Yazarlar yararlı konuşmalar Prof. Thomas Reiner, Jacob Houghton, Dr. Serge Lyaschenko teşekkür ederim.

Tarif in vivo hayvan deneylerinde tüm onaylanmış protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kurallar altında göre yapıldı. J591 için DFO-NCS 1. Konjugasyon <ol><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 x fosfat tamponlu tuzlu çözelti (pH 7.4) ya da 0.5 M HEPES tampon (pH 7.4) ya da 1 ml J591 bir 2-5 mg / ml bir solüsyon hazırlanır. </li><li> 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml) arasında bir konsantrasyonda kuru DMSO içinde bulunan DFO-NCS ile çözülmüştür. Sonikasyon veya girdap tamamen çözünmesini kolaylaştırmak için iyice çözelti. </li><li> Az miktar 0.1 M Na-2 (&lt;10 | il) CO 3 eklenerek 8,8-9,0 için J591 çözeltinin pH ayarlayın. </li><li> Antikor çözeltisi doğru pH değerinde sonra, çift işlevli çelatör ve bir 3-4 kat molar fazlalık karşılık gelen DFO-NCS bir çözelti hacminin ilave edin. <ol><li> Sınavaple, bir 2 mg / ml J591 antikor çözeltisi, 1 ml (13.3 nmol J591) için 10 mM (7.6 mg / ml) DFO-NCS çözeltisi (40.4 nmol DFO-NCS), 4-5 ul ekle. Nihai sulu reaksiyon karışımı içinde DMSO miktarının% 2 v / v geçmemelidir. </li></ol></li><li> 350 rpm&#39;de çalkalanarak bir ısıtma bloğu üzerinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat sonra, yıkama sıvısı olarak 0.5 M HEPES tampon (pH 7.4) kullanılarak, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir önceden paketlenmiş tek boyut dışlama tuz giderme kolonu kullanılarak elde edilen immünokonjugat temizler. Bu adım tamamlandıktan J591-DFO yapısının bir 2 ml solüsyon verecek. </li><li> UV-Vis spektrofotometre üzerinde inşa J591-DFO konsantrasyonu ölçün. </li><li> Yapının daha yüksek bir konsantrasyonu istendiğinde, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak J591-DFO çözelti konsantre edilir. </li><li> Karanlıkta -20 ° C&#39;de tamamlanan J591-DFO immünokonjügenin çözümü saklayın. </ol> 89 Zr 2. Radyo-etiketlenmesi J591-DFO DİKKAT: protokolün Bu adım işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden veya ev kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile danışmalısınız radyoaktivite araştırmacılar ile başka bir iş yapmadan önce. Mümkün olan tüm adımlar iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. NOT: Uygun radyokimyasal not tutma adına, örnekteki radyoaktivite miktarı, bir doz kalibratörü kullanılarak ölçüldü ve kaydedildi edilmelidir aşağıdaki protokol Adımlar 2,2-2,13 sonra. Bu radyokimyasal verim ve belirli faaliyetlerin doğru kararlılıkla yardımcı olacaktır. <ol><li> 0.5 M HEPES tamponu, pH 7.5, 200 ul J591-DFO 0.5-2.0 mg ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li><li> Hacmi Pipet &lt;2 ml&#39;lik plastik bir vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü içine 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) karşılık gelen (tipik olarak 1.0 M oksalik asit bulunur) destek&gt; 89 Zr 4+ stok çözeltisi. 1.0 M oksalik asit kullanılarak toplam 300 ul bu çözümün ses seviyesini ayarlayın. </li><li> 1,0 M Na-2 CO 3 ile 6,8-7,5 89 Zr 4+ çözeltinin pH ayarlayın. Istenen pH&#39;ı elde etmek üzere bir baz alikotları daha küçük (&lt;10 ul) ekleyin daha sonra 89 Zr 4+ çözeltisine CO 3 1.0 M Na-2 250 ul ekleyerek başlayın ve. </li><li> Aşama 2.1&#39;de elde J591-DFO çözeltisine pH ayarlı 89 Zr 4+ solüsyonunun arzu edilen miktarı ekleyin. </li><li> Bu 6,8-7,5 istenen aralık içine düşmesi için emin olmak için, radyo-etiketleme, reaksiyon karışımının pH değerini kontrol edin. </li><li> 350 rpm&#39;de çalkalanarak bir ısıtma bloğu üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika süre ile, radyo-etiketleme reaksiyonu inkübe edin. </li><li> Kuluçkadan 60 dakika sonra, uçucu ölçmekRadyo-TLC kullanarak reaksiyonun ürünü iolabeling. <ol><li> Bu amaçla, bir silis emdirilmiş TLC şeridinde, radyo-etiketleme, reaksiyon karışımının 1 uCi nokta. 50 mM DTPA (pH 5.5) bir yıkama sıvısı kullanılarak TLC çalıştırmak, kısım kurumasını bekleyin ve bir radyo-TLC tarayıcı kullanarak TLC şerit analiz. 89 Zr 4+ kökenli görünecektir J591-DFO yapı bağlı (R &lt;Zr 89 serbest 4+ katyonlar DTPA ile şelatlı edilecek ve çözücü ön (R f ile Zehir olurken 0.1),&gt; 0.9) f. </li><li> , Radyokromatogramdır entegre eğrinin altındaki toplam alan ile 0,0-0,1 f R eğri altında kalan alan bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile reaksiyonun Radyoetiketleme verimi,. </li></ol></li><li> Radyoetiketleme verimi, yeterli (tipik olarak&gt; 2 mCi / mg teorik spesifik aktivite) olması durumunda, 50 mM DTPA, pH 5.5, 5 ul ile reaksiyonun söndürülmesi. </li><li> Elde immünokonjugat usi arındırınng, 5 mg / mL gentisik asit ile 5 mg / mL gentisik asit veya 0.25 M sodyum asetat (pH 5.5) ile% 0.9 steril tuzlu su ya da bir yıkama sıvısı kullanılarak bir 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir önceden paketlenmiş tek boyut dışlama kullanımlık tuz alıcı sütun . Bu adım tamamlandıktan 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate bir 2 ml solüsyon verecek. </li><li> Aşama 2.7 de tarif edildiği gibi saflaştırmadan sonra, radyo-TLC kullanarak 89, Zr-DFO-J591 radyokimyasal saflığının doğrulanması. </li><li> Ilk olarak saflaştırılmış 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate izole radyoaktivite miktarına göre antikor çözeltisine ilave etkinlik miktarını bölerek reaksiyonun tüm Radyoetiketleme verimi,. </li><li> Radyoetiketleme reaksiyonunda DFO-J591 ilk kütle itibariyle arındırılmış 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate izole aktivitesi miktarının bölünerek nihai spesifik aktivite hesaplanır. </li><li> Daha yüksek bir konsantrasyonu, arzu edildiği takdirde, inci konsantreE 89 50000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak, Zr-DFO-J591 çözeltisi. NOT: Son arıtma aşamasında kullanılan gentisik asit nedeniyle radyoliz antikorun zararın en aza düşürülmesi için kullanılan bir radyo-koruyucu olduğu 46 da 4 ° C &#39;de en fazla 48 saat için 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate depolanması. mümkün, bu tavsiye edilmez. Radioimmunoconjugate saklanabilir ise, hipoklorit aracılı radyoliz riskini en aza indirmek amacıyla, depolama tamponu olarak, 5 mg / mL gentisik asit 0.25 M sodyum asetat (pH 5.5) kullanın. 47 </li></ol> 89 Zr-DFO-J591 ile Vivo PET Görüntüleme 3. DİKKAT: Protokol Bölüm 2&#39;de olduğu gibi, protokol, bu adımı işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Tüm possible adımlar iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. <ol><li> Erkek atimik çıplak farelerde deri altından, 5 x 10 6 LNCaP prostat kanser hücreleri implant ve bu (3-4 hafta, aşılamadan sonra) 100-150 mm3 xenograft büyümeye izin verir. 44 &#39; </li><li> % 0.9 steril tuzlu su içinde 1.0 mCi / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate seyreltin. </li><li> 89, Zr-DFO-J591 çözeltisi (200 uCi, 7.4 MBq) 200 ul enjekte edilir. Nakil doku taşıyan kobay farelerinin yanal kuyruk damarı içine 48 </li><li> Istenen görüntüleme zaman noktasında (örneğin, 12, 24, 48, 72, 96 ya da 120 saat sonra enjeksiyon), bir% 2 izofluran ile anestezi fare: oksijen gazı karışımı. </li><li> Küçük hayvan PET tarayıcı yatakta farenizle ve% 1 izofluran kullanarak tarama sırasında anestezi korumak: Oksijen gazı karışımı. Tarayıcı yatakta hayvan yerleştirerek önce, ayak-tutam yöntem ve Uyg kullanarak anestezi doğrulamakanestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri y oftalmik merhem. 49 </li><li> 350-700 keV enerji penceresi ve 6 nsaniye bir tesadüf zamanlama penceresini kullanarak 40 milyon tesadüf olaylar minimum statik tarama yoluyla fare PET veri elde. 50 </li><li> Görüntü yakalanmasını tamamladıktan sonra, gözetimsiz fare bırakmayın ve bilinci kazanmış kadar diğer fareler ile bir kafese koymayın. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Inşaat, Radyoetiketleme ve görüntüleme 89 Zr-DFO-etiketli radioimmunoconjugates oldukça basit prosedür genellikle iken, bu sürecin her aşamasında akılda birkaç önemli hususlar tutmak önemlidir. Örneğin, diyelim prosedürün konjugasyon aşamasında endişe en muhtemel nedeni birleşme reaksiyonu sırasında antikorun toplanmasıdır. Bu sorun, genellikle DFO-NCS stok çözeltisi ilave edildikten sonra birleşme reaksiyonu zayıf bir karıştırma ürünüdür. Bu durumda, DFO-NCS homojen olmaya...

Dolayı belirgin bir duyarlılık, afinite ve seçicilik için, antikorlar çok kanser hücrelerine radyoizotoplar verilmesi için gelecek vaat eden vektörler olarak kabul edilmiştir. Ancak, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme başvurularının kendi etiketleme için uygun bir pozitron yayan radyoizotop eksikliği engel olmuştur. Radioimmunoconjugates tasarımında en kritik hususlar 1-3 birisi fiziksel çürüme eşleştirme yarı antikor in vivo farmakokinetik radyoizotop hayatı. Daha özel olarak, antikorlar, çoğu zaman, nispeten uzun, çok günlük biyolojik yarılanma ömürlerine sahiptir ve bu nedenle benzer fiziksel yarı ömrü olan radyoizotoplar ile işaretlenmelidir. PET görüntüleme uygulamaları için, antikorlar geleneksel 64 Cu (t 1/2 = 12.7 saat), 86 Y (t 1/2 = 14.7 saat), ya da 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4 ile radyoaktif işaretli olmuştur, 5 Bununla birlikte, her birBu radyoizotoplar klinik görüntüleme için uygunlukları engel önemli sınırlamalar sahiptir. 86 Y ve 64 Cu ile etiketlenmiş radioimmunoconjugates Klinik öncesi araştırmalarda umut verici kanıtlamış olmakla birlikte, her iki izotoplar insanlarda görüntüleme için etkili olduğu için çok kısa olan bir fiziksel yarılanma ömürlerine sahiptirler. 124 I, aksine, bir hemen hemen ideal fiziksel bir yarı ömre sahip antikorlar ile görüntüleme, ama pahalı ve nispeten düşük çözünürlüklü klinik görüntüleri neden optimal çürüme özelliklere sahiptir. Bundan başka, 124-işaretli radioimmunoconjugates, in vivo olarak tümör-zemin aktivitesi oranını düşürebilir bir işlem ite tabi olabilir. 6,7 Sürücü 64 Cu, 86 Y yerini bir pozitron yayan radyoizotop bulmak ve radioimmunoconjugates 124 Ben 89 Zr-etiketli antikorlar araştırma son dalgalanma körükledi. 8-12 T89 Zr habercisi de nedeni basittir: radiometal tanısal PET radioimmunoconjugates kullanım için ideale yakın kimyasal ve fiziksel özelliklere sahip 13 89 Zr 89 Y (p, n) bir kullanan bir siklotron 89 Zr reaksiyonu vasıtasıyla üretilir. ticari olarak temin edilebilen ve% 100 doğal olarak bol miktarda 89 Y, hedef. 14,15 radiometal,% 23 pozitron verim vardır 78.4 saatlik bir yarılanma ömrü ile azalır ve 395,5 keV (Şekil 1) nispeten düşük enerji pozitronlar neşreden. 13,16,17 Bu 89 Zr, aynı zamanda yüksek bir enerji yayar ki dikkat etmek önemlidir, 909 keV γ-ray% 99 verim ile. Bu emisyon yayılan 511 keV fotonlar ile enerjik karışmaz iken, ulaşım, taşıma, ve dozimetrisi ile ilgili ekstra dikkate gerektirir. Bu uyarı rağmen, bu çürüme özellikleri sonuçta 89 Zr daha olumlu bir h sahip değil sadece anlamınaCu 86 Y ve 64 den antikorlar ile görüntüleme için alf-hayat değil, aynı zamanda yüksek 687 ve 975 keV enerjilerin yanı sıra 100-150 keV içinde enerjiler ile fotonların sayısı ile pozitron yayan, hangi 124 Ben daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilir 511 keV pozitron oluşturulan fotonlar. 13 Dahası, 89 Zr onun radyoaktif iyot meslektaşı daha etkili de tümörlerde, işlemek için daha güvenli üretmek için daha az pahalı ve residualizes olduğunu. 89 Zr 18,19 potansiyel bir sınırlama yok ki terapötik isotopologue, örneğin, 86 Y (PET) vs 90 Y (tedavi). Bu onların tedavi meslektaşları için dozimetrik izciler olarak istihdam edilebilir kimyasal özdeş, vekil görüntüleme ajanları yapımını engeller. O dedi, araştırmalar 89 Zr-etiketli antikorlar 90 Y- ve 177 Lu-etiketli immünoeşlenikler görüntüleme suretler olarak potansiyeli var olduğunu göstermektedir.20,21 Kimyasal bir bakış, bir grup IV metal, 89 Zr, sulu çözelti içinde bir 4 katyon olarak bulunur. Zr 4+ iyon yüksek, nispeten büyük (etkin iyonlu yarıçapı = 0.84 A) doldurulur ve bir &quot;sert&quot; katyon olarak sınıflandırılabilir. Bu nedenle, bu sekiz sabit anyonik oksijen donör kadar taşıyan ligandlar için bir tercih sergilemektedir. Kolayca 89, Zr-etiketli radioimmunoconjugates en sık kullanılan kenetleme maddesi desferrioksamin olan (DFO), üç hidroksamat grubu taşıyan bir siderofor türetilmiş asiklik şelatör. Ligand stabil biyolojik ilgili pH seviyelerinde oda sıcaklığında hızlı ve temiz Zr 4+ katyon koordinatları ve ortaya çıkan Zr-DFO kompleksi tuz, kan serumunda birden fazla gün boyunca sabit kalır ve tam kan. 22 Hesaplamalı çalışmalar kuvvetle öneririz DFO metal merkez üç neut koordinatlanmış olan Zr 4+ bir hexacoordinate kompleks oluşturmasıRal ve ligand üç anyonik oksijen donör olarak, iki ekzojen su ligandlar (Şekil 2). 23,24 89 Zr-DFO çekimleri iskele istihdam radioimmunoconjugates in vivo davranış genellikle mükemmel olmuştur. Bununla birlikte, bazı durumlarda, görüntüleme ve akut biyolojik dağılım çalışmaları 89, Zr-etiketli antikorlar ile enjekte edilen farelerin kemik yükseltilmiş aktivite düzeylerini Zr 4+ katyon, daha sonra in vivo olarak kenetleme salınır ve 89 osteophilic mineralleşir düşündürmektedir verileri ortaya koymuştur Kemikte. sekiz oksijen donör literatürde adı geçen 25 en son, yeni 89 Zr 4+ kenetleme geliştirilmesine yönelik araştırmalardan bir dizi özel olarak, şu anda Bununla birlikte, 24,26,27. ligandları DFO en yaygın olarak kullanılan şelatördür 89 yılında bir farkla radioimmunoconjugates Zr-etiketli. Farklı bir dizibioconjugation stratejileri bioorthogonal tıklama kimya, antikorda sistein ile inşa tiol-reaktif DFO reaksiyonu ve ester taşıyan DFO antikorda bir lisin ile inşa aktif reaksiyonunu da dahil olmak üzere antikorlar DFO eklemek için kullanılmaktadır. 4,28- 30 kolayca en yaygın strateji, ancak, 22 sağlam Bu ticari olarak temin edilebilen iki fonksiyonlu kenetleyici. DFO, DFO-NCS bir izotiyosiyanat taşıyan bir türevinin kullanılması ile (Şekil 2) olan ve güvenilir bir şekilde bir lisin ile sabit, kovalent tioüre bağlar oluşturan olan antikoru (Şekil 3). Son birkaç yıl içinde, 89, Zr-DFO-işaretli radioimmunoconjugates çok çeşitli literatürde bildirilmiştir. Klinik öncesi araştırmalar gibi CD105-hedefleme T gibi cetuximab, bevacizumab ve trastuzumab daha ezoterik antikorların daha iyi bilinen arasında değişen antikorlar içeren, özellikle bol olmuşturRC105 ve 5A10 sPSA hedefleme. 30-36 Daha yakın zamanlarda, 89, Zr-DFO etiketli antikorlar kullanılarak erken faz klinik çalışmaların az sayıda literatürde ortaya çıkmıştır. 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89, Zr-DFO-ibritumomab tiuksetan ve 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Ayrıca, 89 ile diğer klinik çalışmaların bir dizi istihdam Özellikle, Hollanda&#39;da gruplar yayınladık çalışmalar Zr-etiketli radioimmunoconjugates prostat kanseri görüntüleme için PSMA hedefleme 89 Zr-DFO-J591 ve meme kanseri görüntüleme için HER2-hedefleme 89 Zr-DFO-trastuzumab ile Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi&#39;nde burada soruşturma da dahil olmak üzere, halen devam etmektedir. 23, Radyo-etiketli antikorlar, en çok 89, Zr-etiketli radyofarmasötik kalır Buna ek olarak, 30, radiometal da artan bir peptit, protein, ve nano malzemelerin de dahil olmak üzere başka vektörler ile kullanılmıştır. 38-43 </sup&gt; Bu 89 Zr-DFO etiketleme metodolojisi modülerlik muazzam bir varlıktır. biyobelirtecin hedefleme antikorların repertuar sürekli genişleyen ve bu yapıları kullanarak in vivo PET görüntülemede performans ilgi hızla büyüyor olmasıdır. Sonuç olarak, biz daha standart uygulamalar ve protokollerin geliştirilmesi alanını yararlanabilir inanıyorum. DFO-NCS konjugasyon ve 89 Zr Radyoaktif için mükemmel bir yazılı deneysel protokol zaten Vosjan tarafından yayımlanmış, vd. 22 Biz bu işin tarafından sağlanan görsel gösteri daha bu tekniklerin yeni müfettişler yardımcı olabilir hissediyorum. Eldeki Protokolde, prostat spesifik membran antijeni hedefleyen antikor J591 göstermek için bir model sistem olarak kullanılır (1) bir antikora DFO-izotiyosiyanat çift işlevli çelatör bioconjugation, 89 (2) radiosynthesis ve arıtma Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate,ve (3) &#39;de bir kanser sıçangil modelinde 89, Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate in vivo PET görüntülemesi. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

antikorların olağanüstü afinite, özgüllük ve seçicilik onlara tümör hedefli PET radyofarmasötikler için olağanüstü cazip vektörleri yapmak. Dolayı çok günlük biyolojik yarı-ömrü, antikorlar nispeten uzun fiziksel bozunma yarı ömürleri ile pozitron yayıcı radyonüklitler ile etiketlenmiş olması gerekir. Geleneksel olarak, pozitron yayan izotoplar 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y, (t 1/2 = 14.7 saat) ve 64 Cu (t 1/2 = 12.7 saat) için antikorlar etiketlemek için kullanılmıştır PET görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, ancak, saha antikor bazlı PET görüntüleme ajanları pozitron yayan radiometal 89 Zr kullanımında bir artışa şahit olunmaktadır. Fiziksel bir yarısını sahip gibi 89 Zr, immünoeşlenikler ile PET görüntüleme için neredeyse ideal bir radyoizotop antikorların in vivo farmakokinetikleri ile uyumlu olan ve nispeten düşük bir enerjini yayar Ömrü (t 1/2 = 78.4 saat)yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir rgy pozitron. Bundan başka, antikorlar doğrudan, siderofor türetilmiş kenetleme maddesi desferrioksamin (DFO) ile 89 Zr ile etiketlenebilir. Bu protokol, prostat spesifik membran antijeni hedefleyen antikor J591 göstermek için bir model sistem olarak kullanılır (1) bir antikor, (2) radiosynthesis ve 89 Zr- saflaştırılması kadar izotiyosiyanat DFO çift işlevli çelatör bioconjugation Kanser bir murin modelinde 89, Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate ile DFO mAb radioimmunoconjugate, ve (3) &#39;de in vivo PET.

Bu protokol antikora DFO-NCS konjugasyon ilk adım genellikle oldukça sağlam ve güvenilir. Genel olarak, saflaştırılmış, kenetleme maddesi ile modifiye edilmiş immüno&gt;% 90 verimle elde edilebilir ve ilk birleşme reaksiyonu içinde bulunan DFO-NCS 3 mol eşdeğeri kullanılarak bir derece-of-etiketleme, yaklaşık 1,0-1,5 arasında kenetleme DFO verecek / mAb. Işlemin 89, Zr, radyo-etiketleme ve saflaştırma aşamaları aynı şekilde basittir. Yukarıdaki protokole belirtilen konsantrasyonlard...

Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Bioconjugation ve radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt;, Zr-DFO-etiketli antikorlar

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Chemistry

Unit 1

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

17.0K Görüntüleme.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Video: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired Desenli ve Reconfigurable Parçacıkların Self-assembly

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Kimya

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum nörotoksin Işık Zinciri Modülatörlerin Belirlenmesi ve Karakterizasyonu için bir Yüksek verim uyumlu FRET tabanlı Platformu

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-ve-havuz Sentezi ve Peptit Tersiyer Amid Kütüphanesi Karakterizasyonu

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

Balık Yağı Takviyeler Lipid Profilinin Rapid Değerlendirilmesi için Sağlam Aracı Olarak NMR Spektroskopisi

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sentez ve kütle spektrometresi analizleri Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...