K.M.R, S.D.M, M.U. ve D.L.D, Promega Corporation'ın tüm çalışanlarıdır.

1. HiBiT CRISPR ile uç nokta bozunma çalışmaları, isteğe bağlı hücre canlılığı floresan analizi ile litik formattaki proteinleri hedefler
<ol><li>Memeli yapışkan veya süspansiyon hücre hattının hazırlanması ve kaplanması<ol><li>Pasaj ve hücre büyümesi için kullanılan uygun hücre ortamında seyreltme ile hücre yoğunluğunu 2,22 x 105/mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Hücreleri, deney ve kontrol koşulu başına en az 3 kuyucuklu plakalara dağıtın. Hücre süspansiyonunun kuyusu başına 90 μL (20.000 hücre) 96 delikli beyaz plakalara dağıtın. 384 delikli format için, hücre süspansiyonunun kuyusu başına 36 μL (8.000 hücre) 384 delikli beyaz plakalara dağıtın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşiklerin hazırlanması ve eklenmesi<ol><li>Seri olarak seyreltilmiş PROTAC veya degrader test bileşiği plakalarını% 100 DMSO'da 1.000x nihai konsantrasyonda hazırlayın. Daha sonra hücre kültürü ortamında 10x nihai konsantrasyona seyreltin. Bileşiksiz DMSO kontrolü olarak kullanılmak üzere ortama eşit hacimde DMSO ekleyin.</li>
		<li>96 kuyucuklu format için 90 μL hücreye 10 μL 10x bileşik ve kontrol solüsyonları ekleyin. 384 kuyucuklu format için 36 μL hücreye 4 μL 10x bileşik ve kontrol solüsyonu ekleyin.</li>
		<li>Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de istenen süre boyunca veya büyümeleri için en uygun koşullarda inkübe edin. NOT: Bu bir uç nokta testi olduğundan, birden fazla zaman noktasının test edilmesi, yukarıdaki adım 1.1.2'de açıklandığı gibi, her zaman noktası için ayrı bozunma plakalarının hazırlanmasını gerektirecektir. Bileşik aracılı bozunmayı tespit etmek için kuluçka süreleri oldukça değişkendir ve muhtemelen bileşik konsantrasyonuna da bağlıdır. Önerilen başlangıç zaman noktaları 6 saat ve 24 saat olacaktır.</li>
		<li>İsteğe bağlı hücre canlılığı ölçümü olmadan uç nokta ışıldayan algılamasını ölçüyorsanız, doğrudan aşağıdaki adım 1.3'e geçin. Hücre canlılığı ölçümü ile çoklama yapıyorsanız, aşağıdaki bir sonraki bölüm 1.4'e geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücrelerin litik ölçümü<ol><li>HiBiT litik ölçümlerinden hemen önce, litik tamponun her 1 mL'si başına 20 μL litik substrat ve 10 μL LgBiT proteini ekleyerek 2x litik algılama reaktifi hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere test edilecek kuyu sayısı için yeterli sayıda 2x algılama reaktifi hazırlayın (yani, kuyu sayısı +% 10).</li>
		<li>Hücrelere hazırlanmış litik tespit reaktifi ekleyin. 96 kuyucuklu format için, 100 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 100 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 40 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 40 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. Plakayı bir mikro plakalı vorteks karıştırıcı üzerinde 350 rpm'de 10-20 dakika boyunca karıştırın.</li>
		<li>96 veya 384 kuyucuklu bir plakadaki lüminesansı okuyabilen bir luminometre üzerinde lüminesansı ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>İsteğe bağlı hücre canlılığı çoklaması NOT: Bu adım, piyasada satılan bir CellTiter-Fluor (CTF) kiti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz.<ol><li>İstenilen son nokta ölçümünden 30-40 dakika önce, tahlil Tamponunun 2 mL'sine 10 μL substrat ekleyerek 6x hücre canlılığı algılama reaktif çözeltisi hazırlayın. Pipetleme hatası için ekstra hacim de dahil olmak üzere test edilecek her kuyu için yeterli 6x reaktif hazırlayın (yani, kuyu sayısı +% 10).</li>
		<li>Hazırlanan reaktifi kuyucuklara ekleyin. 96 delikli format için, zaten 100 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 20 μL 6x reaktif ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 40 μL hücre içeren her bir kuyucuğa 8 μL 6x reaktif ekleyin. Bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında kısaca karıştırın, ardından plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>İstenilen ölçüm bitiş noktasında (yani, 6 veya 24 saat işlem sonrası, adım 1.2.3), floresanı (380-400nmEx / 505nmEm) 96 veya 384 kuyu formatında okuyabilen bir cihazda floresan ölçün.</li>
		<li>1 mL litik tampon başına 20 μL litik substrat ve 10 μL LgBiT proteini ekleyerek 2x litik tespit reaktifi hazırlayın. Pipetleme hatasını hesaba katmak için ekstra hacim de dahil olmak üzere, test edilecek kuyu sayısı için yeterli sayıda 2x algılama reaktifi hazırlayın (örneğin, kuyu sayısı + %10).</li>
		<li>Hazırlanan litik tespit reaktifini kuyucuklara ekleyin. 96 kuyucuklu format için, zaten 120 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 120 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, zaten 48 μL hacim içeren her bir kuyucuğa 48 μL 2x litik algılama reaktifi ekleyin. Plakayı bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında 10-20 dakika karıştırın.</li>
		<li>96 veya 384 kuyu plakalarındaki lüminesansı okuyabilen bir luminometre üzerinde lüminesansı ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Bozunma ve hücre canlılığının ölçülmesi<ol><li>Ölçülen zaman noktasında DMSO kontrolünden gelen göreceli ışık birimlerinin (RLU) ortalaması. Bu değeri, aynı anda test edilen diğer tüm tedavileri normalleştirerek fraksiyonel bozulmayı hesaplamak için hedefin temel protein seviyesi olarak kullanın. Örneğin, 6 saatte DMSO kontrol kuyuları için ortalama RLU 10.000 ve 6 saatte belirli bir bileşik işlem için RLU 5.000 ise, fraksiyonel bozulma 5.000 ÷ 10.000 = 0.5 olarak hesaplanacaktır (Denklem 1). Denklem 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Fraksiyonel RLU'dan yüzde bozulmasını belirleyin: Denklem 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Bileşiklerin aktivitesini sıralamak için belirli zaman noktalarında fraksiyonel RLU veya % bozunmayı çizin.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak, tüm tedavilerden elde edilen değerleri DMSO kontrolüyle karşılaştırarak hücre canlılığı testi ölçümü için göreceli floresan birimi (RFU) verilerini analiz edin. DMSO kontrolüne göre herhangi bir tedavi için RFU'da önemli bir düşüş gözlenirse, bozulma verileri, hücre canlılığındaki kayıplara göre protein seviyesindeki değişiklikleri belirlemek için hücre canlılığı testi verilerine ek olarak normalleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HiBiT CRISPR hedef proteinlerinin gerçek zamanlı kinetik bozunması ve isteğe bağlı hücre canlılığı lüminesans testi
NOT: Kinetik tarama ve bozunma yapabilme yeteneği, hücrede daha önce 18,19,63 olarak tanımlanan LgBiT protein ko-ekspresyonunu gerektirir. Bu, bir LgBiT vektörünün geçici transfeksiyonu, BacMam LgBiT kullanımı veya bir LgBiT kararlı hücre hattına HiBiT CRISPR yerleştirme işlemi gerçekleştirilerek elde edilebilir.
<ol><li>Yapışkan hücre hatlarının kaplanması.<ol><li>Aspirasyonla hücre şişesinden ortamı çıkarın, hücreleri DPBS ile yıkayın,% 0.05 tripsin-EDTA ile hücreleri ayırın ve hücrelerin şişe tabanından ayrışmasına izin verin. Süspansiyon hücresi hatları için bölüm 2.2'ye geçin.</li>
		<li>Serum içeren hücre kültürü ortamını kullanarak tripsini nötralize edin, hücreleri toplamak ve yeniden askıya almak için karıştırın ve hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 125 x g'de döndürün. Hücre kültürü ortamını atın ve eşit hacimde taze hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>Deney ve kontrol koşulu başına en az üçlü kuyucuklara sahip tahlil plakalarına plaka hücreleri. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için 96 kuyucuklu format sayımı için, yoğunluğu tahlil ortamında 2 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın ve 96 delikli bir plakada kuyucuk başına 100 μL (20.000 hücre) dağıtın. Hücre yoğunluğunu tahmin etmek üzere 384 kuyucuklu format sayımı için, tahlil ortamında yoğunluğu 4,44 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın ve kuyucuk başına 18 μL (8.000 hücre) dağıtın.</li>
		<li>Plakaları 37 °C'de, gece boyunca% 5 CO2'de veya büyümeleri için en uygun koşullarda inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Süspansiyon hücrelerinin kaplanması<ol><li>%10 FBS ve 1x Endurazin (stok reaktifinin 1:100 seyreltilmesi) ile desteklenmiş CO 2'den bağımsız ortamda hücre yoğunluğunu2,22 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Plaka hücreleri, deney ve kontrol koşulu başına en az 3 kuyucuklu tahlil plakalarına dönüştürür. 96 kuyucuklu format için kuyu başına 90 μL (20.000 hücre) dağıtın. 384 kuyucuklu format için kuyu başına 36 μL (8.000 hücre) dağıtın. NOT: Arka plana (S:B) düşük sinyalli (S:B) lüminesansı olan süspansiyon hücre hatları için, örneğin klonlar yerine CRISPR havuzlarıyla çalışırken, kaplanan hücre sayısını, 96 kuyucuklu formatta 100.000 hücreye/kuyuya veya 384 kuyucuklu biçimde 40.000 hücreye/kuyuya kadar artırarak lüminesansı artırmak mümkündür.</li>
	</ol></li>
	<li>LgBiT'yi eksprese eden HiBiT CRISPR hücrelerini kullanarak kinetik bozunma testleri<ol><li>2.2.'deki kaplama adımına dahil edilen Endurazin içeren süspansiyon hücreleri için, doğrudan adım 2.3.3'e geçin. Yapışkan hücre hatları için Nano-Glo Endurazin çözeltisi hazırlayın. 96 kuyucuklu format için, stok reaktifi 1:100'ü% 10 FBS ile desteklenmiş CO2'den bağımsız ortama seyrelterek 1x Endurazine çözeltisi hazırlayın. 384 kuyucuklu format için, stok reaktifi 1:50'yi% 10 FBS ile desteklenmiş CO 2'den bağımsız ortama seyrelterek2x Endurazine çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Endurazin çözeltisini yapışkan hücrelerin her bir kuyucuğuna ekleyin. 96 delikli format için aspirasyon ortamı ve 90 μL 1x Endurazin çözeltisi ekleyin. 384 kuyucuklu format için, 18 μL hücreye 18 μL 2x Endurazin çözeltisi ekleyin. Bozunma testi, 384 delikli formatta 50:50 kültür ortamı ve CO2 bağımsız ortam karışımında gerçekleştirildiği için ortamı aspire etmeyin.</li>
		<li>Lüminesansın dengelenmesini sağlamak için bir inkübatörde 2,5 saat boyunca Endurazin içeren süspansiyonu veya yapışkan hücre plakalarını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
		<li>CO2'den bağımsız ortamda 10x konsantrasyonda test PROTAC titrasyonu hazırlayın ve 96 delikli plakanın her bir haznesine 10 μL veya 384 delikli plaka için 4 μL ekleyin. Etkinliği bilinmeyen bileşikler için, başlangıç noktası olarak en yüksek noktada 1-10 μM'lik bir son konsantrasyon önerilir.</li>
		<li>0-48 saat arasında bir süre boyunca 37 ° C'ye önceden dengelenmiş luminometrede kinetik lüminesans ölçümlerini toplayın. Ölçümün zaman artışları her deney için özelleştirilebilir, ancak önerilen bir ilk deney, 24 saat boyunca her 5-15 dakikada bir veya istenen miktarda lüminesans ölçümleri olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Son kinetik ölçümden sonra opsiyonel hücre canlılığı aynı kuyucuklu multipleks analizi NOT: Bu tahlil, piyasada satılan bir CellTiter-Glo (CTG) kiti ile gerçekleştirilir (bkz.<ol><li>CTG reaktifini oda sıcaklığına dengeleyin.</li>
		<li>Kinetik analizin son zaman noktasında bozunma ölçümünü takiben, plakanın kuyucuğu başına 100 μL (96 delikli plaka) veya 40 μL (384 kuyucuklu plaka) ilave edin ve 5 dakika boyunca 500-700 rpm'de (96 delikli plaka) bir plaka çalkalayıcıda veya bir mikroplaka vorteks karıştırıcısında (384 delikli plaka) karıştırın.</li>
		<li>Hücre lizisine ve HiBiT sinyalinin söndürülmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Üreticinin tavsiyesine uyarak bir luminometredeki toplam parlaklığı ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Kinetik bozunma profillerinin nicelleştirilmesi<ol><li>Toplanan kinetik lüminesans ölçümlerini kullanarak, zaman içinde serbest furimazin konsantrasyonundaki değişiklikleri hesaba katmak için her bir PROTAC konsantrasyonu için ham RLU'ları her zaman noktasında replika ortalaması DMSO koşuluna normalleştirin. Denklem 1'i kullanarak Kesirli RLU'yu hesaplayın. Denklem 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Bozunma eğrilerinden, Denklem 2'yi kullanarak tek bileşenli üstel bozunma modelini, her eğrinin ilk bozunma kısmına, verilerin bir platoya ulaştığı noktaya kadar sığdırın. NOT: Bozulma gözlenmeden önce kısa bir gecikme olabileceğinden, ilk birkaç veri noktasını sığdırmanın dışında tutmak yararlı olabilir. Denklem 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Denklem 2'den, bozulma hızı sabitini temsil eden ƛ parametresini ve kalan en düşük protein miktarını temsil eden Plato parametresini belirleyin.</li>
		<li>Parçalanan proteinin maksimum fraksiyonel miktarı olan ve 1-Plato olarak hesaplanan Dmax'ı hesaplayın.</li>
		<li>Zamandan bağımsız bir bozunma potens eğrisi belirlemek için her bir PROTAC konsantrasyonu için Dmax'ı çizin.</li>
		<li>Bileşiklerin etkinliğini analiz etmek için 2.3.5'teki arsa için Dmax50 değerini belirleyin. NOT: Belirli bir zaman noktasında bir DC50 belirlemek için, seçilen zamanda her konsantrasyon için hesaplanan yüzde bozunmasını çizin. Bu, DC 50 t=4 h veya DC50 t=12 h olarak belirtilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation, HiBiT ve NanoLuc teknolojilerinin ve uygulamalarının patentlerinin atanmasıyla ticari sahibidir.

Burada, ekstrem bileşik aktivitesini sonlanım noktası litik formatında veya canlı hücre kinetik modunda taramak için iki yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşımlar aynı ışıldayan ölçüm prensiplerine dayanır, ancak farklı ayrıntı ve anlayış seviyeleri sağlar. Her iki yaklaşımın seçimi de muhtemelen tarama hedeflerine ve bileşik kütüphanenin boyutuna bağlı olacaktır. Büyük bileşik tarama güverteleri veya birincil eleklerin tespit edilebilir herhangi bir bozulmayı gözlemlemesi için, uç nokta litik tarama, batı lekesi veya kütle spektrometresi gibi diğer uç nokta yaklaşımlarının pratik olmadığı veya uyarlanmasının zor olabileceği hassas ve verimli yüksek verimli uyumluluk sunar14. Bu ekranlar için bir başlangıç noktası, sınırlı sayıda konsantrasyon ve zaman noktası ile gerçekleştirilebilir. Test etmek için önerilen başlangıç konsantrasyonları, düşük potansiyele, zayıf geçirgenliğe sahip veya bazı durumlarda yüksek etkili bileşiklere sahip ilk bozundurucuları hesaba katmak için 100 nM-10 μM aralığındadır. Ayrıca, 4-6 saatte erken başlangıçlı bozunmayı ve 18-24 saatte gizli veya sürekli bozulmayı sağlamak için en az iki farklı zaman noktasının test edilmesi önerilir. Yüksek bozunma potansiyeli ve hedef üzerinde mekanizma sergileyen bileşikler 4-6 saatlik bir zaman diliminde kolayca gözlenirken, sadece daha sonraki zaman noktalarında gözlenen bozulma veya görünür protein kaybı çeşitli mekanizmalardan kaynaklanabilir. Hücre canlılığının hem erken hem de geç zaman noktalarında izlenmesi şiddetle tavsiye edilir, böylece protein kaybı hücre ölümüne bağlı kayıptan ayrılabilir. Herhangi bir ışıldayan veya floresan tahliline benzer şekilde, kütüphanelerdeki bileşiklerin sinyale müdahale etme veya inhibe etme potansiyeli vardır, bu nedenle, ilgisiz füzyonlar veya protein seviyesini izlemeye alternatif yaklaşımlar kullanan kurşun bileşikleri ile ortogonal takip deneyleri, bu tahlillerde RLU kaybının doğrudan hedef protein bozulması ile ilişkili olduğunu değerlendirmek için önemli olacaktır.
Uzun süreler boyunca canlı hücre kinetik formatında tarama yeteneği, arka plana yapılan tahlil sinyaline (S: B) büyük ölçüde dayanır. S: B'ye katkıda bulunan faktörler, hedef proteinin kendisinin ekspresyon seviyesini, birkaç büyüklük sırasını kapsayabilen ekspresyon seviyesini, peptid yerleştirilmesi için seçilen hücre hattındaki LgBiT ekspresyonunun verimliliğini, ve çeşitli yerel komplekslerinde tamamlama için etiketli hedefin kullanılabilirliği. Kinetik moddaki bozulmayı Endurazin veya Vivazine ile başarılı bir şekilde ölçmek için 15'lik bir S: B'den oluşan genel bir kesme gereksinimi belirledik. S: B, Endurazin veya Vivazine canlı hücre substratlarının varlığında tek başına LgBiT'yi eksprese eden düzenlenmemiş ebeveyn hücrelerine göre LgBiT'yi birlikte eksprese eden HiBiT düzenlenmiş hücrelerin taban çizgisi sinyalinin ölçülmesiyle belirlenir. Vivazine daha yüksek bir ışıldayan sinyal üretecek, ancak Endurazine'den daha hızlı bozunacak ve sinyal alımını 24 saat veya daha kısa bir süre ile sınırlayabilir. Ayrıca, S: B, CRISPR havuzlarının mı yoksa klonların mı kullanıldığına da büyük ölçüde bağımlı olabilir. CRISPR / Cas9 mühendisliği için daha uygun ve yüksek verimliliğe sahip hücre hatlarındaki hedefler için, düzenlenmiş hücrelerin heterojen bir CRISPR havuz popülasyonu, kinetik analiz için yeterli S: B'ye sahip olabilir. CRISPR aracılığıyla daha az verimli genomik entegrasyonun düşük S: B'li havuzlarla sonuçlandığı daha zor hücre hatlarındaki hedefler için, düzenlenmiş popülasyonları zenginleştirmek ve kinetik analiz için yeterince yüksek bir S: B elde etmek için CRISPR klonlarını izole etmek gerekebilir. Bu senaryolardan herhangi biri için, S: B, Endurazin veya Vivazine substratları ile 15'ten küçükse, son nokta litik taraması önerilir.
Kantitatif parametrelerle bir bozunma profilinin belirlenmesi de dahil olmak üzere bileşiklerin daha iyi anlaşılması ve karakterizasyonu için, canlı hücrelerde gerçek zamanlı kinetik analiz önerilen tarama yaklaşımıdır14,18. Yukarıda tartışılan son nokta analizi gibi, ilk kinetik tarama, yüksek verimli bir şekilde 100nM-10μM aralığında sınırlı sayıda konsantrasyonla yapılabilir. 384 kuyucuklu formatta, 100'den fazla bileşik, tek bir plaka üzerinde bir konsantrasyonda üçlü olarak kolayca taranabilir. Ortaya çıkan bozunma profilleri sadece gözlemlenen bozulmanın kapsamı hakkında değil, aynı zamanda bozulma oranı, bozulma süresi ve protein 14,18'in potansiyel geri kazanımı konusunda da rehberlik sağlayacaktır (Şekil 2 ve Şekil 3). Bozunma profilinin şekilleri de değerli bilgiler verir. Spesifik ve güçlü bozunucular genellikle hedef proteinin birkaç saat içinde bir platoya hızlı bir şekilde kaybolduğunu gösterir18,53, oysa transkripsiyonel geri besleme veya bileşik toksisite gibi diğer mekanizmalar tipik olarak proteinin zamanla daha doğrusal kaybına neden olur. Bu detaylar ve nüanslar, uç nokta litik analizi ile kaçırılır ve 24-48 saat boyunca gerçek zamanlı analizle, yeni veya bilinmeyen bileşik kümeleri içinde gerçek Dmax'ı yakalama zamanını tahmin etmek zorunda kalmazsınız.
Gerçek zamanlı kinetik, bileşik etkinliğini, bileşik konsantrasyonunun ilk bozunma oranını nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için etkili doz yanıtı taramasına izin verir ve bileşikleri birden fazla parametreye göre sıralama olanakları sunar. Klasik bozunma potansiyeli ölçümleri, görünür bozunma maksimumuna dayanan belirli bir zamanda DC50 hesaplamalarını içerir. Buna karşılık, potensi değerlendirmek için kinetik yaklaşımımız,18. zamanda ne zaman meydana geldiğine bakılmaksızın her konsantrasyonda gerçek bozulma maksimumunu içerir. Kinetik bozunma potansiyelinin bu ölçümüne Dmax5018 diyoruz. Bu şekilde analiz, daha düşük konsantrasyonlarda bozulmayı daha yavaş başlatabilen ve bu nedenle Dmax'larına ulaşmak için işlem sonrası daha uzun zaman alabilen bileşikleri açıklar. Bileşikleri hem bozunma hızına hem de Dmax'a göre sıralamak özellikle bilgilendirici olabilir. En güçlü bozundurucular için bu, yavaş ama güçlü bozucuları hem hızlı hem de güçlü olanlardan daha da farklılaştıracaktır. Birlikte, HiBiT CRISPR hücre hatlarını kullanan hem litik hem de canlı hücre kinetik taraması, hedeflenen protein bozunumunun, bileşik fonksiyonunun daha kapsamlı bir resmini veren ve anahtar bozunma parametrelerinin iyileştirilmesi yoluyla ilk aktivite değerlendirmesinden aşağı akış kimyasal optimizasyonuna kadar tarama sürecini sağlayan güçlü yaklaşımlardır.

Hedeflenen protein bozunması, kanser tedavisi için immünomodülatör moleküler yapıştırıcı bileşiklerinin (örneğin, IMiD) terapötik başarısı ve Chimera bileşiklerini hedefleyen Proteoliz 1,2,3,4,5,6,7,8'in umut verici erken klinik çalışma verileriyle büyük ölçüde desteklenen, küçük moleküllü ilaç keşfinde en hızlı büyüyen alanlardan biri olarak ortaya çıkmıştır. 9,10,11,12. Hedeflenen protein bozunma bileşikleri, E3 ligaz makinesi proteinleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ile bir hedef proteini yakınlaştırarak işlev görür . Hedef proteinin E3 ligazına bu bileşik kaynaklı alımı, ubikitin proteazomal yolu (UPP) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 yoluyla hedef protein ubikitinasyonuna ve bozulmasına yol açar. . Tarihsel olarak, küçük moleküllü ilaç keşif tarama programları, aktiviteyi değerlendirmek ve bileşikleri sıralamak için ilk biyokimyasal testlere güvenmiştir. Bununla birlikte, bu, nihai aktivitesi, proteazom yoluyla bozunma, hücresel olayların bir kaskadına bağlı olan hedeflenen protein bozunumcuları için önemli bir zorluk ortaya koymuştur 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. Başarılı hedef bozunması için gerekli olan protein komplekslerinin çoklu yolları ve karmaşıklığı, ilk bileşiklerin erken taranması ve önceliklendirilmesi için hücresel analiz yaklaşımlarını gerektirmektedir. Şu anda, hücresel ortam bağlamında hedef protein bozulmasını yüksek verimli bir şekilde izlemek için teknolojilerin mevcudiyeti ciddi şekilde eksiktir14. Burada, CRISPR / Cas9 endojen olarak etiketlenmiş HiBiT hedef hücre hatları 18,19,20 kullanılarak gerçek zamanlı kinetik canlı hücre veya son nokta litik bozunma aktivitesi değerlendirmesi için protokoller sunacağız ve 10,11,18,19 degrader bileşikleri ile tedaviden sonra ışıldayan ölçüm yoluyla hedef proteinin kaybını izleyeceğiz.
Terapötik hedeflerin başarılı bir şekilde parçalanmasını sağlamak ve ilaçlanabilir proteomu genişletmek için, plazma zarında veya içinde lokalize olanlar, lizozomlar, mitokondriyal membranlar, sitoplazma ve çekirdek21-57 dahil olmak üzere yıkım için çok çeşitli proteinleri hedefleyebilen çok sayıda yaklaşım ve tipte bozundurucu ortaya çıkmıştır. En kapsamlı olarak incelenen iki ana bileşik sınıfı, moleküler yapıştırıcılar ve simeraları hedefleyen protein 2,4,5,6,7,12,26'dır. Moleküler yapıştırıcılar monovalenttir, bu nedenle tipik olarak daha küçüktür ve yeni bir proteini kolaylaştırır: bir E3 ligaz bileşeni2,12,26'ya bağlandıktan sonra bir hedef protein ile protein etkileşim arayüzü. Bunlar en yaygın olarak Cereblon (CRBN) E3 ligaz bileşeni2,12,26,55,56,57'ye bağlanan bozunuculardır. Son zamanlarda, DCAF1558,59,60 ve DDB1 45'e CDK / Siklin alımı gibi diğer E3 ligaz makinelerini kullanan heyecan verici yeni örnekler, bu bileşik sınıfının genişleme potansiyelini göstermektedir. Buna karşılık, PROTAC'lar daha büyük, iki değerli moleküllerdir, bir hedef bağlama ligandından oluşur, çoğunlukla bir inhibitör, kimyasal bir bağlayıcı aracılığıyla bir E3 ligaz sapına 1,3,4,5,7,13 ile köprülenir. Bu nedenle, bu bileşikler hem E3 ligazına hem de hedef protein 1,3,4,5,7,13'e doğrudan bağlanabilir. Çok sayıda proteinin bu iki değerli moleküller yoluyla parçalandığı gösterilmiştir ve en çok kullanılan E3 ligaz sapları CRBN veya Von Hippel Lindau (VHL) 1,3,4,5,7,13'ü işe alır. Bununla birlikte, proteoliz tasarımını hedefleyen kimeralarda E3 ligaz alımı için mevcut tutamakların sayısı hızla artmakta ve bu bileşik sınıfının yeteneklerini, çeşitli hedef sınıfları bozma ve hücre veya doku tipi özgüllüğünü arttırma potansiyeli ile genişletmektedir 24,48,61,62 . Marjinal afinite ile bile, bir hedef proteini meşgul etmek için minimum gereklilik ile birleştiğinde, bozunma bileşikleri, uyuşturulabilir proteomu genişletmek için umut vaat etmektedir.
Protein kaybının hücresel dinamiklerini ve tedavi sonrası potansiyel protein geri kazanımını karakterize etmek, bozunma bileşiği fonksiyonunu ve etkinliğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Batı leke antikor tahlilleri veya kütle spektrometrisi ile ilgili hücresel sistemlerdeki endojen protein seviyesi değişikliklerini incelemek mümkün olsa da, bu yaklaşımların yüksek verimli tarama formatlarına adapte edilmesi, sınırlı niceleme kabiliyetine veya birçok zaman noktasında kinetik değişiklikleri ölçme kabiliyetine sahip olması zordur14. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, endojen protein seviyelerindeki değişiklikleri izlemek için, 11 amino asit etiketi HiBiT'in CRISPR / Cas9'u aracılığıyla herhangi bir anahtar bozunma hedefinin 18,19,20 lokusuna genomik yerleştirmeyi kullanan plaka tabanlı bir hücresel ışıldayan sistem geliştirdik. Bu peptit, 18,19,20,63 substratının varlığında parlak lüminesans üretmek için bağlanma ortağı LgBiT'ye yüksek afinite ile tamamlar, böylece bu etiketli endojen proteinleri hücrelerde veya lizatlarda ışıldayan hale getirir 18,19,20,63 . Bir luminometre cihazı ile ölçülen göreceli ışık birimleri (RLU'lar), etiketlenmiş hedef protein seviyeleri 18,19,20,63 ile doğru orantılıdır. Stabilize lusiferaz substratlarının geliştirilmesiyle, 24-48 saatlik zaman dilimleri üzerinde gerçek zamanlı kinetik protein seviyesi ölçümleri mümkündür 18,53,64. Bu, herhangi bir bileşik konsantrasyonunda, ilk bozunma hızının, bozunma maksimumunun (Dmax) kantitatif analizi ve bileşik muameleden sonra geri kazanım18,53 dahil olmak üzere, herhangi bir belirli hedef için tam bir bozunma profilinin belirlenmesine izin verir. Bununla birlikte, bozunma bileşiklerinin büyük kütüphaneleri taranırsa, son nokta analizi, çeşitli ilaç konsantrasyonlarında ve belirlenen zamanlarda 384 kuyucuklu formatta kolayca gerçekleştirilebilir.
Bu makalede sunulan protokoller, hedeflenen protein bozunma bileşikleri için hücresel tarama stratejilerini temsil etmektedir ve her türlü bozundurucu için geçerlidir. Bununla birlikte, HiBiT CRISPR hücre hatlarının bu protokollerle birlikte kullanılması, protein yıkımı ile sınırlı değildir, bunun yerine, bileşiklerin etkisini ve hatta direnç mekanizmalarını incelemek için işlem sonrası modüle edilebilecek herhangi bir endojen hedef protein seviyesini izlemek için genel araçlardır 20,65,66. Bu ışıldayan tabanlı tespit yöntemleri için bir ön koşul, endojen hedef ekspresyonu ve doğal promotör regülasyonu18,19,20'yi korurken, hassas ışıldayan algılamayı mümkün kıldığı için kritik öneme sahip bir CRISPR endojen etiketli HiBiT hedef hücre hattıdır. CRISRP/Cas9'un genomik etiketlerin yerleştirilmesinde, özellikle ölçeklenebilirlik 20'de ve yüksek algılama hassasiyeti ile, CRISPR havuzları veya heterozigot veya homozigot allelik eklemelere sahip klonlar dahil olmak üzere çeşitli formatlarda kullanılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir18,19,20. Endojen etiketleme yerine hücrelerde HiBiT'in eksojen ekspresyonunun veya diğer muhabir füzyonlarının kullanılması mümkündür, ancak protein aşırı ekspresyonu14,18 olan sistemler kullanılarak önemli ölçüde dikkatli olunmalıdır. Bunlar, gerçek bileşik potens ve protein geri kazanım dinamiklerini anlamada eserlere yol açabilir14,18, hedef bozunma sonrası aktive edilen potansiyel transkripsiyonel geri besleme döngüleri dahil. Ek olarak, düşük potansiyele sahip erken evre bileşikler kaçırılabilir ve taramada kendilerini yanlış negatifler olarak gösterebilir. Protein kaybı, bileşiğin neden olduğu toksisite ve hücre ölümünden kaynaklanabileceğinden, burada açıklanan protokoller şiddetle tavsiye edilir, ancak isteğe bağlı hücre canlılığı ışıldayan veya floresan tahlilleri, bozunma protokolü ile eşleştirilmiştir. Protokolün iki ana bölümü vardır: litik son nokta ve canlı hücre kinetik taraması. Bu bölümlerin her birinde, son nokta veya kinetik formatlarda çoklanmış hücre canlılığı ölçümleri için seçenekler dahil edilmiştir. Etiketlenmiş endojen proteinin değişimlerinin izlenmesi, hücrelerde LgBiT ile kompleman gerektirir. Bu nedenle, kinetik tarama bölümü, bunun tanıtımı için geçici veya kararlı ekspresyon yoluyla elde edilebilen ve canlı hücre ışıldayan ölçümlerini gerçekleştirmek için gerekli olan önemli protokollere atıfta bulunur. Burada sunulan tüm yaklaşımlar, bileşiklerin hızlı sıralama sıralamasına ve aktivite değerlendirmesine izin vererek, erken aşama bileşik tarama çabalarına ve kurşun bozundurucuların daha hızlı tanımlanmasına olanak tanır.
Bu protokol, bir HiBiT CRISPR hücre hattı ile birlikte bozunma bileşiklerinin incelenmesi için tasarlanmıştır. Çok sayıda hedef için HiBiT CRISPR eklemelerinin oluşturulmasına yönelik protokoller, yakın tarihli birkaç yayında özetlenmiştir18,19,20.

<table><tbody><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>Cell Viability luminescent assay</td></tr><tr><td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>Cell Viability fluorescent assay</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-independent medium</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>For compound dilution and control</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>89510-194</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEK293 LgBiT stable cell line</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td><td>Promega</td><td></td><td>&lt;u&gt;https://www.promega.com/crispr-tpd&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>Hygromycin B solution</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega</td><td>CS1956C01</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>LgBiT Expression Vector</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>Luminometer Plate Reader</td><td></td><td></td><td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2570</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2580</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>Cell culture</td></tr></tbody></table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Moleküler yapıştırıcılar veya kimeraları hedefleyen proteoliz dahil olmak üzere hedeflenen protein bozunma bileşikleri, küçük moleküllü ilaç keşfinde heyecan verici yeni bir terapötik modalitedir. Bu bileşik sınıfı, hedef proteini ve E3 ligaz makinesi proteinlerini ubikitinasyon ve nihayetinde hedef proteini ubikitin-proteazomal yol (UPP) yoluyla bozunmak için gereken yakınlaştırarak protein yıkımını indükler. Bununla birlikte, hedef protein yıkımının yüksek verimli bir şekilde profillenmesi, bozulmayı sağlamak için gereken hücresel yolların karmaşıklığı göz önüne alındığında oldukça zor olmaya devam etmektedir. Burada, ışıldayan bir protein üretmek için LgBiT proteinine yüksek afinite ile tamamlanan 11 amino asit HiBiT etiketi ile hedef proteinlerin CRISPR / Cas9 endojen etiketlemesinin kullanımına dayanan bir protokol ve tarama stratejisi sunuyoruz. Endojen etiketlere sahip bu CRISPR hedefli hücre hatları, ışıldayan plaka tabanlı bir okuyucu kullanarak ışıldayan sinyali izleyerek gerçek zamanlı, kinetik canlı hücre veya uç nokta litik modlarında bileşik kaynaklı bozulmayı ölçmek için kullanılabilir. Burada, farklı formatlar için önerilen tarama protokollerini ana hatlarıyla belirtiyoruz ve ayrıca hız, Dmax, DC50, Dmax50'nin temel bozunma parametrelerinin hesaplanmasını ve hücre canlılığı tahlilleri ile çoklamayı açıklıyoruz. Bu yaklaşımlar, erken evre bileşiklerin hızlı bir şekilde keşfedilmesini ve önceliklendirilmesini sağlarken, ilgili hücresel arka planlarda hedef proteinlerin endojen ekspresyonunu ve düzenlenmesini sağlayarak kurşun terapötik bileşiklerin verimli bir şekilde optimize edilmesini sağlar.

Tek konsantrasyonlu sonlanım noktası litik bozunma analizini göstermek için, birkaç CDK hedef proteini; CDK2, CDK4, CDK7 ve CDK10, HEK293 hücrelerinde C-terminuslarında HiBiT ile endojen olarak etiketlendi ve pan-kinaz Sereblon bazlı PROTAC, TL12-18654'ün 1 μM konsantrasyonu ile muamele edildi (Şekil 1A). CDK proteininin seviyesi farklı zaman noktalarında ölçüldü ve DMSO kontrolüne göre fraksiyonel RLU belirlendi (Şekil 1A). Her CDK proteini, bileşik tedaviye ve çeşitli zaman noktalarına yanıt olarak farklı derecelerde bozulma göstermiştir (Şekil 1A). CDK proteinlerinin protein kaybı açısından birbirleriyle doğrudan nasıl karşılaştırıldığını anlamak için, Şekil 1A'daki fraksiyonel RLU'lar toplam % bozunma olarak hesaplanmış ve Şekil 1B'deki her zaman noktası için çizilmiştir. Bu, erken zaman noktalarında, 2 veya 4 saatte bile, CDK aile üyelerinin bazılarının zaman içinde yukarı doğru eğilim göstermeye devam eden yüksek düzeyde bozulma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 1B).
Kinetik bozunma analizini göstermek için, BET ailesi üyesi proteinlerin her biri; BRD2, BRD3 ve BRD4, LgBiT proteini18'i kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücrelerindeki N-terminuslarında HiBiT ile endojen olarak etiketlendi. Bunlar daha sonra pan-BET PROTAC'ların üç farklı konsantrasyonu ile muamele edildi; Sereblon tabanlı dBET650 (Şekil 2A) ve VHL tabanlı ARV-77141 (Şekil 2B). Kinetik ölçümler 24 saatlik bir süre boyunca toplandı ve her konsantrasyondaki profillerden, BET aile üyesi yanıtındaki farklılıklar kolayca görülebilir. BRD2'nin bozunma sonrası bileşik tedavisinin daha hızlı bir geri kazanım yanıtı başlatma yeteneği (Şekil 2A, B) daha önce diğer pan-BET PROTAC'larla gözlemlenmiştir ve muhtemelen bozunma sürecine rekabetçi bir transkripsiyonel geri bildirim yanıtından kaynaklanmaktadır18.
Hem sonlanım noktası hem de kinetik analiz, tam bileşik doz yanıtı tedavileri ile yapılabilir. Şekil 3'te gösterilenler, dört farklı moleküler yapıştırıcı bileşiği 2,26,55,57 ile LgBiT proteinini kararlı bir şekilde eksprese eden Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat hücrelerinin tedavisinin kinetik doz yanıtı bozunma profilleridir; lenalidomid (Şekil 3A), iberdomid (CC-220) (Şekil 3B), talidomid (Şekil 3C) ve pomalidomid (Şekil 3D). Bu bozunucular, bileşikler arasında ve konsantrasyon serileri arasında bozunma tepkisinde önemli farklılıklar göstermektedir (Şekil 3).
Şekil 3'teki bileşiklerin bozunma ve sıralama sırasını nicel olarak değerlendirmek için, doz yanıt profilleri, bozunma hızı (Şekil 4A), Dmax (Şekil 4B) ve Dmax50 değerleri (Şekil 4B) dahil olmak üzere anahtar bozunma parametrelerini hesaplamak için kullanılmıştır. Bu analizler, iberdomid (CC-220) ve pomalidomidin çok benzer hızlı başlangıç bozunma oranlarına sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 4A), ancak iberdomid (CC-220) daha önce ortogonal çalışmalarda görüldüğü gibi en yüksek potansiyele sahiptir55,57 (Şekil 4B). Iberdomid bu kadar yüksek bir potens sergilediğinden ve test edilen tüm konsantrasyonlar% 50'den fazla bozulma gösterdiğinden, Iberdomid için elde edilen Dmax50 değeri, verilerin doğru bir şekilde uymasındaki sınırlamaya dayanan bir tahmini temsil eder. Şekil 3C, D ve Şekil 4B'deki grafiklerden, ne lenalidomid ne de talidomid, Ikaros / IKZF1 hedefini test edilen en yüksek konsantrasyonlarda tamamlanmasına indirgemez. Talidomid ile gözlenen çok az bozulma nedeniyle, bozunma izleri üstel bir bozunma modeline tam olarak uyamadı, bu nedenle bu tedavi için bozulma oranı ölçülmedi. En güçlü bozundurucu için, iberdomid (CC-220)55,57 (Şekil 4B). Hücre canlılığı multipleks testleri, test edilen konsantrasyonlar için hücre canlılığında herhangi bir kayıp göstermemiştir (Şekil 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Şekil 1: Pan-kinaz PROTAC ile CDK sonlanım noktası bozulması ve toksisitesi, TL12-18654. (A) CRISPR/Cas9 aracılığıyla C-terminus üzerinde HiBiT ile kaynaştırılan ve 2 saat, 4 saat, 8 saat ve 24 saat tedavide 1 μM TL12-186 PROTAC54 ile bozunma açısından değerlendirilen endojen CDK hedef proteinlerinin panelini seçin. Değerler, her zaman noktasında ölçülen bir DMSO kontrolüne göre Fraksiyonel RLU olarak temsil edilir. Hata çubukları, 3 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. (B) CDK hedef proteinlerinin panelinin yüzde bozunması, (A) dan hesaplanarak 2, 4, 8 ve 24 saatlik zaman noktalarında gözlemlenen her bir aile üyesinin bozulma miktarını temsil eder. Hata çubukları, 3 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Şekil 2: BET ailesi üyelerinin kinetik bozunma seçiciliğinin BET bozucuları, dBET650 ve ARV-77141 ile profillenmesi. Endojen BET ailesi üyelerinin, BRD2, BRD3 ve BRD4'ün kinetik bozunma profilleri, 1 nM (sol), 10 nM (orta) veya 100 nM (sağ) dBET650 (A) veya ARV-77141 (B) PROTAC'ların tek konsantrasyonlarının tedavisi ile CRISPR / Cas9 aracılığıyla N-terminus üzerinde HiBiT ile etiketlenmiştir. Değerler, her kinetik zaman noktasında bir DMSO kontrolünden hesaplanan Fraksiyonel RLU olarak temsil edilir. Hata çubukları, 4 teknik çoğaltmanın ortalamasının SD'sini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Şekil 3: Moleküler tutkal paneli 2,26,55,57 ile Ikaros/IKZF1-HiBiT'nin canlı hücre kinetik bozunma doz yanıtı profilleri. LgBiT proteinini kararlı bir şekilde eksprese eden Jurkat hücreleri, Ikaros / IKZF1'in C-terminusunu HiBiT peptidi ile etiketlemek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanmıştır. Hücreler, dört farklı moleküler tutkal bileşiği 2,26,55,57'nin DMSO'sunu içeren 8 noktalı bir doz yanıtı konsantrasyon serisi ile tedavi edildi: (A) lenalidomid, (B) iberdomid (CC-220), (C) talidomid veya (D) pomalidomid. Lüminesans her 5 dakikada bir toplam 19.5 saat ölçüldü. (A-D)'den gelen göreceli ışık birimi (RLU) verileri, Adım 2.4.1'de açıklandığı gibi kesirli RLU'ya dönüştürüldü ve zamanın bir fonksiyonu olarak grafiklendirildi. Hata çubukları, 3 teknik kopyanın SD'sini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Şekil 4: Ikaros/IKZF1-HiBiT için bozunma hızının ve Dmax50'nin hesaplanması ve hücre sağlığı tahlillerinin çoklanması. Kantitatif bozunma parametrelerini hesaplamak için Şekil 3'teki kinetik bozunma verileri kullanılmıştır. (A) Bozunma oranları ve (B) bozunma maksimum değerleri (Dmax), belirtilen moleküler tutkal bileşikleri2,26,55,57 için her ilaç konsantrasyonunda grafiklendirilir. (B) Her bileşik için Dmax50 değerleri, bir hedef için sıra bozunma bileşiklerini sıralamak için kullanılabilecek, kısıtlı Hill eğimi 1 olan bir doz-yanıt modeli kullanılarak hesaplanmıştır. (C) Şekil 3B'den iberdomid (CC-220)55,57 bozunma dozu yanıtı ile hücre canlılığı testleri, kinetik bozunma ölçümlerinin tamamlanmasının ardından son nokta ölçümü olarak gerçekleştirilmiştir. Hata çubukları, 3 teknik kopyanın SD'sini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.3K Görüntüleme.  Promega Corporation. Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

Video: High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Kanser Araştırmaları

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Biyokimya

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biyoloji

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...