The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.

1. Numune Hazırlama ve Liyofilizasyon <ol><li> 0.22 um&#39;lik steril bir filtre ile uygun bir tampon ve filtre karşı Mb stok çözeltisi gerekli hacmi Dialyze. </li><li> (; PLeu L-2-amino-4,4-azi-pentanoik asit), uygun bir tampon içinde stok çözelti katkı maddeleri ve foto-lösin gerekli hacmi hazırlayın. 0.22 um steril filtre ile stok çözelti filtre. </li><li> Protein, eksipiyanlar pLeu ve tampon solüsyonları kullanılarak Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, formülasyonları hazırlamak. </li><li> 0.22 um steril filtre içinden filtre örnekleri adım 1.3 ile oluşan herhangi bir yağ çıkarılır. 2 ml&#39;lik cam şişelere 0.2 ml olarak ayrı ayrı örnekleri doldurun. Sspl-MS çalışmalarında pLeu etkinleştirmek için UV (365 nm) ışık şeffaf cam şişeleri kullanın. </li><li> Bir liyofilizerde yük flakon ve uygun bir liyofilizasyon döngüsü tasarlayarak liyofilizasyon başlatmak. <ol><li> Burada, -40 ° C &#39;de örnekleri dondurma ve ardından12 saat süre ile 25 ° C&#39;de 12 saat ve ikincil kurutma 35 ° C&#39;de vakum altında (70 mTorr) altında esas kurutma yapılır. Liyofilizasyon döngüleri ve kurutma yöntemleri Diğer (örneğin, sprey kurutma) de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Kapatma önce azot ile liyofilize örneklerini içeren şişeleri Dolgu. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Formülasyonlar </td><td colspan="5"> Bileşim (mg / ml), liyofilizasyon öncesinde </td></tr><tr><td> Mb </td><td> Trehaloz </td><td> Sorbitol </td><td> pLeu c </td><td> Potasyum fosfat, pH 7.4 </td></tr><tr><td> MBT bir </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> MBS, bir </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> MBT + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 14.3 x 10 -3 1.43 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> MBS + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> 14.3 x 10 -3 1.43 </td><td> 0,4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:..., Liyofilize Mb formülasyonları Bileşim ssHDX-MS çalışma için kullanılan formülasyonlar, Sspl-MS çalışma için kullanılan b formülasyonlar C, L-2-amino-4,4-azipentanoic asit ya da foto-lösin (pLeu). pLeu 1x tekabül eden beş farklı konsantrasyonda (14.3 x 10 -3 1.43 mg / ml), Mb 10x, 20x, 50x ve ​​100x mol fazlası MBT ve MBS formülasyonları ile birlikte liyofilize edildi. Sağlam protein 2. ssHDX-MS <ol><li> K 2CO D 2 O previousl bir 3-200 mi doymuş bir miktarda (~ 440 g) ilave edilirY bir desikatör alt bölme içine yerleştirilmiştir. Hava geçirmez bir desikatörde mühür ve% 43 ulaşıldığında ~ kararlı bir bağıl nem (BN) kadar 5 ° C&#39;de dengelenmeye gelmeye bırakın. Çevrede bulunan nem değerleri farklı doymuş tuz çözeltileri 23,24 seçilerek elde edilebilir. </li><li> Desikatör üst bölme içinde liyofilize proteini içeren kapaksız şişeleri yerleştirerek ssHDX tepkileri başlatın. Kurutucu hava geçirmez mühür ve HDX (Şekil 2A) yapılmasına izin vermek için 5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. </li><li> Üçlü olarak çeşitli zamanlarda ssHDX örnekleri toplamak. Mb formülasyonlar için, dokuz zaman noktalarında, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 ve 144 saat bir numune toplayın. </li><li> Hemen desikatöre çekilerek sonra şişeleri Cap ve sıvı azot içinde şişeleri dondurma flaş tepkileri gidermek. Kütle spektrometrik analiz edilinceye kadar -80 ° C&#39;de saklayın şişesi kullanılmıştır. </li><li> Uygun yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi-kütle Spectrom kullanarak örnekleri analiztrisi (LC-MS) bir yöntem. Tasarım veya numune analizi sırasında geri-alışverişini en aza indirmek için uygun bir soğutmalı LC sistemi satın. Sütun soğutma ünitesinin kurulumu kullanarak ve LC-MS yöntemi daha önce 25 bildirilmiştir. NOT: amid proton değişim oranı pH ve sıcaklığa bağlıdır yana, protein dahil döteronlar, mobil faz hidrojen mevcut (&quot;arka değişim&quot;) ile alışverişi bilgi kaybına neden olabilir. Söndürme tamponu ve HPLC çözücülerin bir asidik pH değeri (pH 2.5), sıcaklığı düşürmek için, büyük ölçüde geri-dönüşüm en aza indirmek mümkün olmakla birlikte (≤0 ° C) daha fazla geri değişimi proteini korumak uygun bir kolon soğutma sistemi ile . </li><li> Otomatik tuz giderme ve yıkama işlemini kontrol vana örnek döngü ve protein tuzak bağlayın. 200-3,200 m / z aralığı içinde kütle spektrometreye bir TOF düşük bir konsantrasyonu ayarlama karışımı enjekte edilerek kütle spektrometresi kalibre edin. immobilizePepsin kolonu ve analitik kolon Sağlam protein analizi için gerekli değildir. </li><li> ° C ≤0 ve ~ 0 ° C arasında bir sabit çalışma sıcaklığına ulaşmak için sistem beklemek soğutulmuş sistemde sıcaklığı ayarlanır. </li><li> Hızlı kütle spektrometrik analizi için sıvı azot içine -80 ° C ile ilgili örnekleri aktarın. Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde sıvı azot her şişe çekme ve şişeye su içinde% 0.2 formik asit (FA) (pH 2.5) ve% 5 metanol içeren buz gibi soğuk söndürme tamponu belirli bir hacminin ilave edilmesiyle hazırlandı örnek sulandırın. </li><li> Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, bir gradyan kullanılarak,% 5 asetonitril,% 95 su ve% 0.1 formik asit (FA) ve elute 1.7 dakika boyunca, protein tuzağı olarak 20 pmol Mb içeren desalt numune% 80 asetonitril,% 20 su ve 0.1 yükselmiştir 3.3 dakika içinde% FA. M / z aralığında 200-3,200 üzerinde kütle spektrumları toplayın. </li><li> Sağlam kütlesini belirlemek içinProtein, Aşama 2.9 yöntemi kullanılarak bir sulu çözelti içinde bir Dötere edilmemiş protein örnek (değil ssHDX tabi yani protein) için veri elde. </li><li> Veri analiz yazılımı kullanılarak ham spektrumları karmaşıklığını aydınlatmak suretiyle Dötere edilmemiş ve döteryumlu numune kütleleri elde edilir. Burada, 15,000-18,000 Da, 1.0 Da&#39;lık kütle çözünürlüğü ve Mb kütlesinin hesaplanması için% 90 pik yüksekliğine göre kütle aralığı ayarlamak. </li><li> Her değişim bir zaman noktasında döteryumlu protein kitle Dötere edilmemiş proteinin kütlesini çıkarılarak sağlam protein (burada, Mb) dahil döteronların sayısını hesaplayın. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak teorik maksimum yüzde döteryum alım göreli hesaplayın (Denklem 1) <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" /> Değiştirilebilir amidler = amino asit toplam sayısının burada toplam sayısı - prolin artıkları sayısı - N- 2 (&quot;2&quot; hesaplarhızlı geri değişimini tabi terminal amino grubu ve amid hidrojen). </li><li> Uygun bir üstel denklem kullanılarak ssHDX kinetik verileri takın. Bir bieksponensiyaldir denklem (Denklem 2), genellikle ssHDX verilerine makul bir uyum sağlar basit olduğunu. Bu çalışmada, MBT ve MBS için, &quot;hızlı&quot; ve &quot;yavaş&quot; havuzları alışverişi döteronlar atar bir bieksponensiyaldir model verileri uygun. <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" /> burada N, hızlı ve N yavaş olarak değiştirilebilir amidlerin sayıda &quot;hızlı&quot; ve sırasıyla, havuzları alışverişi &quot;yavaş&quot;, ve hızlı k ve yavaş k iki havuzları ile ilişkili birinci dereceden hız sabitleri vardır. </li></ol> Peptit Düzeyde Protein 3. ssHDX-MS <ol><li> Aşama 2.6 şu değişiklikler ile kullanılmıştır adımları 2,1-2,8 izleyerek ssHDX gerçekleştirin. Hareketsiz pepsin col bağlayınvanaya UMN ve analitik kolon önce 25 rapor ve bir peptid tuzağı ile vanaya bağlı protein tuzağı değiştirme gibi. 100 1700 arasında değişen oranı şarj etmek kitle ayarlayarak kütle spektrometresi kalibre. Not: çözme işlemi (adım 2.8) sırasında, bir indirgeme maddesi ve denatüre edici madde, disülfür bağları (örneğin, monoklonal antikorlar) proteinlerin pepsin sindirimi kolaylaştırmak için söndürme tamponu içinde içerilebilir. </li><li> Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, bir peptid kapanında 1.7,% 10 asetonitril ile dakika,% 90 su ve% 0.1 FA% 0.1 FA, tuzağı ve desalt peptidlerle Online 20 pmol Mb içeren numuneler özet. 4.0 dakika içinde% 60 asetonitril gradyan artışı,% 40 su ve% 0.1 FA ile analitik sütun üzerine parçaları tasfiye edilir. M / z aralığında 100-1,700 üzerinde kütle spektrumları edinin. </li><li> Bir MS / MS analizi ile peptik parçaları tanımlamakDötere edilmemiş protein örneği. Özel bir veritabanında peptit parçalarının tahmin kitlelere peptid fragmanı iyonlarının deneysel kitleleri karşılaştırmak için kütle spektrometresi yazılımını kullanın. Düşük hata ile kitleleri tanımlamak için bir kalabalıktan kesme noktası (örneğin 10 ppm) olarak ayarlayın. Peptidler uyumlu olarak, (i) bir peptid dizisi, (ii) şarj durumu, ve (iii) tutma süresi oluşan bir listesini hazırlamak. </li><li> Fragmanını sindirmek Her pepsin için dahil döteronların ortalama sayısını harita ve belirlemek için adım 3.3 oluşturulan listeyi kullanın. Bu, uygun HDX-MS verileri analiz yazılımı 24 kullanılarak elde edilebilir. </li><li> Yüzde döteryum alımını hesaplamak için ve peptik parçalarının her biri için ssHDX kinetik verileri uygun adımları 2.13 ve 2.14 izleyin. MBT ve MBS formülasyonlar bir bieksponensiyaldir dernek modeli (Denklem 2) monte edildi Bu çalışmada, altı olmayan gereksiz pepsin her biri için HDX kinetik veri parçaları sindirmek. </li></ol> Bozulmamış Pro 4. Sspl-MSproteindir <ol><li> UV çapraz bağlayıcı üzerinde Fotolitik etiketleme reaksiyonu, ilk anahtarı başlayacak ve lambalar 5 dakika ısınmasını bekleyin. UV kaynağı pLeu ve diazirine grubu etkinleştirmek için dalga boyu 365 nm lambaları ile donatılmış olduğundan emin olun. DİKKAT: lambaları açık olduğunda UV çapraz bağlayıcı kapısını açmayın. Kaynak UV koruyucu cam kapı ile kapalı değilse, UV ışığına maruz gözleri ve cildi koruyun. </li><li> Kapıyı açmadan önce UV çapraz bağlayıcı kapatın. Lambaları kapalıdır sonra, liyofilize edilmiş formülasyonu içeren şişeler şapkasını çıkarmak ve Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, UV çapraz bağlayıcı odasının içine yerleştirin. 40 dakika boyunca UV ışığı ile örnekleri ışın tedavisi. </li><li> PLeu ve (ii) pLeu ile liyofilize örnekler içinde yeniden susuz liyofilize: (i) örnekleri için 4.3&#39;e adım 4.1 izleyerek kontrol deneyleri yapın. </li><li> Kapak kütle spektrometrik analiz zamanına kadar -20 ° C de küçük şişeler depolamak ve. </li><li> Reconstit2 uM konsantrasyonu getirmek için kütle spektrometresi dereceli damıtılmış su, uygun bir hacim ilave edilerek bir katı madde örnekleri katkı sağlayacaktır. </li><li> Örnek analizi başlamak için, adımları 2.6 ve 2.9 izleyin. NOT: Arka-değişim kovalent etiketleme ile ilgili bir sorun olmadığından, Sspl-MS özel soğutmalı LC sistemi gerektirmez. </li><li> Proteinin basit bir kütle belirlemek için, adım 2.9 izleyerek Sspl tabi tutulmamış olan bir protein numunesi için veri elde. Adım 2.11 açıklandığı gibi ham spektrumları çözümlenmesiyle ile etiketsiz ve etiketli örnekleri kitleleri edinin. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak Incorporated pLeu sayısını hesaplayın: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" /> M L işaretlenmiş proteinin kütlesi burada, E, N, doğal proteinin, kütlesi ve 115 (Da), tek pLeu dahil aşağıdaki doğal proteine ​​ilave ortalama kütlesidir. İşaretleme reaksiyonu th oluşur NotN 2 e kaybı (28 Da). pLeu bölgesinin monoizotopik kütle 143,07 olup. </li><li> Ekstre iyon kromatogramlardan pik yükseklikleri kullanılarak etiket farklı sayıda protein popülasyonlarının yüzdelerini hesaplayınız. <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" /> &quot;i&quot; etiket sayısını ifade etmektedir, pH ı kütle spektrometresi ile görüldüğü gibi, etiketlenmiş bir protein L i ve pH için, pik yüksekliği u işaretlenmemiş protein pik yüksekliği anlamlarına gelmektedir. </li></ol> Peptit Düzeyde Protein 5. Sspl-MS <ol><li> Adımları 4,1-4,4 takip ederek Sspl gerçekleştirin. </li><li> Peptid seviyesi analizi için, amonyum bikarbonat tampon maddesi (100 mM, pH 8.0) içinde bir katı madde örnekleri sulandırın. </li><li> Sulandırıldıktan sonra 10 de tripsin ile etiketlenmiş protein çözeltisi karıştırın tripsin proteinin 1 mol oranında ve 16 saat süre ile 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> FA% 0.1 ekleyerek reaksiyonu söndürmekörnek su içinde 2 uM protein nihai konsantrasyon elde edilir. </li><li> HPLC sistemine bağlı vanaya örnek döngü, peptid tuzak ve analitik sütun bağlayın. </li><li> Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, gradyan ile analitik sütunda bir elüsyon ile,% 5 asetonitril,% 95 su ve% 0.1 FA ile 1.5 dakika boyunca, bir peptit kapanında peptidler örnek döngüsünün içine sindirilmiş protein 20 pmol enjekte ve tuzunun giderilmesi 22 dakika içinde% 55 asetonitril,% 45 su ve% 0.1 FA artar. M / z aralığında 100-1,700 üzerinde kütle spektrumları toplayın. </li><li> Böyle daha önceden sağlam protein analizi hesaplanan pLeu numaraları ile EXPASY 26 gibi bir çevrimiçi araç kullanarak adüktlerinin peptid-pLeu için bir teorik kitle listesi hazırlayın. En az 4 bölünmelere cevapsız ekleyin. İşaretleme reaksiyonu N2 kaybı ile ortaya çıkar unutmayın. Etiketsiz deneyin Bu nedenle, peptid-pLeu aduktu kütlesi = kütleptic peptid + N (pLeu kütlesi) - N &quot;N&quot; dahil pLeu sayısını, (N2 kütlesi). NOT: sağlam proteinin kitle analizi, protein üç etiketli nüfusa kadar gösterseniz, peptid başına üç olası pLeu etiket kadar düşünün. 1 (28) = 1115 Da - 1000 Da&#39;lık kütle ile bir peptid için, 1 pLeu dahil edilmesi ile peptid pLeu adüktün teorik kütle 1000 + 1 (143) &#39;dir. Benzer bir şekilde, peptid-pLeu teorik kütleleri sırasıyla vb 1230 Da, 1345 Da olacak vb 2 pLeu, 3 pLeu, ekleri de içerir. </li><li> Deneysel gözlenen kitleler ile adım 5.7 oluşturulan teorik kitle listesini maç kitle analiz yazılımı kullanın. Düşük hata ile kitleleri tanımlamak için bir kalabalıktan kesme noktası (örneğin, 50 ppm) olarak ayarlayın. </li><li> Peptidler eşleşti için, pLeu gerçek sayısının M L ve M N etiketli kitleler vardır aşama 4,8 (Denklem 3), altında formül kullanılarak dahil belirlemeksırasıyla yerli peptit. </li></ol>

<ol>
	<li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters.">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. , BIO021D (2013).</li><li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides.">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li><li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations:+some+practical+advice.">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li><li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations:+theory+and+practice.">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy.">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li><li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography.">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics.">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li><li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+pharmaceutical+solids:+preparation,+characterization+and+stabilization.">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li><li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability.">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li><li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies.">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li><li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+(NIR)+spectroscopy.">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li><li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+state+chemistry+of+proteins:+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+(hGH)+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid.">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li><li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids:+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility.">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li><li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody/mannitol+formulations.">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li><li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H/D-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein.">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li><li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody,+on-line+proteolysis,+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry.">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li><li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery.">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li><li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding.">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development.">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li><li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics.">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8 (1977).</li><li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li><li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H/D+exchange+mass+spectrometry.">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li><li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen/Deuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+(ssHDX-MS).">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li><li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying.">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li><li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li><li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders.">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).</li><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H/D+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics:+is+there+a+need+for+a+top-down+approach.">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li><li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis.">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids.">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Çeşitli çalışmalar liyofilize örneklerinde yerel çevre proteini bozulmasını 5,29,30 etkilediğini düşündürmektedir. Ancak, katı halde protein yapısı ve istikrar arasında doğrudan bir ilişki kurarak, yüksek çözünürlüklü analitik yöntemlerin eksikliği mümkün olmamıştır. liyofilize tozlar böyle HDX ve PL gibi mevcut yüksek çözünürlüklü yöntemlerinin uygulama çözümü protokolleri ve dikkatli veri yorumlama değişiklik gerektirir. HDX-MS ve PL-MS arda katı halde protein konformasyonlar izlemek için kabul edilmiştir. Sonuçlar Burada sunulan ve başka 27,28,31-33 katı ortamda yüksek çözünürlüklü protein yapısını izlemek için bu yöntemlerin yeteneğini göstermiştir. Veri analizinde kritik adımlar çözelti 34-36 etiketleme farklılık olmasa da, deney düzeneği ve veri yorumlama sırasında önemli hususlar katı-hal kemi için gereklidircal etiketleme. Etiketleme reaktif seçimi boyutu ve etiketleme mekanizmasına dayalı olmalıdır. döteryum küçük boyutlu pLeu görece büyük boyutlu yan zincirlere etiketleme sınırlar ise peptid omurgası, kolaylıkla araştırılabilir sağlar. Bu etiketleme sadece matris omurgada hem de yan zincir maruz bağlıdır, böylece ssHDX ve Sspl ikisi de herhangi bir amino asidi için tercih gösterir. Etkin bir solid-state protein konformasyonlar prob, etiketleme sürecini etkileyen dış faktörler dikkatle kontrol edilmelidir. toplam miktarı ve liyofilize katı olarak işaretleme maddesi alansal dağılımı, sulu çözeltiler farklıdır. SsHDX olarak, katı bir matris içinde D 2 O miktarı açılma protein oranı (veya kısmi açılması), yeniden katlama ve döteryum değişimi etkileyebilir. Bu protein, örneği, normal olarak, D 2 O geniş bir hacmi ile seyreltilmiş halde bir çözelti HDX, durum böyle değildirSsHDX oranı hidrasyon etkilerinin dikkatli bir şekilde tarama doğru RH koşullarının seçimi bilgilendirebilir. Nem sorpsiyon hızını kontrol ve higroskopik yardımcı maddeler (örneğin, sakaroz ve trehaloz) ihtiva eden formülasyonlar tozun çökmesini önlemek için, ssHDX soğutulmuş koşullar altında gerçekleştirilebilir (2-8 ° C). Beklendiği gibi hidrasyon etkileri üzerine önceki çalışmamızda, nem içeriğinin artması ile döviz kurunu ve kapsamını artış gösterdi. Çalışmalarımız, 5 ° C sıcaklıkta% 43 oranında bir ara RH &#39;nın büyük bir bölümünde, makul bir süre 24 formülasyonlan ayırt ideal olduğu kanıtlanmıştır. bir plato elde edilene kadar reaksiyon genellikle gerçekleştirilir. Bu katı madde halinde nem emiş ve difüzyon HDX hızını kontrol yok olmasını sağlar. ≤2 ml önceden liyofilizasyon hacmi küçük katı numune boyutları kullanımı da, D 2 O buharı emilmesi, erken dönemde değişimi esas itibarıyla tamamlandığında sağlamaya yardımcı olur. Olsa ssHDX-MS içerirKatı-devlet proteinin yapısındaki kantitatif bilgiler, verilerin yorumlanması tamamen yalnız ssHDX çalışmaya dayanarak olamaz belirli koşullar vardır. Bu azalma döteryum alımı nedeniyle, protein yapısının en yüksek tutma ve numune içinde mevcut bulunan protein unsurlarının önemli miktarda olabilir (kontrol ile karşılaştırıldığında) bir numunede gözlemlenen mümkündür. Böyle bir durumda, ssHDX verilerin yorumlanması diğer tamamlayıcı yöntemler sonuçları gerektirir. Döteryumlu kütle spektrumları zirve genişleme birkaç Mb formülasyonlar 27,28 gözlenmiştir. Bu D 2 O konsantrasyonu numune kısmen katlanmamış protein nüfus, mekansal heterojenlik varlığı veya mekansal geçişlerini gibi çeşitli faktörlere bağlı olabilir. Ancak, bu faktörler ssHDX-MS ayırt ve daha fazla araştırma ihtiyacı değildi. Sspl-MS nispeten yeni olduğu gibi diğer yöntemlerle, sürekli öğrenme ab göreuygulamaları ve sınırlamaları dışında gerekmektedir. Sspl olarak, foto-çapraz-bağlayıcı protein ile liyofilize edilir. nem eksikliği katı matris içindeki bileşenlerin hareketliliğini kısıtlar ve ssHDX nem emilimi ile oluşabilecek kısmi yapısal gevşeme Sspl bir fenomen değildir. Bu foto-çapraz bağlayıcı hemen yakınında için Sspl olarak etiketleme sınırlar. Bununla birlikte, HDX-MS, tortu seviyesi yapısal bilgiler elde edilebilir kovalent olarak işaretlenmiş proteinin, MS / MS analizi farklı. Sspl etiketleme kovalent ve geri dönüşü olmayan bir olduğu için, geri değişimi meydana gelmez ve numuneler hazırlanmış ve etiketin kaybı göz önüne alınmadan analiz edilebilir. Işaretleme maddesi difüzyonunu kolaylaştırmak ve katı matris içinde etiketleme verimliliğini artırmak için, Sspl artan% RH ile gerçekleştirilebilir. pLeu alınmasından da fotoreaktif ajanın artan konsantrasyonu ile geliştirilebilir. istenildiği gibi pLeu proteinin mol oran isteğe göre ayarlanabilir. Genel olarak, pro pLeu bir 100x mol fazlasıproteindir yeterli etiketleme sağlayacaktır. Bununla birlikte, yüksek pLeu konsantrasyonu katı matris protein üçüncül yapısının kaybına neden olabilir. Bu nedenle, etiket kinetik ve formülasyon bileşimine ek olarak, pLeu konsantrasyonu seçimi aynı zamanda, protein, yapısal bütünlüğünü muhafaza dayanmalıdır. PLeu seçilmeden XH etiketler gibi grup, bu mümkün (X = C, N, O nerede) benzer etiketleme siteleri ile yardımcı maddeler büyük ölçüde protein etiketleme düzeyini etkileyebilir. Protein etiketleme için pLeu mevcudiyetindeki eksipiyan parazit henüz karakterize hale getirilecektir. Bu diazirine aktivasyonu üretilen karben tortu özgü olmadığı bilinmektedir, ancak bir çalışma Asp ve Glu 36 doğru önyargı bildirir. Bu tortu, spesifik etkileşimleri hakkında bilgi edinmek için iyi olsa da, peptid seviyesi bilgiler de yararlıdır ve katı halde, yüksek matris maruz bölgeleri bloke etme yardımcı maddeleri tasarlamak için de kullanılabilir. Sspl-MS Ancak, detaylı niteliksel bilgi sağlarnicel veriler elde edilmesi gerekiyor ve sağlam ölçütler liyofilize sistemleri çeşitli genelinde formülasyon farklılıklarını analiz etmek geliştirilmesi gerekmektedir. MS / MS analizi ile birlikte, bir tortu, spesifik etiketin kullanımı, ayrıca aşağıdaki amino asit seviyesine çözünürlüğünü artırabilir. Örneğin 2,3-bütandion olarak etiketleme ayıraçları, Arg, Cys Lys ve N -alkylmaleimide türevleri, N-hidroksisukinimid türevleri tam da liyofilize toz moleküler etkileşimlerini eşleştirmek üzere kullanılabilir etiket. Bununla birlikte, bu reaktifler pH değerine bağımlı ve reaksiyon katı-halde fotolitik etiketleme gibi iyi kontrol olmayabilir. Bir alternatif yaklaşım, oksotrofik hücre çizgileri, mevkiye yönelik mutagenez ya da yan zincir türetme kullanımı ile protein dizisi olarak foto-çapraz bağlayıcı dahil etmektir. Daha önceki ssHDX-MS, Sspl-MS çalışmalar proteinin etiketlenmesi eksipiyan doğasına ve miktarına bağlı olduğunu göstermiştir24,27,28,31-33,37,38 kullanılır. Mb düşük molekül ağırlığı 32 şeker ile-liyofilize ko daha Mb ssHDX-MS guanidin hidroklorür (Gdn.HCl) ile birlikte liyofilize eş daha döteryum alımını göstermektedir. Gdn.HCl sakaroz 33 ile Mb&#39;den fotolitik etiketleme karşı daha fazla koruma gösterdi ayrı bir Sspl-MS çalışmasında, Mb-liyofilize eş. Bundan başka, ssHDX-MS sayısal ölçümler yüksek uzun süreli depolama sırasında 28 protein stabilitesi ile ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmalar, protein ssHDX veya Sspl liyofilize toz bulunan proteininin yapısal tutma derecesini yansıtır düşündürmektedir. Biz liyofilize tozlar ikincil yapının tutma yan zinciri pLeu ile etiketleme ve döteryum değişiminden amid hidrojen korunması için elverişli bir ortam oluşturduğuna inanıyoruz. Bununla birlikte, bu yöntem ile ilgili bilgi içeriğinin detaylı karşılaştırma gelecekte yapılması gerekmektedir. SsHDX-MS ve Sspl-MS programı kuran rağmenBir formülasyon tarama aracı olarak birçok proteinler uygulanabilir sonuçta gerektirir, son çalışmaların sonuçları daha geniş benimsenmesini desteklemektedir. Daha da geliştirilmesi, bu yöntem, ilaç endüstrisinin katı-hal protein formülasyonlan karakterize etmek için yaygın olarak faydalı olması beklenmektedir.

Protein ilaçlar biofarmasötik endüstrisinin en hızlı büyüyen sektör olan ve hormonal bozukluklar, kanser ve otoimmün hastalıklar 1 olmak üzere daha önce inatçı hastalıklar için umut verici yeni tedaviler sunuyoruz. 2012 yılında, küresel Biyoterapötikler pazarı 138.000.000.000 $ ulaştı ve yıl 179.000.000.000 $ ulaşması bekleniyor 2018 2. Proteinler büyük ve geleneksel küçük molekül ilaçların daha kırılgan ve böylece bozulması 3 birçok türleri daha hassastır. (Örneğin, dondurularak kurutulmuş) bir katı madde tozlar liyofilize yeterli raf ömrü ve stabilitesini sağlamak için, protein ilaçlar genellikle formüle edilir. Bununla birlikte, bir protein yine doğal yapısı Liyofilizasyon işlemi esnasında 4,5 &#39;korunmaz, özellikle katı halde bozulma tabi olabilir. Bu yapı muhafaza edilmiştir sağlanması sufficien ile katı halde protein yapısını sondalamak analitik yöntem bulunmaktadır geçerli olabilmesit çözünürlüğü. NMR spektroskopisi 6 ve X-ışını kristalografisi 7 çözüm ve kristallerin 8 protein yapısını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yüksek çözünürlüklü yöntemleri vardır. Için yardımcı maddeler ve kullanılan işleme yöntemlerinin doğası, iyofilleştirilmiş protein, formülasyonlar, genellikle amorf yerine 9 kristaldir. homojenlik ve mikroskopik seviyede olmaması şekilsiz katılar proteinler için, yukarıda belirtilen teknikler kullanışsız hale getirir. Fourier kızılötesi spektroskopi (FTIR) 10 dönüşümü, Raman spektroskopisi 11 ve yakın kızılötesi spektroskopi (NIR) 12 düzenli yerli çözüm devlet yapısının buna liyofilize tozlar protein ikincil yapısını karşılaştırmak için biofarmasötik endüstrisi tarafından kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntemlerin düşük çözünürlüklü ve sadece ikincil yapı küresel değişimler hakkında bilgi verebilir. FTIR kullanılarak katı-hal yapısal karakterizasyonuUzun vadeli depolama stabilitesi zayıf 13,14 veya kötü 15 korelasyon ya göstermiştir. Bu sınırlamalar uygun yüksek çözünürlüklü yöntemleri solid-state protein yapısal tedirginlikler tanımlamak için ihtiyaç vurgulayın. Proteoliz ve kütle spektrometrik analiziyle birlikte kimyasal etiketleme, sulu çözelti içinde, protein yapısı ve molekül etkileşimleri izlenmesi için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. İlaç gelişmede, HDX-MS protein ilaçların 19 uyum post-translasyonel modifikasyonlar etkilerini izlemek için, reseptör-ilaç etkileşimleri 18 harita ve karşılaştırmak için, antijen-antikor etkileşimleri 16,17 epitop haritalama için kullanılır olmuştur biyobenzerlerin 20 gelişmekte olan partiden partiye varyasyonu. Benzer şekilde, foto-aktifleştirilebilen ligandlar ilaç hedeflerini tanımlamak ve bağlanma afinitesini ve ilaç-reseptör etkileşimleri 21,22 özgüllüğünü belirlemek için kullanılmıştır. Extend liyofilize formülasyonlar bu yöntemlerin uygulanması, bizim grup geliştirdi katı-hal hidrojen döteryum değişim kütle spektrometresi (ssHDX-MS) ve katı-hal fotolitik etiketleme kütle spektrometresi (Sspl-MS) liyofilize örneklerinde protein konformasyonlar ve yardımcı madde etkileşimleri çalışmak için Yüksek çözünürlükte. SsHDX-MS ve Sspl-MS Her iki protein, liyofilize katı madde ideal tepkime koşulları altında işaretlenir, ve numuneler daha sonra tekrar oluşturulmuş ve veya proteolitik sindirim olmayan kütle spektrometresi ile analiz edilir. Sspl-MS yan zincirlerinin çevre bilgileri (Şekil 1) içerir ise ssHDX-MS, döteryum buhar ana zincir maruz hakkında bilgi sağlar. iki yöntem böylece katı halde protein yapısındaki hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Burada, biz Mb, (Şekil 2) ssHDX-MS ve Sspl-MS kullanılarak liyofilize katı proteinleri okuyan kullanımı için genel bir protokol sağlamakbir model, bir protein. Iki farklı yardımcı maddeler ile formülasyonlar farkını ayırt etme iki yöntemden kabiliyetini gösterir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> Şekil 1:., Farklı etiket mekanizmalarla liyofilize katılar ssHDX ve Sspl ölçer protein yapı (A) &#39;HDX olarak, omurga amid, bir protein yapısı ve fonksiyonu ve D 2 O erişim olarak döteryum ile değişimi hidrojenlerin. Katı halde, hızı ve döteryum değişimi derecesi D 2 O sorpsiyon protein hareketlilik (yayılan ve olayları tekrar katlama) ve katı bir matris içinde mevcut katkı maddelerinin doğası düzeyine bağlıdır. PLeu bölgesinin diazirine işlevsel grup ara ürün, bir reaktif karben oluşumunu başlatır ve bir XH bağı (X, herhangi bir atomu olması durumunda) veya reklama spesifik olmayan sokulur mil PL (B), 365 UV ışınlamayakın çevresinde bir C = C bağı boyunca pro-. Katı halde ise bu oran ve etiketleme ölçüde lokal işaretleme maddesi konsantrasyonu, uygulama süresi, protein yapısı ve katı bir matris içinde mevcut katkı maddelerinin doğasına bağlıdır. Paneller A ve B proteininin, sırasıyla omurga ve yan zincirler üzerinde oluşabilecek maksimum teorik etiketleme göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> Şekil 2: şematik gösterimi katı hal HDX-MS (A) ve liyofilize edilmiş bir formülasyona protein PL-MS (B) gerçekleştirildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Name of Material/ Equipment</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equine myoglobin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0630-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Photo-leucine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#22610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate monobasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate dibasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td >#DLM-4-PK</td>
			<td>Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilized pepsin</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >#2-3132-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td >#V511A</td>
			<td>Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water, Optima LC/MS grade</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >#7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-TOF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >#G1969-85000</td>
			<td>Highly flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25108/03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptide microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25109/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >Zorbax 300SB-C18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freeze dryer</td>
			<td>VirTis AdVantage Plus</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stratalinker equipped with five 365 nm lamps</td>
			<td>Stratagene Corp.</td>
			<td >Stratalinker 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >1200 series LC</td>
			<td>Refrigerated LC system for HDX-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-qTOF MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >6520 qTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HDExaminer (HDX-MS data analysis software)</td>
			<td >Sierra Analytics</td>
			<td ></td>
			<td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders

Kütle spektrometrik analizi ve ardından amid hidrojen / döteryum değişimi (ssHDX-MS) ve yan zincir fotolitik etiketleme (Sspl-MS), protein terapötiklerinin liyofilize formülasyonlan karakterize edilmesi için yararlı olabilir. Uygun proteolitik sindirme ile, ardından etiketleme protein yapısı ve etkileşimleri peptid seviyesi çözünürlüğü ile eşlenmesi sağlar. Protein yana yapı elemanları, ana zincirleri ve amino asitler, amino asit rezidüleri atomu spesifik etiketleme proteininin yapısı ve biçimi görmemizi sağlar yan zincirleri kimyasal bağların bir ağ tarafından stabilize edilir. Liyofilize katıların (örneğin, FTIR), ssHDX-MS-MS ve Sspl nicel ve site özgü bilgi proteinleri incelemek için kullanılan rutin yöntemlerin aksine. döteryum Kuruluş ve kinetik parametrelerin ölçüde hızlı ve yavaş amid havuzları alışverişi ile ilgili olabilir (N hızlı, N yavaş) ve doğrudan C yansıtırLiyofilize formülasyonlar protein katlanması ve yapısı ree. Kararlı fotolitik etiketleme arka değişimi, ssHDX-MS üzerinde bir avantaj uğramaz. Burada, trehaloz ya da sorbitol ya içeren liyofilize formülasyonlarda bir model protein olarak miyoglobin (Mb) kullanılarak ssHDX-MS ve Sspl-MS hem de ayrıntılı protokolleri sağlar.

Burada, ssHDX-MS-MS ve Sspl liyofilize Mb formasyonların uygunluğu ve katı-hal etkileşimlerine yardımcı maddelerin etkisini incelemek için kullanılmıştır. protein ve bu çalışmada kullanılan katkı maddelerinin konsantrasyonları, Tablo 1 &#39;de verilmiştir. yukarıdaki protokollerin sunulmuştur izleyerek elde edilen liyofilize Mb ssHDX-MS, Sspl-MS analizi ile ilgili Örnek oluşur. Sağlam protein düzeyinde döteryum alımı ssHDX-MS sağlam düzeyde Mb formülasyonlar ayırt edebilmektedir. Formülasyon MBS ssHDX 144 saat müteakiben intakt Mb deconvoluted kütle spektrumları formülasyon MBT (Şekil 3A) daha büyük döteryum alımını göstermektedir. Ortalama olarak, MBS MBT (Tablo 2) den% 46 daha fazla döteryum alımı gösterdi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; Şekil 3: ssHDX-MS sağlam Mb için: formülasyonlar gelen döteryumlu sağlam Mb (A) deconvoluted kütle spektrumları MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi) ssHDX 144 saat takip. Dötere edilmemiş sağlam Mb deconvoluted kütle spektrumu da (noktalı çizgi) gösterilir. (B) formülasyonlarda olduğu gibi Mb için ssHDX kinetiği MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi). ssHDX zaman ders (SD ± n = 3) Grafik Pad Prism yazılımı sürüm 5 ile iki fazlı üstel dernek için bir denkleme takıldı. sağlam MBS ve MBT için dötertumlanma kinetik erken zaman noktalarında (1-4 saat) benzer, fakat MBS zaman (8-144 saat) (Şekil 3B) artış ile döteryum değişimi artış gösterdi. Bu düşük nem ve sıcaklık koşullarında ssHDX için uzun zaman noktaları seçerek önemini göstermektedir. Ayrıca, D 2 O emme ve difüzyon süreci erken zaman po ssHDX hızını etkileyebilirint. Daha önceki çalışmalar, ssHDX nem sorpsiyon saatlik bir süre içinde tamamlanır ve bu sure geçtikten sonra kinetik alışverişi için en az bir katkı sağladığı göstermiştir. gözlenen hızı ve değişim ölçüde bu nedenle sadece D 2 O adsorpsiyon 27,28 ölçütleri değildir. Üç bağımsız ssHDX-MS örnekleri standart sapma gösteren Şekil 3B&#39;de küçük hata çubukları, deney yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Döteryum Alım (%) b </td><td> N hızlı c </td><td> Hızlı c k </td><td> N yavaş c </td><td> Yavaş c k </td></tr><tr><td> MBT bir </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MBS, bir </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15.4 (0.7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % Değişim d </td><td> % 46 </td><td> % 18 </td><td> % 14 </td><td> % 75 </td><td> % 26 </td></tr></tbody></table> Tablo 2:. Mb formülasyonların ssHDX çalışmalarında döteryum alımının niceliksel ölçümleri bileşimi için Tablo 1&#39;e bakınız kuramsal maksimum b yüzde döteryum alım görece sağlam Mb göre HDX 144 saat sonra, 5 ° C,% 43 bağıl nem (n = 3 ile. , ssHDX-MS kinetik verilerin doğrusal olmayan regresyon tarafından belirlenen ortalama ± SD). c Parametreleri. Sağlam Mb için döteryum değişimi zamanı ders bieksponensiyaldir dernek modeli (Denklem. 2) takıldı. Parantez içindeki değerler. Regresyon parametrelerinin standart hataları ölçümlerde yüzde değişim calcul vardı dated 100 x [(MBS değeri - MBT değer) / (MBT gelen değer)]. MBT ve MBS için döteryum alım kinetik için regresyon parametreleri (N hızlı, N yavaş, hızlı, k ve yavaş k) Tablo 2&#39;de verilmiştir. N, hızlı ve N yavaş değerler MBT daha MBS, N yavaş farklılıkları daha olmasına rağmen değerleri N hızlı değerlerde farklılıklar daha fazla idi. N yavaş değer MBT daha MBS% 75 daha fazla iken Özellikle, N, hızlı değer, MBT daha MBS sadece% 18 daha fazladır. Bu MBT küçük K yavaş değerlerinin herhangi MBS D 2 O maruz kalan katkı maddeleri ile MB yapısı ya da amid gruplarının korunması daha yüksek tutma olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, detaylı mekanizmaları açıkça anlaşılamamıştır. Her iki formülasyonun için oran sabitleri (hızlı k ve yavaş k) çok benzerdir. peptid seviyesinde Döteryum alımı Pepsin sindirimi takiben 52 peptidlerin bir toplam tespit edilmiştir. MB dizisinin% 100&#39;e karşılık gelen altı artıklı olmayan fragmanlar burada rapor analizi için kullanıldı. Daha önce 24 eden grup tarafından rapor edilen bilgiye, üst üste binen parçaları kullanılarak elde edilebilir. Herbir peptid için toplam yüzde döteryum alımı hesaplandı ve 144 saat numunelerden elde edilen sonuçlar (Şekil 4A) çizilmiştir. Altı peptik parçaları için HDX kinetik &quot;yavaş&quot;, &quot;hızlı&quot; ve değişimi geçiren amid hidrojenin alt popülasyonlar ile tutarlı bieksponensiyaldir davranış (Şekil 4B), gösterdi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> Şekil 4: peptid seviyesinde Mb için ssHDX-MS: 6 olmayan Redu (A) yüzde döteryum alımıformülasyonlarda Mb gelen ndant peptik fragmanlar (gri) MBT ve MBS (beyaz) HDX 144 saat takip. Formülasyonlarda Mb altı olmayan gereksiz peptik parçaları için (B) ssHDX kinetik MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi). ssHDX zaman ders (SD ± n = 3) Grafik Pad Prism yazılımı sürüm 5 ile iki fazlı üstel dernek için bir denkleme takıldı. Olmayan şekilde peptitler için regresyon parametreleri Şekil 5&#39;te sunulmaktadır. Peptid kısımları için donatılmış hız sabitleri tek amidler, ortalama oranı sabit değildir gibi, peptik parçaları için gözlenen hız sabitleri doğrusal sağlam protein için olan ile ilişkili değildir. Formülasyonlar MBS (fragman 56-69 hariç) peptik parçalarının çoğu N hızlı değerler MBT (Şekil 5A) bu biraz daha fazlaydı. Benzer şekilde, k hızlı değerler genellikle formulatio arasında çok az bir fark gösterdiMb molekülünün (Şekil 5B) farklı bölgelerde ve ns. Ancak MBS N yavaş ve k yavaş değerler MBT (Şekil 5C ve 5D) için daha tüm parçaları önemli ölçüde büyüktür. anakartlardan yavaş yavaş N ve k önemli artış &quot;yavaş&quot; alışverişi havuzlarında amid gruplarının büyük hareketlilik yansıtabilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> Şekil 5: Mb peptik peptidler için ssHDX kinetik parametreleri: Yok hızlı (A), MBT (gri) ve MBS (N yavaş (C), hızlı (B) k ve formülasyonları Mb altı olmayan gereksiz peptik peptidler için ssHDX-MS kinetik verilerin doğrusal olmayan regresyon elde edilen yavaş (D) değerleri k beyaz) (n = 3, ± standart hata). &lt;/ P&gt; Sağlam protein düzeyinde fotolitik etiketleme LC-MS (Şekil 6A) ile tespit edildiği üzere Mb birden fazla MB-pLeu ilave maddelerin oluşturduğu 20x fazla pLeu varlığında ışınlandı. 20x pLeu etiketsiz Mb kütlesine 115, 230 ve 345 Da ilavesi ile 3 etiketlere geldi ile MBT için açılmış spektrumları 40 dakika için ışınlanmış. 20x ile benzer ışınlanmış MBS pLeu LC-MS ile tespit kadar 2 etiketli nüfusa sahip sağlam düzeyde az pLeu alımı gösterdi. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> Şekil 6: Sspl-MS sağlam MB: MBT (düz çizgi) ve 20x fazlası ile etiketlenmiş MBS (kesikli çizgi) için, (A) açılmış kütle spektrumları pLeu (% 5 w / w). Doğal Mb (Mb liyofilize edildi ve pLeu yokluğunda ışınlanmış) olarak açılmış kütle spektrumu noktalı çizgi olarak gösterilmektedir. U </em&gt; Radyasyona maruz bırakıldıktan sonra, etiketlenmemiş kalan proteinin bir popülasyonunu temsil eder. 1, 2 ve 3 pLeu etiket taşıyan protein popülasyonları, sırasıyla 1 litre, 2L ve 3L olarak temsil edilir. Formülasyonlarda olduğu gibi Mb (B) Sspl-MS kinetik MBT (kapalı daireler) ve pLeu konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak MBS (açık daireler). Bütün numuneler 40 dakika süre ile ışınlanmıştır. Hata çubukları, semboller içindedir. (C), formülasyonlar içinde sağlam Mb için Sspl-MS kinetik MBT (kapalı daireler) ve radyasyon, zamanın bir fonksiyonu olarak MBS (açık daireler) (ağ /% 20.7 a) liyofilize edildi ve 100x fazla pLeu varlığında ışınlandı. Hata çubukları, semboller içindedir. Kinetik çalışmalarda, etiketli proteinin yüzde artan ışınlama zamanında (Şekil 6B) ile MBT ve MBS hem katlanarak arttı. MBS her ışınlama zamanında MBT daha az pLeu alımı gösterdi. Her iki formülasyon da 40 dakikada bir düzlüğe ulaşmamıştır ortaya çıktı. Böylece, bir kinetik çalışma bize olabilir<html> eful tam pLeu aktivasyonunu elde etmek için gerekli olan ışınlama süresi belirlemek için. Etiketleme kinetiği pLeu konsantrasyonunun bir fonksiyonu (Şekil 6C) olarak alındı. etiketli proteinin yüzde MBT ve MBS hem pLeu konsantrasyonu artmıştır. Bununla birlikte, pLeu ağ / ağ 20.7% &#39;sinde, MBT pLeu alımında bir azalma olduğunu gösterdi. Bu, yüksek pLeu konsantrasyonda protein yüzeyinden pLeu hariç olmak üzere olabilir. Bu nedenle, pLeu arasında değişen konsantrasyonlarda bir çalışma yüzeyi hariç, protein yüzeyi üzerinde yeterli bir etiketleme sağlayan uygun pLeu konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Bu çalışmada, 20x fazla pLeu fazla peptid seviyesi çalışmalar için seçildi. Genel anakartlardan için gözlemlenen etiketleme pLeu içeren matris kötü yan zincir erişilebilirlik göstermektedir azalmıştır. Bu azaltılmış etiketleme ile sonuçlanır sorbitol mevcudiyetinde, konformasyonel bir değişim ile tutarlıdır. İçerik &quot;&gt; peptid düzeyinde Fotolitik etiketleme Sağlam protein etiketleme çalışmalara dayanarak, 20x aşırı pLeu peptid düzeyinde MBT ve MBS karşılaştırmak için seçildi. İşaretlenmiş örnekler tripsin ile sindirildi ve LC-MS ile analiz edilmiştir. MB dizisinin% 100&#39;e karşılık gelen 40 peptitlerin toplam MBT ve MBS örneklerde tespit edildi. Lys ve / veya Arg kalıntılarını büyük ölçüde etiketlenir, bazı durumlarda, triptik sindirme sınırlı protein sekansı kaplayabilir. Dizisi kapsamını iyileştirmek için, tripsin ve kemotripsin bir karışımı, etiketlenmiş bir protein sindirimi için kullanılabilir. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> Şekil 7: Mb için Sspl-MS peptid seviyesinde: Mb Çizgi temsil trehaloz (A) ve sorbitol (B) &#39;nin mevcudiyetinde, 20x fazla pLeu (ağ / ağ% 5) ile etiketlenir. İşaretlenmiş protein trypsi ile sindirildin ve etiketli peptidler Mb kristal yapısı (PDB Kimliği 1WLA) üzerine eşleştirilmiş. etiketli ve etiketsiz bölgeler sırasıyla, kırmızı ve yeşil renklidir. tripsin sindirimi ile Sspl-MS peptidler etiketli olma konusunda nitel bilgi sağlar. Sağlam düzeyde farklı etiketlenmiş popülasyonlar göz önüne alındığında, pLeu etiketlenmesi ve etiketlenmiş ve etiketlenmemiş peptidlerin iyonizasyon verimleri farklar rasgele mekanizması, sindirim sonrası Sspl-MS için niceliksel ölçümlerini elde etmek zordur. Ancak, nitel bilgiler hala peptid düzeyinde protein yapısal değişiklikler içgörü sağlayabilir. Bu çalışmada, MBT ve MBS hem formülasyonlar protein yüzey en genelinde pLeu alımı gösterdi. Mbs karşılaştırıldığında, peptid fragmanları 32-42, 134-139 ve 146-153 MBT gelen pLeu etiketleme (Şekil 7) gösterdi. Bu durum, bu amino asitlerin yan zincirleri aşağıdaki regio helislerin olarak pLeu maruz olduğunu göstermektedirns MBT matris içinde sağlam. Bunun aksine, MBS matris içinde pLeu etiketleme koruma, bu bölgelerde yapısal değişimleri ile tutarlıdır. Genel olarak, ssHDX-MS ve Sspl-MS sonuçları yöntemler omurgasına (ssHDX-MS) ve yan zincir (Sspl-MS), liyofilize edilmiş protein formülasyonlan içinde maruz kalma ve yardımcı madde etkisi ile ilgili tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü peptid seviyesi bilgi düşündürmektedir .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders at JoVE.com

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

15.6K Görüntüleme.  Purdue University. Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design. 

Video: Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Kimya

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

Dövme mürekkebi maddeleri ve taklit ürünlerin tanımlanması için kütle spektrometrik tespiti ile Iki adımlı Pyrolysis-Gas Kromatografi yöntemi

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Callinectes sapidus'ta Nöropeptitlerin Çok Yönlü Kütle Spektrometrik Araştırması

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Microsampling in Targeted Mass Spectrometry-Based Protein Analysis of Low-Abundance Proteins

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed using bead-based proteolysis prior to proteotypic peptide affinity-capture and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) determination. The procedure can be applied to both conventional dried samples using paper cards (e.g., dried blood spots [DBSs] and dried serum spots [DSSs]), as well as samples collected with newer sampling methods such as volumetric absorptive microsampling (VAMS). In addition to describing this procedure, the preparation of both trypsin beads and antibody-coated beads is presented in a step-by-step manner in this work. The advantages of the presented procedure are time-efficient proteolysis using beads and selective robust cleanup using peptide affinity-capture. The current procedure describes the determination of the low-abundance small-cell lung cancer (SCLC) biomarker, progastrin-releasing peptide (ProGRP), in dried serum (both DSSs and VAMS). Detailed procedures for bead preparation make it easier to implement the workflow in new applications or other laboratories. It is demonstrated that the results may be dependent on the sampling material; for the present project, higher signal intensities were seen for samples collected using VAMS compared to DSSs.

A protocol is presented for the determination of low-abundance biomarkers from dried serum samples exemplified with the biomarker progastrin-releasing peptide (ProGRP). Antibody-coated magnetic beads are used for the selective cleanup and enrichment of a proteotypic ProGRP peptide. The captured peptide is subsequently analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Düşük Bolluktaki Proteinlerin Hedeflenen Kütle Spektrometrisine Dayalı Protein Analizinde Mikro Örnekleme

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed ...