Name: 2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

Lütfen proje, verimli tartışmalar ve büyük denetleme oynadığı için Prof. Dr. Lothar Willmitzer kabul etmek istiyoruz. Bize proteomik MS ölçümleri ile yardımcı olduğunuz için Dr. Daniel Veyel için minnettarız. Bayan Änne Michaelis kim bize çok değerli teknik yardım LC-MS ölçümleri ile sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Dr Monika Kosmacz ve Dr. Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska için onların yardım ve orijinal el yazması ve çalışma katılımı için teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase.">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae.">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses.">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li><li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids.">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li><li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses.">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li><li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants.">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases.">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana.">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+13C,+15N+and+34S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification.">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana.">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. -. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).</li><li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan Protokolü hedef protein s ve PM kompleksleri paralel kimliği sağlar. Sonuçlar için klonlama üzerinden deneme az 8-12 hafta olarak tamamlanabilir. Tam AP yaklaşık 4-6 h 12-24 örnekleri, bir dizi için bizim protokol orta üretilen iş analizi için uygun işleme alır.
İletişim kuralının rağmen varlık genel olarak basit bir dizi kritik adım vardır. (i) yeterli miktarda giriş protein ve benzeşme boncuk metaboliti algılama dinamik bir dizi ulaşmak çok önemlidir. Etkin hücre lizis bu nedenle yordamı çok önemli bir adımdır. Zavallı protein verimleri yetersiz pulverizasyon malzeme veya suboptimal lizis-tampon/malzeme oranı bir sonucu olabilir. (ii) kullanılan reaktifler MS-dostu olduğunu özen gösterilmelidir. MS algılama ile müdahale güçlü deterjanlar, gliserol veya aşırı miktarda tuz kaçınılmalıdır. (iii) özel boncuk adımları yıkama sırasında aşırı kuru olmamalı, ve bir vakum manifold kullanırken bu şekilde değil boncuk yok veya karmaşık istikrar etkilemek için bir yavaş akış hızı uygulamak önemlidir.
Bazı önemli olası değişiklikler için sunulan Protokolü vardır: (i) kurucu CaMV35S organizatörü yem protein miktarı en üst düzeye çıkarmak için kullanıyoruz. Overexpression, çok yararlı olsa da, hücre homeostazı28 üzerinde ciddi etkiler ve fizyolojik alakasız etkileşimleri oluşumuna yol. İfade tagged proteinlerin kullanarak yerel rehberleri ve nerede mümkün bir işlev kaybı arka planda gerçek biyolojik interactors almak için üstün olarak kabul edilir. Bitki hücre kültürleri içinde normalde proteinlerin için bitki arka plan ilgili interactors tanımlamak gerekli olabilir. (ii) zar proteinleri ile çalışırken, bir MS uyumlu deterjan ile takıma girecek lizis arabelleği gerektiriyor. (iii) ikinci bir benzeşme arıtma adım getirilmesi yanlış-mutlak gerçek pozitif oranı geliştirmek ve EV denetimleri29ihtiyacını ortadan kaldırmak. Bir roman tandem etiketi iki bağımsız proteaz-bölünme site ile zahmetli ve zaman alıcı tarafından Maeda vd. 201411, ekledi boyut-dışlama Kromatografi adım için cazip bir alternatif sunar.
AP'nin en ciddi sıkıntıları yanlış pozitif yüksek oranıdır. Nedenleri çoktur. Bünye overexpression zaten belirtilmiştir. Başka bir kaynak fizyolojik alakasız etkileşimlerin izole organelleri ile çalışma sürece bütün hücreli lysates karışımları proteinler ve metabolitleri üzerinden farklı hücre altı bölmeleri içeren hazırlıktır. Hücre altı yerelleştirme için doğru interactors süzmek için kullanılır. Yine de, yanlış mutlak çoğunluğu özel reçineler ve proteinler arasında belirsiz bağ neden. İkinci bir arıtma adım giriş yukarıda açıklandığı gibi sorunun en iyi çözümü sunmaktadır, ancak zaman ve işlem hacmi pahasına geliyor. Ayrıca, protokol uzatır gibi zayıf etkileşim kaybolabilir. AP'nin başka bir uyarı sağladığı hakkında kapsamlı bilgi hedef protein rağmen interactome, baited protein doğrudan ve dolaylı hedefler arasında differentiating mümkün olmadığı. Hedeflenen bimolecular yaklaşımlar etkileşimleri onaylamak için ihtiyaç vardır.
MS tabanlı metabolomics ile birleştiğinde AP protein-kompleksleri S. cerevisiae12. çalışırdım Benzer şekilde lipidler için polar ve yarı polar bileşikleri hücresel lysates izole protein kompleksleri bağlı kalmasını, bizim daha önceki gözlem13 ile birlikte bu iş için sunulan iletişim kuralı kavramsal zemin sağladı. Bizim iletişim kuralı tarafından üç benzersiz noktaları ile karakterize: (i) buna karşılık12Maya için iş, AP sadece hidrofobik ama aynı zamanda hidrofilik protein ligandlar almak için uygun olduğunu gösterir. (ii) üç tek ayıklama Protokolü tanıtarak, tek bir AP protein ve metaboliti interactors yem protein eğitim için kullanılabilir. (iii) Biz hücreleri bitki Protokolü uyarlanmış.
Gelecekteki çabalar bir roman tandem etiketi ile iki bağımsız proteaz-bölünme site oluşturmaya özen gösterin. Ayrıca bitki hormonları gibi düşük-bereket küçük moleküllere protokol uygunluğu keşfetmek istiyorsunuz.

