This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

NOT: Bu protokol tüm işlemler hayvanların etik tedavisi ve bakımı için kurallar Ulusal Enstitüsü göre yapılan ve onaylı IACUC hayvan kullanımı protokolüne göre edildi. 1. Hücre Hat Bakım <ol><li> RPMI-1640 ortamı içinde kültür BAF3 hücreleri,% 10 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin (100 ünite / ml ve 100 ug / ml) ile WEHI Hücrelerinin geçirilerek kültür ortamı desteklenmiştir. % 10 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücrelerin büyümesine (100 birim / ml ve 100 ug / ml). % 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de hücreler muhafaza edin. </li></ol> 2. Plasmid Yapı <ol><li> Fareyi JAK2 ve LR tarafından pMSCV-puro-GW onun onkojenik izoformu JAK2-V617F standart rekombinasyon klonlama prosedürü kullanılarak klonaz Clone. </li><li> Lusiferaz ekspresyon vektörü (pMSCV-Luc-Kiraz-GH) oluşturulması için in vi kullanılanvo görüntüleme kullanılır pENTR-Luc oluşturmak için pENTR SD-TOPO klonlama ile takip primerler (AP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC LUC SD / PR TTACAATTTGGACTTTCCG ve LUC SD /) kullanılarak PCR ile pLVX-Tet-ON vektöründen lusiferaz yükseltmek LR klonaz kullanılarak yeniden birleştirme aracılı klonlaması ile bir retroviral vektör, pMSCV Cherry-GW Lusiferaz geninin aktarmak için kullanılır. </li></ol> Rastgele Mutasyon Kütüphanesi 3. hazırlanması, Mutasyonlar Eleme ve belirlenmesi 3.1), rasgele mutajeniz <ol><li> JAK2 yabani tip ve ticari rekombinasyon klonlama teknolojisini kullanarak pMSCV-puro-GW retroviral vektörü içine V617F mutasyon Klon tam uzunlukta. </li><li> , Dönüştürmek için JAK2-V617F plazmid DNA 1 mikrogram kullanın XL-1 Kırmızı, E. böylece onları çoğaltma sırasında rastgele mutasyonlar dahil etmek izin DNA tamir mekanizmaları kusurlu coli hücreleri,. Daha özel olarak ise, 50 karıştırın - DNA, 100 ng, 10 ile (daha fazla DNA 100 ng transformasyon etkinliğini azaltır)0 önceden soğutulmuş polipropilen tüp içinde yetkin hücre ul ve yavaşça her 5 dakikada dönen, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Iyi bir kütüphane içerisinde için yetkin hücrelerin 4-6 tüpler kullanmaktadır. NOT: DNA 100&#39;den fazla ng dönüşüm verimliliği azaltır </li><li> 45 saniyelik bir ısı şoku 42 ° C &#39;de bir su banyosunda tüp daldırın ve 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Daha sonra, SOC ortamında 1 ml (% 2.0 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.05 NaCl, 10 mM MgCI2, 10 mM MgSO4 ve% 0.4, D-glukoz) ekleyin. 90 dakika boyunca 225-250 rpm&#39;de çalkalanırken 37 ° C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden dört adet 10 cm LB-agar plakaları üzerinde her tüp Plaka hücreleri. 37 ° C&#39;de 24 saat - 16 inkübe edin. </li><li> Görünür koloniler ardından, steril bir plaka kazıyıcı ile plakaları kazınarak onları toplamak. Ticari bir plazmid ekstre etme kiti kullanılarak her plaka ve izole plazmid DNA Havuz hücreleri. Genellikle koloniler küçük ve olmaya 18-24 saat sürebilir: NOTGörünür bu yavaş büyüyen bakteri suşları çünkü. Bu aşamada, örneğin Sau3A1 veya Taq1 ya da sekanslama Bir sık ​​kesici ile sınırlama sindirimi ile kütüphanede mutasyonlarının heterojen değerlendirmek. </li></ol> Retroviral süpernatanlarından ve İletim 3.2) üretimi <ol><li> Transfeksiyondan bir gün, levha% 10 FCS, penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin içeren DMEM içinde 100 cm&#39;lik kaplar üzerine 4 x 10 6 HEK 293T hücreleri önce. </li><li> Ertesi gün, orta yerine ve Mutagenezli pMSCV-JAK2-V617F kütüphanesi ile hücreleri transfect. Her biri 10 cm plaka için, serumsuz DMEM ortamı kullanılarak 400 ul toplam hacmine FuGENE 40 ul DNA 10 ug (plazmid kütüphanesi 5 ug ve retroviral paketleme plazmid 5 ug, pCLEco) karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika için DNA ve lipit karışımı inkübe edin. 20 dakika sonra HEK293T hücrelerin üzerine damla DNA lipit kompleksi damla ekleyin. </li><li> Altı saat sonra, transfeksiyon ortamı ağırlık değiştirmeki taze ortam virüs üretimi, 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile plakalar inkübasyon ve. Inkübasyondan 48 saat sonra, bir 0.45 um Acrodisc filtreden filtre viral süpernatanların toplanması. </li></ol> In Vitro dirençli klonlar, 3.3) Seçim <ol><li> Ilaca dirençli JAK2 V617F-mutantlar için, 0.5-1 x10 6 arasında bir viral titreye sahip bir virüs yüzer 100 ml 100,000,000 BAF3 hücrenin transduse edilmesi. Daha özel olarak ise,% 10 serum içeren RPMI ortamı kullanılarak, 300 ml lik bir toplam hacme kadar virüs yüzer, 100 ml ve polyberene 24 ug / ml (ployberene nihai konsantrasyon 8 mg / ml) ile 10 8 hücreleri karıştırın. Birden altı kuyu plakaları (4-5 ml başına iyi) Bu hücre mikserler dağıtın. </li><li> 25 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 1250 x g&#39;de plakaları santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, 24 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, hücreleri birlikte havuz ve Ruxolitinib ve orta yumuşak agar içeren karıştırın ve si kaplamax kuyu plakalar. Her bir ilaç konsantrasyonu için, bir 50 ml tüp içinde Ruxolitinib uygun miktarı ile transduse BAF3 hücreleri (10-20.000.000 hücre) 10 ml karıştırın. RPMI% 20 ​​serum içeren kullanarak 40 ml sesini olun. Altı yuvalı plakalar içinde mixcarefully, hücrelere% 1.2 agar ve 10 ml ilave edilir ve plaka. </li><li> Iki hafta boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 0.2 ml pipet uçları ve alt-kültür onlara 3-4 gün için ayrı ayrı 24 kuyu plakalar kullanılarak dirençli koloniler seçin. </li><li> Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ile dirençli BAF3 hücreleri hasat edilir. Ticari bir genomik DNA izolasyon kiti kullanılarak genomik DNA izole edin. PCR genomik DNA kullanılarak primerler (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG ve mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) ve yüksek sadakat PCR sistemleri genişletmek uzun şablonun 100 ng tam uzunlukta JAK2 cDNA yükseltmek. </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın. JAK2 kodlama çerçeveyi temsil eden DNA bandı 3.4 kb tüketim ve DNA izoleticari bir jel ekstre etme kiti kullanılarak. Sıra 8 iç astar (P1 - P8) kullanılarak cDNA tam uzunlukta ticari yazılımı kullanarak kodlama dizisini kapsayan ve analiz dizileri. </li></ol> Dayanıklı Mutasyonların 4. İn Vitro Doğrulama Birçok hücre klonları, direnç fenotipinin her mutasyonun katkısını test etmek şablon olarak pMSCV-JAK2V-617F plasmidi kullanılarak yer yönelimli mutagenezle seçilen türevlerini oluşturmak için birden fazla mutasyonu taşır. <ol><li> Ticari bir mutajenez kiti ve nokta mutasyonları oluşturmak için tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak pMSCV-JAK2 V617F-plazmid üzerinde yer yönelimli mutagenez yapın. Dizileme ile mutant klonların kimliklerini teyit edin. </li><li> Retrovirüsler ile BAF3 hücreleri nakletmek seçeneklerini 1 ug / ml puromisin ile takip mutant plazmitleri kullanılarak yapılan. </li><li> Levha 10 4 BAF3-JAK2 V617F-hücreleri, 96 gözlü bir plakanın her oyuğuna (% 10 FCS ile RPMI 50 ul). Ayrı37 ° C&#39;de 60 saat boyunca plakaları (0, 1, 3, 5, 10 ve 20 uM son konsantrasyon) ve inkübe ly plaka üzerinde çukurlara ruxolitinib içeren ortamda 50 ul ekle. </li><li> 2-4 saat boyunca 37 ° C&#39;de her bir oyuğa inkübasyon ile takip için, WST-1 reaktifi 10 ul eklenmesi ile hücre canlılığı değerlendirmek. Bir plaka okuyucu kullanarak A450 Tutanak emme. Üç nüsha ve arsa tüm tahlilleri gerçekleştirin INCB018424 konsantrasyonları karşı absorbans ortalama. Bir doğrusal olmayan eğri uydurma algoritması kullanarak en uygun sigmoid eğri gerçekleştirin. Hücresel IC50 olarak% 50 hücre canlılığı ile sonuçlanan ilaç konsantrasyonunu puan. </li><li> Daha sonra, ruxolitinib artan konsantrasyonlarda ve 37 ° C&#39;de 4-6 saat süreyle inkübe edildi,% 10 serum ihtiva eden RPMI ortamı içinde altı yuvalı plakalar JAK2 varyantlarını eksprese eden plaka altı milyon BAF3 hücreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de beş dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. 20 mM Tris-CI içinde hücreler, bir kez PBS ile zaman ve lize yıkayın (pH 7,5), 50mM NaCI,% 1 NP-40,% 0.1 SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM sodyum florit, 2 mM sodyum vanadat ve% 5 Gliserol proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörleri ile takviye edilmiştir. 5x jel yükleme tamponu (bunu takiben 1 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu sonikasyon 350 mM Tris-HCI [pH 6.8], 500 mM DTT,% 15 SDS, 10 mM benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM sodyum vanadat Protease kokteyl, 50% gliserol, ve 5-10 dakika boyunca 70 ° C &#39;de% 0.001 Bromofenol Mavi) ve denatürasyon. </li><li> Denatüre edici koşullar altında,% 8 SDS poliakrilamid jeli üzerinde proteinleri çözmek. Fare monoklonal anti-phopsho STAT5 ile immün yapın. Lekeleri Şerit ve tavşan poliklonal anti-SATA5 antikoru ile yeniden sondaj. Tedarikçinin tavsiyelerine göre ECL reaktifler kullanılarak bantları görselleştirmek. </li></ol> Vivo Doğrulama 5. <ol><li> Lusiferazı ve kiraz ifade BAF3 hücreleri nakletmek (pMSCV-Luc-cher yapılan retrovirüslere ile transdükJAK2 V617F-dirençli varyantları ifade virüs Ry GH). JAK2 ve direnci varyantlarının sentezlenmesi için puromisin seçimi hayatta hücreleri seçin. </li><li> Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla 6 Balb / C farelerine 200 ul PBS JAK2 V617F-ve dirençli varyantları taşıyan iki milyondan aktif olarak büyüyen BAF3-Luc / kiraz hücreleri enjekte edilir. </li><li> Hücre nakli üç gün sonra, iki hafta boyunca, günde iki kez Ruxolitinib (100 mg / kg) ile farelere enjekte edilir. </li><li> Bir görüntüleme sistemi ile lusiferaz tabanlı biyoışıldama görüntüleme yapın. . <ol><li> Kısaca, steril iyondan arındırılmış su, 300 mg 25 ml, daha küçük hacimlerde ve mağaza kısım çözülmesiyle lusiferin solüsyon hazırlanır. Not: -80 ° C&#39;de saklayın lusiferin ve kullanılana kadar ışıktan koruyunuz. </li><li> Her bir fare, 125 mg / kg, elde etmek için IP ve her bir farenin 250 ul enjekte edilir. Birlikte bir kapalı kutu inhale izofluran (% 1.5 -2.0%) kullanarak aynı gruptan fareler anestezi. Inci veteriner merhem sürüne göz kuruluğu önlemek için. NOT: fareler için alınan zaman uyku (10-15 dk) zirveye luciferin aktivitesini izin. Varyasyonu önlemek için gruplar arasında tutarlı bir süre tutun. </li></ol></li><li> Görüntüleme odası aşamasına derhal fareler aktarın ve görüntüleme işlemleri sırasında 1.5-2% isofluorane de anestezi korumak. Sıralı 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60 ve 300 saniye maruz görüntü fareler. Görüntü yakalamak ve görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanılarak biyoışıldama yoğunluğunu ölçmek. Görüntüleme kendi kafesine geri dönmek fareler ardından. </li><li> In vivo şimerizm hasat toplam Kemik iligi hücreleri için. Servikal dislokasyon ile takip 5 dakika için CO 2 ile fareler Euthanize. Kemikleri Hasat ve kemik iliği toplamak için soğuk PBS 4 ml ezmek. Floresan mikroskop altında yüzde kiraz pozitif hücreleri analiz ve FACS kullanarak ölçmek. Her örnekten yirmi bin olayları toplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Klinik nüks ve hedef gen ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması: KML tedavisinde Imatinib klinik başarısı küçük molekül inhibitörleri ile rouge kinazlar hedef potansiyelini, ancak hedeflenen tedavinin de ortaya sınırlamaları sadece gösterdi. Direnç mutasyonlarının tanımlanması daha iyi klinik yönetimi ve gelecek nesil inhibitörlerinin gelişimine yardımcı olur. Bu protokol, hedeflenmiş genin ilaca dirençli mutasyonları tespit etmek için bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem E....

Protein kinazlar, görünüşte her hücre fonksiyonunu modüle eden hücre içi sinyal iletim yollarında önemli bir düzenleyici enzimdir. Kinaz aracılı sinyalizasyon düzgün bir denetim çoğunlukla UPS tarafından kinazlar, fosfatazların ve bozulması uygun yönetmelik (Ubikutin proteazom sistemi) dayanır homeostaz ve gelişim için çok önemlidir. Kuralsız kinazlar birçok kanser merkezi aşamasında olan ve insan hastalıklarının 1 ev sahibi sorumlu. İnsan genomu ile doğrudan ya da dolaylı olarak bağlantılı olmuştur 500&#39;den protein kinazları için ~ 400 insan hastalıkları 2 kodlar. Bu gözlemler, küçük molekül inhibitörleri 3-5 kinaz terapötik hedefleme için düşüncesini desteklemiştir. Kronik miyeloid lösemi (KML) tedavisinde gibi Imatinib gibi ABL kinaz inhibitörlerinin, gösteri, bu yaklaşımın 6,7 konseptinin kanıtı sağlanmıştır. Bu gözlem sadece karınca devrimi-kinaz tedavi değil, aynı zamanda Miyeloproliferatif neoplazmlar (EMS) ile polisitemi vera (PV) ve hastaların JAK2&#39;nın onkojenik mutasyonlar keşfine yol terapötik hedefleme için diğer neoplastik hastalıklar, genetik lezyonların tespit etmek fikri zorlanan. Bu keşif, küçük molekül kinaz inhibitörleri ile JAK2 hedefleyerek MPNs tedavisinde büyük ilgi gördü. Şimdi, JAK2 inhibitörlerinin neredeyse bir düzine klinik çalışmalarda ve bunlardan bir tanesi myelofibrozis tedavisi için son onaylanmıştır. Kanserlerde küçük molekül inhibitörleri tarafından onkojenik kinaz spesifik hedefleme umut verici sonuçlar getirmek, aynı zamanda tedaviye direnç gelişmekte muzdarip. Aslında, bugüne kadar, hastalar çoğunlukla ilaç 8-10 hedefler için hangi kinaz etki mutasyonlar alarak böyle İmatinib, Gefitinib, Erlotinib ve Dasatinib gibi kinaz inhibitörleri, direnç mutasyonları geliştirdi tedavi. Gen mutasyonu sonucu direnç o sınırlamaları vurgulamaktadırf onkojenik kinazlara karşı monoterapi hedefli ve her zamankinden daha başarılı kanser kemoterapisi gelişiminde bir sonraki meydan temsil eder. Ilaç direncinin mekanik ve fonksiyonel sonuçları seçimi ve ilaç geliştirme için ücretsiz bileşiklerin tasarımı için bir gerekçe sunmalıdır. In vitro ekranlar ile tanımlanan mutasyonlar, hastalarda bulunanlar ile korelasyon yüksek derecede göstermiştir. Bu nedenle, klinik nüks neden muhtemeldir direnç kalıplarını belirlemede klinik veya preklinik kalkınma asist belirli bir ilaç hedef çiftleri için ilaç direnç kazandıran mutasyonlar in vitro tarama. Bu mutant formlarının tanımlanması sadece ilaç tepkisi ve nüksetme ama daha güçlü yeni nesil inhibitörlerinin tasarımı için de gereklidir için hastaların izlenmesinde yararlı olacaktır. Örneğin, yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri, nilotinib ve Ponatinib gelişmesi için, çünkü daha mec mümkün olmuşturhanistic anlayış mutagenez, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar elde. Daha önce, biz böyle Imatinib 11,12, PD166326 12, ve AP24163 13 gibi inhibitörleri direnç kazandıran mutasyonlar spektrumunu ortaya çıkarmak için BCR / ABL rastgele mutajenezini kullanarak ekranın sonuçlarını bildirmişlerdir. Sonuçlar sadece klinik direnç ve hastalık nüksü veren mutasyonları tespit değil, aynı zamanda ilaç direnci ve kinaz fonksiyonunu 11,14 yöneten ilkeler mekanik anlayış sağladı. İşte bu tarama stratejisinin daha geniş bir uygulama sağlamak için, bir ilaç hedef çifti olarak Ruxolitinib ve JAK2 kullanarak, ek metodolojik ayrıntı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Cell and Tissue culture&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>A gift from Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml stock in water</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 micron disc filter</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 micron nylon cell strainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml stock solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood&amp;amp; tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expand long template PCR system</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Sv gel and PCR clean up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield plasmid mini prep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &amp;amp; OmniMAX 2 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;nbsp; LR Clonase Enzyme mix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&amp;nbsp;</td><td>60316 and 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 automated cell counter</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td></tr></tbody></table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

Kronik miyeloid lösemi (KML) bir sürücü onkogen olarak BCR / ABL keşif aslında, etkin bir KML hastaları tedavi ile kanserlerde kinaz hedefleyen potansiyelini gösterdi, Imatinib, geliştirme sonuçlandı. Bu gözlem gibi EGFR, B-RAF, KIT ve PDGFRs, gibi çeşitli diğer maligniteler, karıştığı onkojenik kinazlar hedef ilaç geliştirme devrim. Ancak, anti-kinaz tedavilerin bir büyük dezavantajı hedef render ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması azalır veya ilaç için afinite kaybetmiş olmaktır. Gelecek nesil inhibitörleri gelişmekte yardımcı olur, aynı zamanda kişiselleştirilmiş ilaç kullanarak klinik yönetimi ivme verir sadece dirençli varyantları tarafından istihdam mekanizmaların anlaşılması. Biz yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri gelişmekte yardımcı oldu BCR / ABL, mutasyonlar veren direnç spektrumunu belirlemek için bir retroviral vektör tabanlı tarama stratejisi bildirdi. Ruxoli kullanılmasıBir ilaç hedef çifti olarak tinib ve JAK2, burada JAK2 kinaz rastgele mutasyon kütüphane ifade fare BAF3 hücrelerini kullanan in vitro tarama yöntemleri açıklar.

Genetik mutasyonların ortaya çıkması hedeflenen anti-kinaz tedavisi için büyük sorun teşkil etmektedir. Mutasyon çalışmaları, seçimi ve yeni nesil ilaç geliştirme tasarım vesile olan mekanik ve fonksiyonel anlayışlar sağlamanın yanı sıra, aynı zamanda daha iyi klinik yönetimi sağlar ve gelecekte kişiselleştirilmiş tedavi için daha yararlı olabilir. Bu deneyde, JAK2 V617F-kinaz ruxolitinib direnç mutasyonları (Şekil 1) için tarama göstermektedir. Biz pMSCV-Kiraz-GW içi...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar. 

Video: A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Biyokimya

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates approaching 85% are common. Unfortunately, patients often become refractory to the treatment by altering their signal transduction pathways. An implementation of the expression profiling with microarrays can identify the overall mRNA-level changes, and proteomics can identify the overall changes in protein levels or can identify the proteins involved, but the activity of the signal transduction pathways can only be established by interrogating post-translational modifications of the proteins. As a result, the ability to identify whether a drug treatment is successful or whether resistance arose, or the ability to characterize any alterations in the signaling pathways, is an important clinical challenge. Here, we provide a detailed explanation of antibody arrays as a tool which can identify system-wide alterations in various post-translational modifications (e.g., phosphorylation). One of the advantages of using antibody arrays includes their accessibility (an array does not require either an expert in proteomics or costly equipment) and speed. The availability of arrays targeting a combination of post-translational modifications is the primary limitation. In addition, unbiased approaches (phosphoproteomics) may be more suitable for the novel discovery, whereas antibody arrays are ideal for the most widely characterized targets.

Here, we present a protocol for antibody arrays to identify alterations in signaling pathways in various cellular models. These changes, caused by drugs/hypoxia/ultra-violet light/radiation, or by overexpression/downregulation/knockouts, are important for various disease models and can indicate whether a therapy will be effective or can identify mechanisms of drugs resistance.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Kanser Araştırmaları

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Tıp

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biyoloji

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler