We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

Potansiyel Küçük Molekül Kapak Kapatma Gruplarının 1. Hesaplamalı Tanıtımı Not: Prensip olarak, yerleştirme veya farmakofor ara çeşitli yöntemler potansiyel kapatma gruplarını tahmin etmek için de kullanılabilir. DEĞİŞTİRME hesaplama çalışmaların amacı, ikame edilmiş amino asitlerin özelliklerini ve etkileşimlerini muhafaza eden küçük moleküllerin tespit etmektir. <ol><li> LigandFit yerleştirme protokolünün 14 Doğrulama </li></ol> Not: Daha önceki çalışmalarda, yerleştirme yöntemi (LigandFit 15, moleküler modelleme programı takımında bir modül, Discovery Studio 3.0) bu algoritma bilinen Ncaps bağlayıcı modlarını çoğaltmak ve sonuçlar elde göstermek için yeterli olduğundan emin olmak için doğrulandı bilinmeyen bileşikler 14 tahmini vardır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aşağıdaki adımları (1,2-1,5) kullanılarak aşağıdaki gibi LigandFit için optimal parametreleri tespit: PLP1 enPoz nesil, oluşturulan pozlar azaltılması ve pozlar analizi için PLP1 puanlama fonksiyonu için ji ızgara. </li><li> Elde edilen konformasyonlar sınırlamak ve kaplanmış peptidin kovalent bağ oluşumu için uygun ligandlar konumlandırmak amacıyla, hidrojen bağları için etkileşim filtre sırasıyla Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. </li><li> Tasarım ve A reseptörü (2UUE) siklin / CDK2&#39;nin içine fragmanı alternatifleri bir kütüphane rıhtım. Sentez ve PLP1 puanlama, CBG ile etkileşim filtreleri ve tamamlayıcılık ile etkileşim dayalı ticari kaynak potansiyeli kapak kapatma gruplara öncelik. Aşağıdaki gibi LigandFit yerleştirme için gereken çeşitli adımlar vardır. </li></ol><ol start="2"><li> Reseptör bağlanma sitesi 14 Hazırlanması <ol><li> Yazılımda bir görselleştirme penceresine: CDK2 / siklin A kristal yapısı (2UUE pdb id) İthalat. Bu yapı, daha önce tanımlanmış olan FLIP ihtiva 5-metil-1-fenil-1 H-1, 2,4-triazol-3-karboksamido (3,5-DCPT) RLIF siklin yivine bağlıdır (Şekil 3). </li><li> Sil veya yerinde kalıntıları RLIF (C-terminali) tutmak. Peptit sekansı muhafaza edildiğinde, ligand için etkileşim filtresi olarak peptidin N-terminal amino grubu kullanılır. &quot;Reseptör-ligand etkileşimleri&quot; araçlardan, N-cap Göster / Gizle sitesi alandan 3,5-DCPT etrafında bir küre oluşturun. Küre ligand-reseptör etkileşimleri bağlanması esnasında oluşmasına izin verilir bağlanma yeri aktif bölgeyi tanımlamak için oluşturulur. </li><li> &quot;Seçilen ligand hacmi olarak bulabilirsiniz sitesinden&quot; dan daha bağlanma bölgesini tanımlar ve proteinden Ligandı 3,5-DCPT silin. Oluşturulan alanı içinde bağlayıcı hacmini tanımlamak için bu adımı uygulayın. </li><li> Hidrojen bağlanması için etkileşim filtreleri olarak artıkları Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. Etkileşimi filtreleri ayarlama böylece bütünleşmesini yalnızca pozlarset kalıntılarının atomları ile ract nedenle demirledi pozlar önemli etkileşimleri koruyarak yerleştirme sürecinde filtre edilecektir. </li></ol></li><li> Ligandlar 14 Hazırlanması <ol><li> Molekül ağırlığı 500&#39;den daha az ikincil cebinde kesik peptit ve van der Waals etkileşimleri için uygun hidrofobik grupların (ikame edilmiş fenil grubu) dahil edilmesi ile ligasyon için bir karboksilat grubun varlığı da dahil olmak üzere ölçütlere göre 100 potansiyel kapaklama gruba kütüphane Tasarım Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Trp217 ve ikame edici ile peptid, hidrojen bağı etkileşimlerini almışlardır heterosiklik halkalar seçin HAKRRLIF arasında bazik yan zincirler, iyon-çiftlenmesi etkileşimlerini değiştirmek için dahil. Karbonil oksijen ile bir kaynak peptidin (Tablo 1) &#39;de peptit omurgasına benzeyen Gln254 amid azot atomu ile etkileşime girebilir, böylece ilgili aldehid moleküller olarak ligandları bağlantı istasyonu. </li><li> Önce docKral, düşük enerjili konformasyon için tasarlanmış ligandların en aza indirmek ve &quot;ligandlar hazırlayın&quot; protokolünü kullanarak uygun bir iyonizasyon devlet hazırlar. Beraberlik ve yazılım içine ithal edilen bir tablo için ChemDraw&#39;a içinde .sdf dosyası biçiminde bu potansiyel N kapaklar ihracattan önce. Not: ligandlar protokolünü hazırlayın tüm ligandlar en aza indirmek için kullanılan en düşük enerji durumlarına demirledi edilecek ve iyonizasyon ücrete atomların uygulanmıştır. Varsayılan parametreler bu aşama için kullanılır. </li></ol></li><li> Siklin A Groove 14 ligandlann Yerleştirme <ol><li> Yazılımın reseptör-ligand etkileşimleri protokolü setinden LigandFit rutin seçin. Reseptörü ve bu protokol için girdi olarak hazırlanmış ligandlar kullanın. </li><li> Enerji şebekesine olarak bu çalışır seçkin PLP1 için, bu enerji minimize olacak pozlar ve 10 olarak oluşturulan pozlar sayısı varsayılan değerlerine tüm diğer parametreleri bırakın belirtin. Not: LigandFit olduğuMonte Carlo yapısal arama algoritması ile kombine bir şekil tabanlı karşılaştırma filtre kullanarak bir proteinin aktif site ile yüksek tamamlayıcılık ve potansiyel yakınlık pozlar tanımlamak ve üretebilir bir yerleştirme yöntemi. Yerleştirme programı tarafından kullanılan enerji ızgara ligand-reseptör etkileşimleri ve potansiyel pozlar üretmek için güç alanıdır. PLP1 özellikle hidrojen bağlayıcı etkileşimleri önceleyen ve parçalı lineer potansiyeli PLP atom türü her hidrojen olmayan ligand atom veya hidrojen olmayan reseptör atomu için tahsis nerede. </li></ol></li><li> Sonuçların analizi <ol><li> İlk etapta, ekran PLP1 puanı değerlerini azalan göre sıralama sonra visualizer programında pozlar ve. Aday ligand göre yerleştirilmiş bir ligandın bağlanma afinitesi, hedef reseptör yapısı ile geometrisi ve kovalent olmayan bir etkileşim teşkil tahmin etmek için örneğin PLP1 skorlama fonksiyonlarını kullanın. Not: Burada PLP1 puanlama fonksiyonu g bulunduhidrojen bağının tahmini içerdiğinden en iyi sonuçları ive. </li><li> Bilinen kapama grubuna değerini en az 2 Å (göreceli ortalama kare sapma (RMSD sahip)) ile görsel 1 için attı pozlar üst% 25 analiz) ile üst üste, 2) siklin yivli etkileşim filtreleri ve 3) görsel tamamlayıcılık yerine . O kabul edilen bir doğru (bir deneysel yapıya kıyasla) poz demirledi &lt;2 Å bir RMSD değerine sahiptir. </li><li> Bilinen yapı-aktivite ilişkileri ile tutarlı bir şekilde, bağlama cebinin etkin dolgu maddesine sahip olarak tanımlanır, görsel tamamlayıcılığı için pozlar inceleyin. Etkileşim filtreleri bağlanması ve / veya amid bağı oluşumu için uygun geometride bir potansiyel kapama grubunu yerleştirmek için gerekli olan kritik olduğu bilinen, moleküller arası temas gerektiren atomu kısıtlamaları dahil etmek için ayarlanır. Interactio ile hidrojen bağı oluşturur potansiyel N-kapatma grupları yerleştirilmiş pozlar üç örnekn adet filtre, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Sentezi ve Potansiyel N -capping Gruplar Karakterizasyonu <ol start="1"><li> N-kapatma grupların sentezi. </li><li> Elde edilen sentezi için, ticari başlangıç ​​materyalleri, solvent ve reaktifler kullanılır. Geleneksel sentetik organik kimya (bir örnek için Şekil 5, 12,13) ​​ile potansiyel N-kapatma gruplarını sentezleme. </li><li> Reaksiyonları izlemek için, silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi (TLC) uygulayın. <ol><li> Mobil faz olarak bir başlangıç ​​materyali reaksiyon karışımı (1 mg) çözündürün ve kılcal borular kullanılarak TLC plakası üzerinde nokta onları. </li><li> (A 35:65 oranında etil asetat ve heksan), mobil faz içeren bölmeye TLC plaka koyun. Mobil faz TLC plakası% 90 ulaştığında, kaldırmak ve hava plakasını kurulayın. </li><li> Görünür noktalar olarak başlangıç ​​malzemesi ve reaksiyon karışımları tespit etmek için UV ışığı kullanın. CalBütün noktalar R f (nokta ve mobil faz mesafenin oranı) hesaplanmalıdır. Not: başlangıç ​​malzemesinin Rf görülen hiçbir yerinde olduğu zaman, reaksiyon tamamlanmıştır. </li></ol></li><li> Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, sulu bir asit veya baz çözeltisi ile bir ayırma hunisi ve yıkamada yerleştirerek reaksiyon karışımı kadar çalışır. Vakum altında elde edilen ham ürün, organik çözücü madde döner bir buharlaştırıcı içinde toplamak buharlaştırılmak ve kurutun. </li><li> Uygun bir çözücü, 3-5 ml ham ürün, 500 mg çözülür ve silika ya da RP 18 Samplet bir 1 g eklemek ve hava altında kurutulur. Silis / RP SNAP flaş kartuşlarında ham ürün ihtiva eden Samplet yerleştirin ve% 6 etil asetat ile başlayarak gradyanı çalışma ile SNAP 100 g kolonu kullanılarak (üreticinin protokolüne göre) otomatik yüksek performanslı flaş kromatografisi kullanılarak ham materyal saflaştırılması: 94 % 50% etil asetat heksan ve tekrar% 50 hekzan15 kolon hacmi. </li><li> Kuruyana kadar tüm çözücüyü buharlaştırarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak hızlı kromatografi ile ilgili çözücü içinde toplanan saflaştırılmış ürün kurutulur ve daha fazla kalan tüm çözücüleri uzaklaştırmak için vakum altında ürün kurutulur. NMR, MS ve analitik HPLC ile arıtılmış ürünün karakterizasyonu gerçekleştirin. <ol><li> 1H NMR ve 13C NMR için, saflaştınlmış numuneye yaklaşık 10 mg ağırlığında uygun bir deuteratlanmış çözücü içinde çözünmesi, ve NMR spektrumları 2,14 kayıt için kuru bir NMR tüpü içeriği aktarın. </li><li> 1 H NMR ve yüksek alan NMR Spektrometresi (en az 300 MHz) ile 13 ° C NMR spektrumları kaydedin. Bir QTOF (uçuş kütle spektrometresi Tandem dört-1 defa) kullanarak kütle spektrumları, elektrosprey iyonizasyonu (ESI) veya VG 70S Edinme (Çift odaklama manyetik sektör kütle spektrometresi, EI) 2,14. </li><li> Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile ürünlerin saflığını analiz ile donatılmışBir C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 um analiz sütunu. 30 dakika boyunca% 60 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 100 su (% 0.1 trifloroasetik asit) başlanarak gradyanı çalıştırmak kullanarak ve 4 dk için gradyanı tutun. 226 ve 254 nm 2,14 olarak kromatogramlar ayıklayın. Not: değerlendirildi bileşiklerin analitik saflık&gt;% 95 idi. </li></ol></li></ol> Döndürür 2 Üretimi için 3. Katı Faz Sentezi <ol start="1"><li> N-kapaklı çevirir sentezi <ol><li> Aşağıdaki adımları kullanılarak standart katı faz sentez yöntemleri ile N-uçlu peptidik bileşikler bir araya getirin. <ol><li> 2 ml O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N-tetrametil-uronyum-heksafluoro-fosfat (HBTU, 221,93 mg) 4,4 eşdeğer olarak C-terminal amino asit (Fmoc-Phe) 5 eşdeğer etkinleştirme 5 dakika boyunca, DMF. Diizopropiletil amin 6 eşdeğer kullanılarak Rink reçine üzerine Fmoc-Phe HBTU karıştırılmalıdır (DIPEA, 103,13oda sıcaklığında 1 saat için mg) eklenmiştir. </li><li> 10 dakika boyunca 3 ml DMF içinde% 20 piperidin kullanılarak C-terminal tortusu Fmoc koruma grubunun çıkarılması. Çift sonraki amino asitler (örneğin, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) adım adım. Her bir adımda, DIPEA (103,13 mg) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanarak bir sonraki amino asidin çift 5 eşd. </li><li> Yıkama döngüleri, yukarıda tarif edilen bir amino asit birleştirme ve koruma giderme adımları sonra Fmoc DMF (DCM + 5 x 10 ml 5 x 10 mi) uygulanır. Peptit montajı kurulduktan sonra, çift, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde DIPEA (103,13 mg) ve HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanılarak gruplar N-kapatma. </li><li> Peptidin montajının tamamlanmasından sonra, bölme karışımı 2 ml reaksiyon karışımı tedavi (: 5: 90 5 TFA / H2O / TIPS) O / N yan zincir koruyucu gruplar çıkarmak ve ayırmak reçineden çevirir. Soğuk dietil çökeltilmesi için eter ve I &#39;ile elde edilen ürünün toz haline getirinBir döner buharlaştırıcı içinde f gerekli konsantresi. </li></ol></li></ol></li><li> N-başlıklı-C-başlıklı çevirir sentezi <ol><li> O ile birlikte (16.1 mg, 0.02 mmol) diklorometan içinde ve ek [4- (3-klorofenoksi) piridin-2-il] metanamin (Cı-kapak) tartılır ve N-terminal olarak kapatılmış ve korunan Arg-Leu peptidi eritmek - benzotriazol-, N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametiluronyum heksaflorofosfat (HBTU; 16.7 mg, 0.02 mmol) ve N, N-diizopropiletilamin (DIPEA, 6.5 mg, 0.02 mmol) eklenmiştir. </li><li> Karıştırın ve TLC / HPLC, başlangıç ​​materyalinin tamamen tükendiğini gösterene kadar oda sıcaklığında reaksiyonu izleyin. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, etil asetat ve su arasında döner bir buharlaştırıcı ve daha sonra bir bölüm ile ham tepkime karışımı konsantre hale getirin. </li><li> Sulu ve organik tabaka ayrılır; 1 N NaOH, 1 N HCI ve tuzlu su ile organik tabaka yıkayın. Sodyum sülfat ile yaklaşık 1 g organik katman kurutulur ve döner bir buharlaştırıcı içinde ürün konsantre edilir. Fina(: 2.5: 2.5 trifluoroasetik asit / H 2 O / İPUÇLARI 95) korumanın kaldırılması için Lly bölünme karışımı ile ürün O / N davranın. </li><li> Soğuk dietil eter ile ve döner bir buharlaştırıcı içinde gerekli olan tüm çözücünün konsantre çıkarılması için tamamen kuruluk derecesinde şekilde elde edilen ürün toz haline getirin. Bundan başka, tüm çözücü kalıntısını uzaklaştırmak üzere, vakum altında ürün kurutulur. </li></ol></li><li> Arıtma ve döndürür karakterizasyonu <ol><li> Yarı preparatif ters-faz HPLC yöntemleri kullanılarak ham olarak döndürür arındırın. Arıtılmış döndürür liyofilize ve kütle spektrometresi 2,14 kullanarak molekül kütlesi karakterize eder. </li><li> Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile döndürür ve analitik saflıkta belirlemek 250 x 4.6 mm, 5 um kolonu, bir C 18 (2), 100 A ile donatılmıştır. % 95 H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 5 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 35 H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 65 asetonitril (% 0.1 trifluoroace başlayarak gradyanı yöntemi kullanın-asetik asit), 30 dakika boyunca, 4 dakika boyunca gradyanı tutun. Özü 226 ve 254 nm &#39;de kromatogra-. </li></ol></li></ol> Rekabetçi 2,14 Bağlama Tayini İçin Bağlanma Tahlili 4. Floresan Polarizasyon <ol start="1"><li> Siyah 384-kuyu (138 ul) aşağıdaki prosedürü kullanarak plakalarda tahlil gerçekleştirin. </li><li> Örnekleri, izleyici peptidleri (4 nM), ve kinaz kompleksleri seyreltin (CDK2 / siklin A - 18 ug / ml, CDK4 / siklin D - 37 ug / ml), deney tamponu (25 mM HEPES pH 7, 10 mM gerekli olan konsantrasyonlara NaCl,% 0.01 Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT). </li><li> 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, eklemek: CDK4D1 ya CDK2CA (0,3 ug / kuyu saflaştırılmış rekombinan insan kinaz kompleks), 5 ul bileşik çözeltisi, 30 nM izleyici peptid (fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val 5 ul 5 ul -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly ya fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracer peptid). Her bir DMSO (% 6), Buffe 5 ul kullanınr, radyoaktif izotop ve 5 ul DMSO (% 6), kinaz kompleksi, kontrol çukurları olarak izleyici </li><li> Tüm bileşenler ilave edildikten sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca (41,16 xg) 500 rpm&#39;de plaka santrifüj ve daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika boyunca çalkalama ile plaka kuluçkalayın. 485 nm / 535 nm eksitasyon / emisyon filtresi ve dikroik ayna ile donatılmış bir çok modlu bir plaka okuyucusu ve detektörü kullanılarak kuyulu bir levhadaki her Floresein yoğunluğu okuyun. </li><li> Aşağıda gösterilen eşitlik kullanılarak tüm test örnekleri için göreceli ortalama kutuplaşma (mp) hesaplayın. Göreceli milletvekillerini ilişkilendirilmesi ve konsantrasyonları test ederek Yatırım Ortamı logaritmik regresyon ile 50 değerleri belirlemek. </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Andrews, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REPLACE:+a+strategy+for+iterative+design+of+cyclin-binding+groove+inhibitors.">REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors.</a> Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Non-ATP+Competitive+CDK/Cyclin+Groove+Inhibitors+through+REPLACE-Mediated+Fragment+Assembly.">Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly.</a> J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).</li><li>McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+29.">Chapter 29.</a> Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).</li><li>Bower, J. F., Pannifer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fragment-based+technologies+to+target+protein-protein+interactions.">Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions.</a> Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).</li><li>Makley, L. N., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+number+of+'druggable'+targets:+non-enzymes+and+protein-protein+interactions.">Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions.</a> Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).</li><li>Walensky, L. D., Bird, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrocarbon-Stapled+Peptides:+Principles,+Practice,+and+Progress.">Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress.</a> J Med Chem. , (2014).</li><li>Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinase+pathways+as+targets+for+cancer+treatment.">Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment.</a> J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).</li><li>Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+dependant+kinase+inhibitors:+Useful+targets+in+cell+cycle+regulation.">Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation.</a> Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).</li><li>Morphy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectively+nonselective+kinase+inhibition:+striking+the+right+balance.">Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance.</a> J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+transformed+cells+by+cyclin/cyclin-dependent+kinase+2+antagonists.">Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).</li><li>Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-noncompetitive+inhibitors+of+CDK-cyclin+complexes.">ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes.</a> ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).</li><li>Kontopidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+cyclin+groove+recognition:+complex+crystal+structures+and+inhibitor+design+through+ligand+exchange.">Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange.</a> Structure. 11, 1537-1546 (2003).</li><li>McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomimetic+design+of+CDK+inhibitors+targeting+the+recruitment+site+of+the+cyclin+subunit.">Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit.</a> Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).</li><li>Premnath, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+based+discovery+of+arginine+isosteres+through+REPLACE:+towards+non-ATP+competitive+CDK+inhibitors.">Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors.</a> Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).</li><li>Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LigandFit:+a+novel+method+for+the+shape-directed+rapid+docking+of+ligands+to+protein+active+sites.">LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites.</a> J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).</li><li>Mendoza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cyclin-dependent+kinase+2/cyclin+A+antagonists+that+differ+from+ATP+site+inhibitors+block+tumor+growth.">Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth.</a> Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability.">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).</li><li>Zheleva, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+p21(WAF1)-derived+peptide+inhibitors+of+CDK-mediated+pRb+phosphorylation:+delineation+and+structural+insight+into+their+interactions+with+cyclin+A.">Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A.</a> The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).</li><li>Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein-protein+interactions+as+an+anticancer+strategy.">Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).</li><li>Thayer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+peptides.">Improving peptides.</a> Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).</li><li>Yin, H., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+targeting+protein-protein+interactions+with+synthetic+agents.">Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions.">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li><li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy.">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

Bu yazıda, daha fazla farmasötik ilgili moleküllerin içine protein-protein etkileşimleri peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için strateji DEĞİŞTİRİN (hesaplama zenginleştirme kullanarak kısmi ligand alternatifleri ile değiştirilmesi) uygulayarak bir vaka çalışması 1-3 tarif edilmiştir. PPİ potansiyel ilaç hedefleri zengin ama yeterince faydalanılmayan kaynağı temsil ederken, mevcut metodolojiler bu yaygın erişilebilir hale getirmek, büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Fragmanı göre dizayn 4, yüksek verimli tarama 5 ve 6 ilerlemeler sağlamıştır zımbalanmış peptidler dahil olmak üzere mevcut stratejiler, ancak, bu bir çok durumda etkisizdir. Sonuç olarak, daha fazla ilerleme ve daha verimli yaklaşımlar gereklidir. Tam ilaç gibi iyileştirilmiş özelliklere ve anti-tümör terapötik maddeler olarak daha da geliştirilmesi için bir potansiyele sahip olan kinaz inhibitörlerinin geliştirilmesinde doğrulanmıştır DEĞİŞTİRME. Bu strateji, hücre dışı ATP inhibitörlerinin geliştirilmesinde örneklenmiştirdöngüsü CDK&#39;ler ve aşağıda içerir: 1) siklin oluğu bağlayıcı HAKRRLIF / RRLIF etkileşimleri ile ilgili 3 boyutlu yapısal bilgileri elde edilmesi; 2) peptid etkileşimi için önemli bir bağlama determinantları olarak belirlenmesi; Bir veya daha fazla bağlama determinantları içeren peptit N-terminal bölgesinin 3) kesme; Peptid ve hangi kesik kısmı için potansiyel küçük molekül alternatiflerinin 4) hesaplama kimlik (kısmi ligand alternatifler PLA&#39;lar) ana peptid önemli etkileşimleri korumak; 5) sentez veya PLA&#39;lerin ticari kaynak önceden silinmiş peptid kalıntı (lar) tarafından işgal alt site ile heyecanla bağlamak için öngörülen; 6) katı faz sentezi kullanılarak kesilmiş peptid için en iyi PLA&#39;lerin ligasyonu yoluyla döndürür ve sentezi; Bağlanma, bir in vitro çevirir ya da bir hücre canlılığı deneyinde daha fazla karakterizasyon ve ardından fonksiyonel deneyi (CDK / siklin bağlamında floresan polarizasyon), 7) test edilmesi. Strateg DEĞİŞTİRME şematik bir temsiliy. Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir, bu yazıda, DEĞİŞTİRME strateji iterasyon tartışılmış ve CDK2 / siklin A uygulama detaylı olarak tarif. CDK&#39;lar, doğrudan veya dolaylı tümörlerinin çoğunluğunda deregüle olduğuna inanılmaktadır ve bu nedenle uygun kanser ilaç hedefleri 7 kabul edilir. CDK&#39;lar tam aktivasyon için siklinler ile ilişki gerektiren ve daha sonra hücre döngüsü düzenlenmesinde 8 kilit rol oynayan proteinleri fosforile. CDK&#39;ların iki ana grup, hücre döngüsü kontrol noktalarına kontrol izotipleri [G1 / S (CDK4 / Siklin D, CDK6 / siklin D ve CDK4 / siklin E), S fazı (CDK2 / siklin A) ve G2 / M (CDK1 / vardır siklin B)] ve fosforilasyon ile RNA polimerazın regülatörleri (CDK7 / siklin H, CDK8 / siklin C, CDK9 / siklin T). E2F1 transkripsiyon faktörü daha sonra DNA&#39;ya bağlanır ve gen transkripsiyonunu başlatır DP proteini ile bir kompleks oluşturduğunda, S fazındaki ilerlemeden bir anahtar aşama, meydana gelir. CDK2 / siklin A E2F1 transkripsiyonel nötralize etmek için gerekli olanfosforilasyon yoluyla aktivite bu şekilde E2F1-DP kompleksi ve daha sonraki bozulma serbest yol açar. CDK2 / siklin A inhibisyonu DNA&#39;sı bağlı durum, kalıcı aktivasyonuna yol içinde E2F1 muhafaza inanılmaktadır. E2F-1 aktivitesi elde edilen seviye, bir terapötik strateji öne p53 bağımsız apoptoz indüklemek için gereken eşik aşacak. Nedeniyle E2F-1 deregüle p53 ve pRb yolları, yüksek düzeyde çoğu zaman tümörler içinde seçici apoptosise yol açacaktır kanser hücreleri ve CDK2 / siklin A inhibisyonu ortaya çıkar ve geçerli bir kanser hedef 7 olarak kabul edilebilir. Klinik olarak incelenmiştir CDK inhibitörleri, insan kinome den büyük 500 protein kinazlar arasındaki reaktivite çapraz gelen, yüksek düzeyde korunan ATP bağlama bölgeleri hedeflemek ve potansiyel etkileri ve toksisiteyi 9 yan yol açan. Alternatif bir yaklaşım CBG aracılığıyla substrat işe hedefleyerek olmayan ATP rekabetçi inhibisyonusiklin pozitif düzenleyici alt birimi mevcut ve bu nedenle farklı ve site 10,11 ATP bağlama uzak olan. CBG esas siklin A, siklin D ve siklin E içinde bulunması, bir hidrofobik oyuk olup substratlar ve tümör baskılayıcı bulunan bir konsensüs sekansı tanımak için gösterilmiştir. Izole edilmiş bir peptit olarak, siklin bağlanma motifinin (MBP) CBG bağlanır ve hücre döngüsü CDK kinaz aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. MBP İlaçla için molekül ağırlığının arasında iyi bir denge gösteren bir pentapeptid için ayrıca kesik (HAKRRLIF, CDK2 / siklin A IC 50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / siklin D IC50 0,88 ± 0,34 uM) bir oktapeptit ve optimize edilmiştir benzerlik ve gücü (RRLIF, CDK2 / siklin A IC 50 1.01 ± 0.17 uM, CDK4 / siklin D, IC50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. CBGs bir acidi tarafından köprülü büyük bir birincil ve ikincil küçük hidrofobik cebine oluşurc bölgesi (Glu220, Glu224 ve Asp283 içerir). HAKRRLIF anahtar bağlayıcı belirleyicileri asidik bölge ve primer lipofilik site Leu6 ve Phe8 tamamlayıcılık bir yüksek derecesi ile Lys3, Arg 4 ve Arg5 ikincil hidrofobik cep, iyon eşleştirme ve hidrojen bağları ile Ala2 etkileşimini içerir. Ile7 primer cebine en uygun temas sağlayan bir ara tortu olarak hareket Buna ek olarak, çok sayıda hidrojen bağları peptit omurgasından katkıda bulunmaktadır. Bağlanma modu ve CBG ile HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. MBP / CBG, protein-protein etkileşimi hedefleyen CDK2 / siklin A, CDK2 / siklin E ve CDK4 / siklin D kinaz aktivitesini inhibe eden ve normal hücreleri 7 etkilemeyen bu E2F1 kanser hücrelerinin apoptozu tetiklemesi. MBP türetilmiş peptitler hücre döngüsü CDK etkili inhibitörleri olan, ancak, bunların nedeniyle metabolik ilaç olarak faydalı olması muhtemel değildiristikrarsızlık ve hücre geçirgenliğini genel eksikliği. Bu amaçla, CDK2 / siklin üzerinden bir inhibisyon deregüle E2F1 istismar anti-tümör tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla ilaç benzeri bileşikler içine bu güçlü peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için DEĞİŞTİR strateji uyguladık. Aşağıdaki protokol siklin oluğuna REPLACE uygulamasında tamamlanmıştır çalışmalarını özetlemektedir. İlk olarak, HAKRRLIF N-terminal tetrapeptid ilaç-benzeri başlık grubu değiştirmeleri tespit edilmiştir. Bundan başka, bu grupta gelişmeler DEĞİŞTİRME için ek bir doğrulama araştırıldı. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar Örnek sunulmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

Daha etkili protein-protein etkileşimleri (PPİ) hedef alınarak geliştirilmiş benzersiz bir strateji DEĞİŞTİRİN olduğunu. Bu potansiyel ilaç hedefleri çoğunluğunu temsil eden bu tür bağlayıcı siteler için inhibitörlerinin belirlenmesi ve hangi gelişmiş metodoloji sağlayarak mevcut ilaç hedef alanını genişletmeyi hedeflemektedir. Bu çalışmanın temel amacı, hesaplamalı ve sentetik kimya yaklaşımlarını içeren REPLACE strateji kullanımı ve uygulama metodolojik bakış sağlamaktır. Olmayan ATP rekabetçi sikline bağlı kinazlar (CDK) anti-tümör terapötik olarak inhibitörlerinin geliştirilmesi için uygulanması ile tarif edilmektedir değiştirin. CDKler sıklıkla kanser deregüle ve dolayısıyla ilaç gelişimi için önemli bir hedef olarak kabul edilir. S fazında CDK2 / siklin A inhibisyonu E2F1 yolu boyunca p53, bağımsız bir şekilde, kanser hücrelerinin seçici apoptosisi teşvik ettiği rapor edilmiştir. Siklin-bağlanma protein-protein etkileşimi hedefleyeng yiv (CBG) transkripsiyonel CDK&#39;lar fazla hücre döngüsünün spesifik önlenmesini sağlayacak bir yaklaşımdır. CBG CDK alt tabakalar ve tümör baskılayıcı proteinlerin türetilen bir uyuşum sekansı tarafından tanınan motifi (MBP) bağlanma siklin olarak adlandırılan. MBP önce ayrıca yeterli aktiviteyi (RRLIF) koruyarak bir pentapeptid kesiliyor sonra p21Waf (HAKRRIF) ve bir oktapeptidin için optimize edilmiştir. Geçirgen hücre değil, genel olarak peptitler, metabolik kararsız ve dolayısıyla strateji DEĞİŞTİR (Hesaplamalı Zenginleştirme aracılığıyla Kısmi Ligand Alternatifleri ile yedek) Daha fazla ilaç gibi inhibitörleri üretmek amacıyla uygulanmaktadır vardır. Strateji seçici hücre döngüsü CDK / siklin kompleksleri inhibe Fragment bağlandı inhibitör peptidler (çevirme) tasarımıyla başlar. Döndürür, tekrarlı N-ucuna (Ncaps) başlanarak küçük moleküller (başlık oluşturma grupları ile) gibi fragmanı ile HAKRRLIF / RRLIF kalıntılarını değiştirerek oluşturulan ilgili değiştirilmesi yoluyla elde edildiC-terminali. Bu bileşikler, anti-tümör terapötik olmayan ATP rekabetçi CDK inhibitörleri üretimi için başlangıç ​​noktası vardır.

Siklin yivli HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 de gösterilmiştir. Temel bağlama determinantları olarak temsil peptit tortuları başka kalıntılar küçük katkılar 12,13,18 sağlayan Ala2, ARG4, Leu6 ve Phe8 bulunmaktadır. Bu vaka çalışmasında DEĞİŞTİRİN strateji öncelikle Ala2 ve ARG4 etkileşimlerini taklit HAKRRLIF N-terminal tetrapeptidde kalıntılar için fragman alternatifler bulmak amacıyla kullanılmıştır. Potansiyel UKEP parçalarının (Tablo 1)</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Görüntüleme.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Video: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Biyoloji

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

NAFLD/NASH'in Sıçan Modelinde Ultrason ve Kesme Dalgası ElastografiSi Görüntüleme Uygulaması

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...