Yöntem tanımlamak burada amaçları çevre -In-vivo hücresel lysate koşullar seçtiğiniz bir proteinin metaboliti ve protein ortak tanımlaması. Bu bugün karakterize daha çok daha fazla metabolitleri önemli düzenleyici fonksiyonu1var spekülasyonlar. Metabolitleri etkinlik, işlevsellik ve/veya onların reseptör proteinler2,3,4yerelleştirme değiştirme biyolojik anahtarları hareket edebilir. Son on yılda birkaç atılım Yöntem, kimlik PMI vivo içinde veya çevre -In-vivo koşullarda etkinleştirme Gelişmiş5olmuştur. Mevcut yaklaşımları iki gruba ayrılabilir. İlk grup roman protein ortakları tuzak için bilinen-metaboliti yem ile başlatmanız teknikleri kapsar. Benzeşme Kromatografi6, uyuşturucu benzeşme duyarlı hedef-istikrar tahlil7, kemoterapi-proteomik8ve termal Proteom9profil oluşturma yöntemleri içerir. İkinci grup küçük molekül ligandlar10,11tanımlamak için bilinen bir protein ile başlayan tek bir yöntemi içerir.
MS tabanlı lipidomics ile birleştiğinde AP protein-lipid kompleksleri Saccharomyces cerevisiae12. çözümlemeye Bir başlangıç noktası olarak maya suşları 21 enzimler içinde biyosentezi ergosterol dahil ifade yazarlar kullanılan ve 103 kinaz bir tandem-benzeşme saflaştırma (TAP) etiket erimiş. enzimlerin % 70 ve kinazlar % 20'si ışık karmaşık protein-lipid etkileşim ağı akıtan farklı hidrofobik ligandlar bağlamak için bulunamadı.
Daha önce benzer şekilde lipidler için polar ve yarı polar bileşikleri de hücresel lysates13izole protein kompleksleri bağlı kalmasını, göstermek olabilir. Bu bulgulara dayanarak, AP optimize etmek karar yöntemi daha önce bitki hücreleri ve hidrofilik bileşikler14için10,11 yayınlandı. Bu amaçla, biz dokunun vektörel çizimler başarıyla kullanılan bitki PPI çalışmaları15Van Leene ve ark. 2010, tarafından açıklanan kullanılır. Transgenik hatlarını edinmeniz gereken süreyi kısaltmak için Arabidopsis hücre kültürleri üzerinde karar verdi. Çalıştırmaya başladık bir tek adımlı metil tert-butil eter, tek bir protein (Pelet), lipitler (Organik faz) ve hidrofilik metabolitleri (sulu faz)16 karakterizasyonu izin (MTBE) / metanol/su ekstraksiyon yöntemi, benzeşme arıtma deney. EV kontrol şeritleri yanlış pozitif, Örneğin tek başına etiket bağlayıcı proteinler dışlamak için kullanılmaya başlanmıştır. Biz üç (beş) öğesini kavram kanıtı olarak nükleozit nükleotittir kinaz mevcut Arabidopsis genom (NDPK1-NDPK3). Diğer bulgular arasında biz NDPK1 glutatyon Sile etkileşim göstermek olabilir-transferaz ve glutatyon. Sonuç olarak NDPK1 glutathionylation14' e tabi olduğunu kanıtlayabilir.
Özetlemek gerekirse, sunulan Protokolü protein-protein ve protein-küçük-molekül etkileşim ağları karakterize için önemli bir araçtır ve varolan yöntemleri üzerinde büyük bir ilerleme oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthylacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 protease inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&amp;nbsp;Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Platform Shaker</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &amp;micro;M, thickness 55 &amp;micro;M, open area 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Custom order</td><td></td></tr><tr><td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &amp;micro;M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol &quot;&quot;Classic&quot;&quot; with 2 different screw caps without filters</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filter (small) 35 &amp;micro;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &amp;amp; M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotary dishes for rotators SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td><td>Restek&amp;nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&amp;nbsp;Vials</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&amp;ouml;r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC system&amp;nbsp;</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>Custom order</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &amp;micro;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>186003533</td><td></td></tr><tr><td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

