üzerinde pozitif bir yük gücü ve izoelektrik noktası ile ilgili virüsün &#39;negatif yük gücü ve 21 test edilen suyun pH&#39;sı ile ilgili bir yük etkileşimdir. filtresi elüsyon ayrıca etkileşimlerin gücündeki etkilenir. onlar virüs türleri arasında ve hatta aynı tür içinde suşları arasında farklılık olduğundan, filtreler sağım tekdüze değildir. Bu, herhangi bir sonuç çevresel sularda bulunan virüsün gerçek düzeyini hafife anlamına gelir. Tek BGM hücre çizgisinin kullanımı da virüs oluşumunu göz ardı etmektedir. Menziltemel olarak poliovirüsler ve Enterovirüs B türlerinin serotipleri gibi bazı reovirüsler 14,15,22 sınırlıdır, bu hücre hattında CPE üretebilir enterik virüs. Diğer bulaşıcı virüs türleri tespit olmayacaktır. Zemin ve reaktif dereceli sularından poliovirus kazanımları hem Performans Değerlendirme (PE için USEPA Yöntem 1615 performans kabul kriterlerini, yani, başlamadan önce analisti performansını değerlendirmek için kullanılan bir analist bilinmeyen titreleri ile ekildi reaktif dereceli su numuneleri bir çalışmada) ve LFB örneklerinde (ek malzemeler Tablo S1). Kültür prosedürü kullanılarak yeraltı suyundan% 58 geri kazanım musluk suyu 23,24 kullanarak başkaları tarafından bildirilen benzerdir. varyasyon katsayısı% 100 (CV) ile% 111 arasında LFB örneklerinden ortalama kurtarma ayrıca PE örneklerinde gözlenen daha yüksek olsa da yöntem performans kabul kriterlerini DURICR ing. ICR ortalama laboratuvarda kazanımları% 85 (; ICR PE veritabanından yayınlanmamış veriler özgeçmişler 58 131%) 36&#39;dan farklılık ise laboratuarlar arası iyileşme% 92 varyasyon (CV) katsayısı ile% 56 idi. Daha yüksek geri kazanımlar yüksek tohum örneklerinin (122% 42 karşı) için daha düşük tohum LFB numuneler için bu çalışmada gözlenmiştir. ICR planlanan edildiğini zamanda, düşük tohum değerleri alan PE örnekleri bu yüksek tohum alma, alt kurtarma olurdu bekleniyordu. LFB örnekleri burada gözlenene benzer, ICR PE örnekleri için çocuk felci virüsü geri tohum değerleri için (CV% 100),% 54 (CV% 69) ve% 44 (CV% 71)% 71 ≤300 EMS, 300- sırasıyla 1.500 MPN ve&gt; 1500 MPN. Su örnekleri 25 bulaşıcı bir virüs ölçmek için bir çok yöntem vardır. Bu yöntem, standartlaştırma derecesi diğer yöntemlere göre önemlidir. standardizasyon, kalite ve performans denetimleri içerir sadeceaynı zamanda tüm analitik laboratuvarlar aynı yöntemi gerçekleştirmek sağlamak için tanımlanmış hacimleri ve formülleri kullanır. standardizasyon olmadan, o laboratuvarlar arasında sonuçlarını karşılaştırmak zordur ve çok sayıda analitik laboratuvarlarda büyük ölçekli çalışmalar yaparken, bu nedenle standardizasyon gereklidir. Yerleşik standardizasyon ile bu yöntem ek virüs türleri ve hücre çizgilerini içerecek şekilde gelecekte genişletilmesi gerekmektedir. Araştırma yönteme adenovirüs dahil edilmesi için veri sağlamak için devam etmektedir.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Enterik virüsler insan bağırsak sistemi bulaştırmak ve fekal-oral yolla bulaşan virüsler bir gruptur. Bu virüsler atık su arıtma tesisi ve fosseptik atıkları, yanlış tasarlanmış veya kırık septik tanklar, kırık kanalizasyon hatları, kombine kanalizasyon taşmaları ve diğer noktası ve noktasal olmayan kaynaklardan 1-4 ile yüzey ve yeraltı sularını girin. su bazlı virüslere karşı insan enfeksiyonları ve hastalık kontamine veya yetersiz dezenfekte su tüketimi yoluyla ya da eğlence su temas yoluyla meydana gelir. Hastalık belirtileri şiddetli gastroenterit hafif içerebilir; konjunktivit; ateş; Üst solunum sıkıntısı; el, ayak ve ağız hastalığı; miyokardit; aseptik menenjit; ensefalit; felç; sepsis 5-8 ve ölüm 9,10. USEPA Yöntem 1615 çevresel ve içme sularında bulaşıcı enterik virüs parçacıkları ölçmek için bir yordam sağlar. Bu sular içerebilirbulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virionlar karışımı, ancak bulaşıcı parçacıklar potansiyel sağlık tehlikesi oluşturmaktadır. Bulaşıcı virüs parçacıkları nedeniyle 11-13 mevcut olabilecek herhangi bir dezenfektan protein kapsid bütünlüğü nedeniyle UV ışığı radyasyon ve hasara nükleik asitlere HASARDAN çevre içme sularında zaman enfeksiyon kaybeder. yöntem temin toplam kültürlenebilir virüs prosedürü Buffalo Green Monkey türü maymun böbrek (BGM) hücre hattına sitopatik etkiler (CPE) üretimine dayanır. Bu hücre hattı tespit bulaşıcı bir virüs türlerinin aralığı belli enterovirüsler 15 öncelikle kısıtlı olsa bile, çünkü çevre viroloji alanında 14,15 yılında yaygın kullanımı seçildi. Bu çalışmanın amacı, beş inçlik electropositive kartuş filtreler elüsyon, ikincil konsantrasyon ve toplam Yetiştirilebilen virüslerin ölçümü için Yöntemi 1615 prosedürlerini tarif etmektir. bir değerlendirmeGenel olarak yöntem, Cashdollar ve ark., 16 tarif edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Beef extract, desiccated powder</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Mechanical rocking platform</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing filter with prefilter</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing syringe filter</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>pH Standards</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 or M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 7.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Virüs üç içme suyu arıtma tesisleri ve özel kuyu kullanarak elektro filtrelerin kaynak yeraltı suyundan konsantre edildi. Bir alan numune ve LFSM kontrol oluşan iki örnek setleri, ayrı olayda arıtma tesislerinden toplanmıştır ve bir örnek seti özel kuyudan toplanmıştır. Her bir numune ile birlikte kullanıldığında tohum EMS değeri doğru bir şekilde bağlı belirlenemedi çünkü genel olarak, virüs veri hesaplama alınmadı bitkiler ve kuyu (bir bitki ve diğerinden numuneden iki numune ikisinden LFSM numuneleri kullanılarak belirlendi çoğaltmak şişeler arasında anormal CPE sonuçları) için. Yeraltı suyu örneklerinden polio kurtarma ortalama (Şekil 2) 16% 79 bir farklılaşma katsayısı ile% 58 ortalama. Hiçbir kültürlenebilir virüs yinelenen giremeyen yeraltı suyu alan örneklerinin hiçbirinde tespit edildi. Yöntem performansı da LFB s kullanılarak ölçüldüamples iki farklı tohum seviyeleri kullanılarak modifiye. poliovirus 1000 MPN de performansını test etmek için kullanılan bir poliovirus 300 MPN A &quot;düşük&quot; titre USEPA Yöntem 1615 A ​​&quot;yüksek&quot; titre kullanılan &quot;standart&quot; 500 MPN LFB seviyesinden daha az seviyelerde performansını değerlendirmek için kullanıldı LFSM kontrol seviyesi. Bu kontroller,% 111 bir ortalama iyileşme ve% 100 bir farklılaşma katsayısı (Şekil 2) benzer şekilde yapılmıştır. Tüm LRB numuneler negatif ve tüm LFB örnekleri kabul aralığı (ek malzemeler Tablo S1) içinde gerçekleştirilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Şekil 1. Filtre elüsyon. Kartuş filtre, yıkama için bir basınç kabı kullanılması için bir şematik gösterilmiştir. Pozitif hava basıncı kartuş yuvası con boyunca basınç kabında biftek ekstresi çözeltisi itmek için kullanılırelektropozitif kartuş filtre taining. pompanın giriş sığır özü çözeltinin bulunduğu kabın içine yerleştirilmeden bir peristaltik pompa, basınç kabı için ikame edilebilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Ground gelen Şekil 2. Ortalama Poliovirüs Kurtarma (%) ve Reaktif-Grade su. Ortalama yüzde kurtarma yerden poliovirüs için gösterilir ( <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) ve distile su ( <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) örnekler. oniki reaktif dereceli su numuneleri altı poliovirus 1000 MPN ile tohumlanan 300 MPN ve altı ile seribaşı dahil. Hata çubukları standart hatasını temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay at JoVE.com

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Görüntüleme.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Video: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Çevre

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, bir Geliştirilmiş INEX Yöntemi için<em&gt; In Situ</em&gt; Partikül Ölçümü ve Çözünmüş bileşikler Aktif Süspansiyon besleme üniteleri İşlenmiş

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of hospitalizations in children with a public health impact similar to that of Rotavirus. NoVs are RNA viruses of great genetic diversity and there is a continuous appearance of new strains. Five genogroups are recognized; GI and GII with their many genotypes and subtypes being the most important for human infection. However, the diagnosis of these two genotypes remains problematic, delaying diagnosis and treatment. 1, 2, 3
For RNA extraction from stool specimens the most commonly used method is the QIAmp Viral RNA commercial kit from Qiagen. This method combines the binding properties of a silica gel membrane, buffers that control RNases and provide optimum binding of the RNA to the column together with the speed of microspin. This method is simple, fast and reliable and is carried out in a few steps that are detailed in the description provided by the manufacturer. 
 Norovirus is second only to rotavirus as the most common cause of diarrhea. Norovirus diagnosis should be available in all studies on pathogenesis of diarrhea as well as in outbreaks or individual diarrhea cases. At present however norovirus diagnosis is restricted to only a few centers due to the lack of simple methods of diagnosis. This delays diagnosis and treatment 1, 2, 3. In addition, due to costs and regulated transportation of corrosive buffers within and between countries use of these manufactured kits poses logistical problems. As a result, in this protocol we describe an alternative, economic, in-house method which is based on the original Boom et al. method4 which uses the nucleic acid binding properties of silica particles together with the anti-nuclease properties of guanidinium thiocyanate.
For the detection and genogrouping (GI and GII) of NoVs isolates from stool specimens, several RT-PCR protocols utilizing different targets have been developed. The consensus is that an RT-PCR using TaqMan chemistry would be the best molecular technique for diagnosis, because it combines high sensitivity, specificity and reproducibility with high throughput and ease of use. Here we describe an assay targeting the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region; the most conserved region of the NoV genome and hence most suitable for diagnosis. For further genetic analysis a conventional RT-PCR that targets the highly variable N-terminal-shell from the major protein of the capsid (Region C) using primers originally described by Kojima et al. 5 is detailed. Sequencing of the PCR product from the conventional PCR enables the differentiation of genotypes belonging to the GI and GII genogroups.

A One-Step RT-PCR assay for detection and genogroup identification of Norovirus isolates from children&#x2019;s stools, that utilizes primers and TaqMan probes specific to the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region, the most conserved region of the Norovirus genome is described. A non-commercial, cost-effective RNA extraction method is detailed.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Tıp

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

Fosfonat adsorpsiyon taneli ferrik minyatürize fosfor belirleme yöntemini kullanarak hidroksit üzerine belirlemek için en iyi duruma getirilmiş yordamı

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15Azot Analizi için Mikroplot Tasarımı ve Bitki ve Toprak Numune Hazırlama

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler