NAPPA, protein aktivitesi ve fonksiyonunun tarafsız bir şekilde incelenmesinde kullanılabilen güçlü bir protein mikrodizi platformudur. NAPPA'da görüntülenen proteinler, doğal katlama ve aktivite olasılığını artırmak için insan kaynaklı ribozomlar ve şaperonlar kullanılarak insan temelli bir ifade sisteminde üretilir. Kiaz inhibitörlerinin taranması için NAPPA dizilerinin kullanılması, yeni ilaçların ve klinik olarak ilgili kiazla mutasyonlarının test intesti için yeni bir platform sağlamaktadır.
NAPPA metodolojisi tarafından üretilen protein mikrodizileri biyomarker keşfi, protein-protein etkileşimleri, substrat tanımlama ve ilaç taraması gibi birçok farklı uygulama için kullanılabilir. Yol boyunca kalite kontrol adımlarını gerçekleştirin. DNA hazırlığınızın kalitesini, DNA mikrodizisini ve protein mikrodizisini test edin.
Herhangi bir adımda kalite iyi değilse, sadece baştan başlayın. Prosedürü gösteren Lisa Miller, laboratuvarımda teknisyen olacak. Evde yüksek iş sahibi mini-hazırlık için bakteri büyüme hazırlamak için, ilk 96 iyi formatında burgu plaka bakteri aşılamak, ve 16 saat boyunca büyümesini sağlar.
Ertesi gün, antikor ampisilin ile desteklenen müthiş suyu orta 1.5 mililitre ile derin kuyu plaka her kuyu doldurun. Antikor plazmid üzerinde seçim işareti bağlıdır. Daha sonra, %80 etanol ve alev içeren 96 iğneli bir cihazı sterilize edin.
Steril 96 iğneli cihazı kullanarak bir gecede kuluçkaya yatan agar plakasından kolonileri seçin ve kültürü aşılamak için derin kuyu plakasının kuyularına daldırın. Bir gaz geçirilebilir mühür ile blok kapak ve 37 santigrat derece 22 ila 24 saat ve 300-800 rpm bir shaker inkübat. Bundan sonra, pelet kültürleri ve el yazmasına göre kültürleri yeniden askıya.
Lyse bakterilerher kuyuya 200 mikrolitre çözelti iki ekleyerek, plakayı alüminyum bir mühürle kapatın ve beş kez ters çevirin. Hücreleri tam beş dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi nötralize etmek için, 200 mikrolitre çözelti üç ekleyin, plakayı alüminyum bir contayla kapatın ve beş kez ters çevirin.
Sonra, 3800 G, dört santigrat derece, 30 dakika lysate supernatant temizlemek için plaka spin. Aniyon değişimi reisin plakaları hazırlamak için, ilk olarak, aniyon değişimi bulamaç karıştırın ve bir cam yalak içine bulamaç dökün. Bir atık toplama kabı olarak hareket etmek için derin bir kuyu plaka üstüne yığın filtre plakaları.
Daha sonra, geniş kart P1000 ipuçları nı kullanarak bulamacı karıştırın ve 450 mikrolitre bulamaç filtre plakalarının her kuyusuna aktarın. Santrifüj ve akış atmak. Şimdi, lysate supernatants reçine plaka ve derin kuyu blok yığınına aktarın.
Yığılmış plakaları 30 kez G'de beş dakika boyunca döndürün ve akış hızını artırın. Sütunu yıkamak için, her kuyuya 400 mikrolitre n3 yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponu kaldırmak için vakum manifoldu için reçine plaka aktarın.
Yıkama adımını üç kez tekrarlayın ve dna'yı eşerek 30 kez kısa bir beş dakikalık dönüşle kalan yıkama tamponunu çıkarın G.To, reçin plakayı temiz bir 800 mikrolitrelik toplama plakasının üzerine yerleştirin. Her kuyuya 300 mikrolitre n5 çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika oturmasına izin verin. Daha sonra, yığılmış plakaları 20 kez G'de beş dakika döndürün ve bir dakika boyunca 233 kat A.C.'ye kadar yavaş bir hız alayın.
Plakaları kullanmadan önce negatif 20 derecede saklayın. İlk olarak, slaytları bir rafa yerleştirin ve asetonda %2 aminosilane reaktifinin kaplama çözeltisini içeren cam haznesine kaydırakları batırın. Slaytları 15 dakika sallayın.
Daha sonra, aseton slaytlar durulayın suda son bir durulama takip. Daha sonra, basınçlı hava kullanarak slaytlar kuru. Tüm su damlacıkları kaldırılana kadar yaklaşık üç dakika boyunca tüm açılardan üzerlerine üfleme.
Kaplanmış slaytları oda sıcaklığında sıkıca kapatılmış bir kutunun içinde metal bir rafta saklayın. Şimdi, el yazmasında açıklandığı gibi DNA'yı çökeltmeye devam edin. Daha sonra, ultrasaf su 20 mikrolitre DNA pelet yeniden askıya ve iki saat boyunca 1000 rpm sallayın.
Dizi örneğini hazırlamak için, her DNA örneğine antikor, çapraz bağlantı ve polilizin içeren 10 mikrolitre taze hazırlanmış baskı karışımı ekleyin. Alüminyum folyo ile mühür plakaları ve 1000 rpm 90 dakika oda sıcaklığında sallayın. Plakaları bir gecede dört santigrat derecede saklayın.
Baskı gününde, kısa bir süre girdap ve plakaları spin. Her numunenin 28 mikrolitresini 384 kuyu plakasına aktarın. Aminosilane kaplı slaytları ve 384 kuyu plakasını arrayer güverteye yerleştirin ve mikrodizi baskı programını başlatın.
Baskı bittiğinde, mikrodizileri etiketle. Mikrodiziler daha fazla kullanıma kadar aylarca saklanabilir. DNA düzeylerini ölçmek için, slaytları bir pipet kutusuna yerleştirin ve 50 mililitre engelleme tamponuyla engelleyin.
Bir saat boyunca oda sıcaklığında sallanan bir shaker üzerinde slaytlar kuluçka. Daha sonra, çözeltiyi atın ve 20 mililitre engelleme tamponu ve 33 mikrolitre floresan DNA intercalating boya ekleyin. Ajitasyonla 15 dakika kuluçkaya yat.
Kuluçka bittikten sonra, hızlı bir şekilde ultra saf su ile slaytlar durulayın ve basınçlı hava ile kuru. Mikrodiziler taranmaya hazır. Mikro dizileri ifade etmek için, slaytları daha önce gösterildiği gibi engelleyin ve ultra saf suyla durulayın ve filtrelenmiş basınçlı havaile kurulayın.
Her slayta bir sızdırmazlık contası takın. Slaytlar üzerine in vitro transkripsiyon ve çeviri karışımı 130 mililitre ekleyin ve yavaşça in vitro transkripsiyon ve çeviri karışımı yayılır ve herhangi bir kabarcıklar olmadan dizi tüm alanı kapsar böylece sızdırmazlık contaları masaj. Küçük yuvarlak bağlantı noktası contalarını her iki bağlantı noktasına da uygulayın.
Protein ekspresyonu için 30 derecede 90 dakika kuluçka, sorgu proteininin immobilizasyonu için 15 santigrat derecede 30 dakika. Daha sonra, conta çıkarın, beş dakika her 15 mililitre TBST süt ile slaytlar üç kez yıkayın ve bir saat boyunca aynı çözelti de blok. Dizideki proteinlerin tespiti için, TBST'yi sütle birlikte çıkarın, slaytları ızgara plakasına yerleştirin ve 600 mikrolitre birincil antikor, fare anti-Flag, seyreltilmiş 1-200 mikrolitre ve %5 sütle desteklenen 1x TBST uygulayın.
Oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yat. Slaytları 50 mililitre 1x TBST ve sallanan shaker üzerinde %5 süt ile beşer dakika boyunca üç kez yıkayın. İkincil antikor için prosedürü tekrarlayın.
Bir saat kuluçka bittikten sonra, beş dakika her biri için sallanan shaker üç kez 1x TBST ile slaytlar yıkayın. Daha sonra, hızlı bir şekilde ultra saf su ile slaytlar durulayın ve basınçlı hava kullanarak kuru. Slaytlar taranmaya hazır.
Fosfataz ve DNase tedavisini gerçekleştirmek için, ifade edilen slaytları TBST ile yıkayın ve bloke edin ve el yazmasında açıklandığı gibi %3 BSA ile tamamlanır. Daha sonra, bir ızgara plaka üzerine slaytlar yerleştirin ve fosfataz DNase çözeltisi 200 mikrolitre uygulayın. Buharlaşmayı önlemek için üzerine bir mikrodizi kapak fişi yerleştirin.
Fırında bir saat 30 dakika boyunca 30 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 1x TBST ve 0.2 molar sodyum klorür ile kayan shaker üzerinde beş dakika her üç kez slaytlar yıkayın. İlaç tedavisi ve kinaaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, ızgara plaka üzerinde slaytlar yerleştirin ve ilaç kiaz çözeltisi 200 mikrolitre uygulayın.
Buharlaşmayı önlemek için üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Fırında 30 derecede bir saat kuluçkaya yat. Tekrarlanabilir verilerin anahtarı, slaytlar arasında tutarlı kuluçka süresidir.
Bu özellikle kizaz reaksiyonu sırasında önemlidir. Her slayt işlemek için gereken süre hesaba katılmalıdır. Bundan sonra, 1x TBST ve 0.2 molar sodyum klorür ile kayan shaker üzerinde beş dakika her üç kez slaytlar yıkayın.
Primer antikor fosfotirozin antikor olarak kullanarak tekrar protein tespiti TBST'de 1 ila 100 seyreltilmiş, %3 büyükbaş serum albuminile desteklenmiştir. Primer antikor ile kuluçka sonrası yıkama kıvrak için 1x TBST ve %3 büyükbaş serum albumin, sekonder antikorlu kuluçka sonrası yıkıntılar için TBST kullanın. Daha önce olduğu gibi yıkayın ve kurulayın.
Görüntü edinimi için, mikrodizileri slayt tutucu dergisine yükleyin. Dergiyi mikrodizi tarayıcısına yükleyin. Optimize edilmiş ayarlarla tüm mikro dizileri tarayıp, denemeler arasında görüntüleri karşılaştırırken otomatik kazancı kapatmayı unutmayın.
Görüntüleri bir niceliklendirme yazılımına aktarın, ızgarayı noktalarla hizalayın ve mikrodizideki her bir özelliğin sinyal yoğunluğunu ölçün. İstatistiksel analize devam edin. Bu çalışmada, mikrodizi tamamlayıcı DNA içeren lekelerin çoğunluğu başarıyla protein tespit edilebilir düzeyde gösterdi gösterdi.
NAPPA kiazaz mikrodizileri slaytlar arasında iyi tekrarlanabilirlik gösterdi, 0.88'den yüksek farklı baskı gruplar arasında protein görüntüleme düzeylerikorelasyon ile. NAPPA kilaz dizilerindeki kizaz aktivitesinin temsili sonuçları ekspresyon sonrası yüksek düzeyde protein fosforilasyon gösterdi. Fosforilasyon düzeylerinin fosfataz tedavisinden hemen sonra ve 60 dakikalık otofosforilasyon reaksiyonundan sonra ölçüldüğü mikrodiziler arasındaki karşılaştırma, dizide aktif protein kinazlarının varlığını göstermektedir.
NAPPA kinaz dizilerinde, imatinib ABL1 ve BCR-ABL1 aktivitesinde önemli bir azalma gösterirken, diğer kinazlar çoğunlukla etkilenmedi. Kiyaz aktivitesi defosforiled dizi karşı normalleştirilmiş ve pozitif kontrol mikrodizi bir yüzdesi olarak temsil ABL1 ve BCR-ABL1 doğru imatinib selektif inhibisyonu gösterdi. Ibrutinib taraması için elde edilen tipik sonuçlar, ABL1 ile ilgili olmayan kiyazın kiyaz aktivitesinin etkilenmediğini gösterdi.
BTK kanonik hedef ve ERBB4 potansiyel yeni hedef, ibrutinib varlığında azaltılmış aktivite gösterdi. Veriler ERBB4'ün doza özgü bir şekilde ibrutinib tarafından inhibe edilebilmiş olabileceğini göstermektedir. Protein mikrodizi taramalarının başarısı, mikrodizinin kalitesine son derece bağlıdır.
Uygun veri analizine izin vermek için birkaç pozitif ve negatif kontrol özelliği kullanılmalıdır. NAPPA kinaaz tahlil bir tarama platformudur ve bu nedenle elde edilen veriler in vitro kinap tahlilleri veya hücre bazlı tahliller içerebilir takip tahlilleri, doğrulanmalıdır. Protokolümüz cDNA ile başladığı için, herhangi bir kinaz mutasyonu veya varyasyonu mikrodiziye kolayca dahil edilebilir ve yüksek iş elde etme de incelenebilir.
Aniyon değişimi rezorbül ve plakaların hazırlanması sırasında, rezorn partiküllerinin olası teneffüs önlemek için maskekullanılması tavsiye edilir.