Hücresel proteinler, metabolitleri ve nükleik asitler gibi biyolojik moleküller arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenmektedir. Protein-protein etkileşimleri (PPI) soruşturma yok yenilik olmakla birlikte, endojen protein-metaboliti etkileşimleri (PMI) karakterize amaçlayan deneysel yaklaşımlar oldukça yeni bir gelişme oluşturmaktadır. Burada, biz aynı anda karakterizasyonu PPI ve PMI yem olarak anılacaktır seçtikleri bir proteinin sağlayan bir protokol mevcut. Arabidopsis hücre kültürleri ve benzeşme arıtma (AP) birleştirir bizim iletişim kuralı (MS) kütle spektrometresi ile optimize edildi-protein ve metaboliti algılama dayalı. Kısacası, bir benzeşme etiketi için erimiş yem protein ifade transgenik Arabidopsis satırları ilk yerel hücresel özü elde etmek için lysed. Anti-etiket antikorlar yem protein protein ve metaboliti ortakları çekmek için kullanılır. Benzeşme saf kompleksleri bir tek adımlı metil tertkullanarak ayıklanır-bütil eter (MTBE) / metanol/su yöntemi. Kutup veya hidrofobik faz metabolitleri ayrı iken, proteinler Pelet içinde bulunabilir. Metabolitleri ve proteinler ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tarafından (UPLC-MS veya UPLC-MS/MS) analiz edilir. Boş-vektör (EV) kontrol şeritleri yanlış pozitif dışlamak için kullanılır. Bizim Protokolü en büyük avantajı fizyolojik şartlarda (hücresel lysate) paralel bir hedef protein protein ve metaboliti ortakların kimlik sağlar olduğunu. Sunulan yöntemi basit, hızlı ve kolayca bitki hücre kültürleri dışındaki biyolojik sistemleri için adapte edilebilir.

Orijinal çalışmada, üç A. thaliana NDPK genler PSB-L hücre süspansiyon kültürlerinde bünye 35S organizatörü14 (Şekil 1) kontrol altına overexpressed. Tandem benzeşme etiket carboxy - veya amino-terminal bir ucunu bir yem protein için erimiş. Benzeşme saf kompleksleri MTBE/metanol/su ekstraksiyon16için tabi tutuldu. Proteinler ilgi çekti ve küçük moleküller MS (Tablolar S2 ve S3) kullanarak tespit edilmiştir.
Yanlış pozitif olarak düzeltmek için küçük molekül kirletici kimyasallar ve laboratuvar sarf malzemeleri dışlamak için boş örnekleri kullanılmıştır. Ayrıca, metabolitleri ve ya bir benzeşme etiketi bağlamak veya yalnız reçine proteinler EV kontrol şeritleri kullanarak sorumluydu. Gerçek pozitif durumlar, iki kuyruklu sigara eşleştirilmiş öğrenci t-testi ve Benjamini & Hochberg yanlış bulma oranı almak için düzeltme metabolitleri (Tablo S4) ve önemli ölçüde NDPKs AP zenginleştirilmiş proteinler (Tablo S5) tanımlamak için uygulanan (N - ve C-ölümcül NDPKs öğesini) deneyler ile karşılaştırıldığında EV kontrol şeritleri (FDR < 0,1). Önceki çalışma, biz devamsızlık/varlığı ölçüt protein ve küçük molekül interactors betimlemek için kullandığını unutmayın.
Temsilcisi sonuçları için NDPK1, dipeptides, bizim grupta okudu küçük molekül düzenleyiciler roman bir sınıfın metaboliti veri odaklanmak süre verilir. Proteomik çözümleme NDPK1 26 sözde protein ortaklarının ortaya. Co NDPK1 aynı hücre altı yerde lokalize proteinler için daha fazla filtreleme tarafından (sitozol), listenin 13 sözde protein interactors aşağı daralmış. Glutatyon Sarasında saptanan proteinler vardı-transferaz, iki uzama başlama faktörleri, tübülin ve aconitate hidrataz. Metabolomic çözümleme ortaya dört dipeptides Val-Leu, Ile-Glu, Leyi-Ile ve Ile-bu özellikle birlikte eluted Phe NDPK1 ile (Şekil 2). Tüm dört dipeptides onların N-terminus paylaşılan bağlama özgüllük düşündüren, hidrofobik bir kalıntı paylaşmak unutmayın.
Bakmak için bilinen protein-protein ve protein-metaboliti kompleksleri için biz sorgulanan 13 proteinler ve dikiş veritabanı25 (Şekil 3) karşı dört dipeptides tespit edilmiştir. Birkaç gözlemler yapılmış olabilir: (i) interactors hiçbiri daha önce NDPK1 için bildirildi. (II) APX1 ortholog aldehid dehidrojenaz aile üyesi ALDH7B4, çeviri başlatma faktörü FBR12 faktörle gen AT2G40290 tarafından kodlanmış başka bir çeviri başlatma sırasında etkileşimli olarak bildirildi. (iii) tanımlanan dipeptides Hayır protein ortakları bildirdi. Ortak eluted dipeptides daha önce herhangi bir erişim tarihi bitki proteini ilişkili rapor değil. Ancak, diğer canlılar arasında önemli rol oynarlar: Leu-Ile, Örneğin, bir insan hücre satırı26' neurotrophin harekete geçirmek bir etkisi vardır. Not deneme sistemi tam topolojisi tanımlama izin vermez. Örneğin, bir dipeptid NDPK1 ile doğrudan etkileşim olabilir ama herhangi bir ortak saf protein de ilgili olabilir.
Birlikte ele alındığında, bizim sonuçları AP kütle spektrometresi ile birlikte istihdam kurulan yordamı protein-protein ve protein-küçük-molekül interactors tanımlaması kolaylaştırır ve yardımcı olur hakkında geniş bilgi oluşturmak göster hedef protein interactome.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Şekil 1. AP-MS iş akışı şeması. (A) bir yerel çözünür kesir bitki hücre kültürü üzerinden hazırlanması. (B) AP yordam sonraki adımda. Örnek sütuna yükledikten sonra bir dokunun etiketi erimiş faiz (POI) protein üzerinde özel boncuk immobilize IgG antikor bağlar. Çamaşır sütun ilişkisiz proteinler ve metabolitleri kaldırılmasını kolaylaştırır. AcTEV bölünme gerçekleştirdikten sonra POI protein-metaboliti kompleksleri eluted. Kompleksleri (C) ayrılması protein ve metaboliti kesir yarı kantitatif MS Analizi tarafından takip içine. Bu rakam bir parçası tekrar Luzarowski ve ark. 201714oluşturulur. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Şekil 2. Özellikle NDPK1 ile birlikte eluting dipeptides. Dört dipeptides Val-Leyi (A), Ile-Glu (B), Leyi-Ile (C)ve Ile-Phe (D) AP deneyde ölçülen ortalama yoğunluklarda çizildi. Tüm dört dipeptides NDPK1 örnekleri EV denetimine göre önemli zenginleştirme göstermek (yıldız işareti temsil FDR < 0,1). Hata çubukları temsil eden 6 ölçümler için standart hata (N-3 çoğaltır ve 3 / C-ölümcül proteinler öğesini). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Şekil 3. Tüm molekülleri NDPK1 ile birlikte eluting etkileşim ağı yalnızca önceki göz önünde bulundurarak dikiş veritabanında sorgulanan deneysel ve veritabanı delilleri (güven > 0,2). Daha yüksek güven daha yüksek etkileşim olasılığını gösterir ve yatırılan veriler temel alınarak hesaplanır. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S1. MaxQuant tablo "parameters.txt" çıktı. Tablo tanımı ve miktar gibi kullanılan veritabanları hakkında bilgi için eşik değerlerini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S2. Bilgi MaxQuant dan çıkış tablo "proteinGroups.txt". Tablo tüm saptanan protein grupları, yoğunluklarda ve benzersiz peptidler ve puan sayısı gibi ek bilgileri listesini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S3. Kutup metabolitleri analizini içeren çıkış dosyası. Tablo tüm tanımlanan kitle özellikleri belirli m/z, RT ve yoğunluğu ile karakterize bir listesini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S4. Dipeptides hangi NDPK1, NDPK2 veya NDPK3 yem olarak kullanılan AP örnekleri buldum. Dipeptides boş örnekleri mevcut listeden dışlanan. Her NDPK için iki bağımsız çizgi (ya da N - veya C-terminus öğesini) nüsha işletilmiştir. Öğrenci t-test ve daha fazla pdüzeltilmesi-Benjamini kullanarak değer & Hochberg yöntemi NDPKs önemli ölçüde zenginleştirilmiş interactor ortakları belirlemek için kullanılmıştır (FDR < 0,1). Verilen ΔRT başvuru bileşikleri ve Δppm kitle Metlin27' verilen monoisotopic ile ilgili olarak ilgili olarak hesaplanır. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S5. NDPK1 ile birlikte saf protein. Her NDPK için iki bağımsız çizgi (ya da N - veya C-terminus öğesini) nüsha çalıştırmak. Öğrenci t-test ve daha fazla pdüzeltilmesi-Benjamini kullanarak değer & Hochberg yöntemi NDPKs önemli ölçüde zenginleştirilmiş interactor ortakları belirlemek için kullanılmıştır (FDR < 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

Video: 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Biyokimya

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is also a key component in the development of new therapeutics. The evolving era of functional proteomics is fueling the demand for high-throughput protein purification and improved techniques to facilitate this. It was hypothesized that a multi column plate adaptor (MCPA) can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. This method offers an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum, rivaling the speed of an automated system. The MCPA can be used to recover milligram yields of protein by an affordable and time efficient method for subsequent characterization and analysis. The MCPA has been used for high-throughput affinity purification of SH3 domains. Ion exchange has also been demonstrated via the MCPA to purify protein post Ni-NTA affinity chromatography, indicating how this system can be adapted to other purification types. Due to its setup with multiple columns, individual customization of parameters can be made in the same purification, unachievable by the current plate-based methods.

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

<meta charset="utf8"></head><body>His etiketli FEN1 proteininin verimli bir şekilde saflaştırılması için FPLC'nin optimize edilmesi

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: His Etiketli FEN1 Proteini için Afinite Kromatografisini Optimize Etme

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biyoloji

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Protein Kompleksi belirlenmesi

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu