Bu çalışma Vakfı (DML), Amerikan Kanser Derneği (DML), MGH Howard Goodman Bursu (DML) ve Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe Standı Alex&#39;in Limonata tarafından desteklenen R24OD016761 ve 1R01CA154923 (DML). CNY Sitometrisi Çekirdek ve Akış Görüntü Analizi, paylaşılan enstrümantasyon hibe sayısı 1S10RR023440-01A1. IMT Bilim ve Teknoloji Portekizce Vakfı (- FCT Fundação para bir Ciência e Tecnologia) bir burs ile finanse edilmektedir. QT Çin Burs Konseyi tarafından finanse edilmektedir. Biz onu yararlı yorumlar ve tavsiye için Angela Volorio teşekkür ederiz.

Tüm hayvan prosedürleri protokol # 2011N000127 altında Araştırma Hayvan Bakım, üzerinde Massachusetts General Hastanesi Alt Komitesi tarafından kabul edildi. Yetişkin rag2 E450fs Homozigot Mutant Zebra balığı içine Bölüm 1. İskelet Kası Hücre Nakli Yetişkin Zebra balığı Donör İskelet Kası Hücreleri 1. Hazırlık <ol><li> Floresan kas etiketli transgenik yetişkin zebrafish edinin. Bu deneyde, 30 α-aktin-RFP donör balık 25 alıcı balık başına 1 x 10 6 hücre nakli için kullanılmıştır. </li><li> 1.6 mg Kurban verici zebra balığı / 10 dk ya da herhangi bir kapakçık hareketi elde edilene kadar sürdürülmüştür metansülfonat (MS222) tricaine ml. </li><li> Emici bir kağıt havlu ve tüketim üzerine temiz bir jilet kullanarak dorsal kas donör balık yerleştirin. Şekil 1A belirtildiği gibi kesilmiş doku toplama (maksimize etmek için bir 45 ° açıyla anüs yakınında yapılmalıdır </strong&gt;). Temiz bir 10 cm&#39;lik petri içine disseke doku yerleştirin. </li><li> Kesilmiş dokuya 500 ul süspansiyon tamponu (önceden soğutulmuş 0.9x Fosfat Tampon Tuz ve% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenmiş (PBS)) eklenir. 10 donör zebrabalıkları kadar bu kitapta bir araya yerleştirilebilir. </li><li> Hücreler tek tip bir süspansiyon kadar&gt; 20 kat bir jilet ile doku kıyma. Tüm dorsal kas deri, kemik ve yüzgeç dahil homojenize edilir. Süspansiyon tamponu 2 ml ekleyin. 5 ml&#39;lik bir pipet kullanarak, hücreleri ayırmak için hücre süspansiyonu ≥20 kez çiğnemek. </li><li> Buz üzerine yerleştirilmiş bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine 40 um mesh süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu süzün. </li><li> Geri kalan dokunun toplanması ve 5 ml (10 verici balık izole başına kullanılabilir) bir son hacme kadar aynı süzgeç ve konik tüp süzülmeye süspansiyon tamponu, 2.5 ml Petri yıkayın. NOT: Cilt, kemikler ve yüzgeçleri filtrasyon aşağıdaki dışı bırakılacaktır. </li&gt; <li> Varsa, aynı konik tüp içine benzer süspansiyonlar birleştirir. </li><li> Tripan mavi boya ve hemasitometre kullanarak canlı hücrelerin toplam sayısını sayın. </li><li> (Isteğe bağlı, adım 2) eğer arzu edilirse, akış sitometresi için 500 ul ayırın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, santrifüjleyin hücre süspansiyonu. </li><li> 3.33 x 10 5 hücre / ul süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın (0.9x PBS +% 5 FBS). Toplam olarak, 3 ul alıcı başına 1 x 10 6 hücre (aşama 3) toplam alıcı balık başına enjekte edilecektir. NOT: hücre süspansiyonu az 3 ul alıcı balık nakledilen edilmelidir. Hücre sayısı sınırlayıcı olduğu takdirde, alıcı için düşük 4 10 x 5 gibi hücreler başarılı bütünleşme (Tablo 1) yol açabilir. </li></ol> Donör İskelet Kası Cell Hazırlık 2. Akış Sitometri Analizi (İsteğe bağlı) <ol><li> I tarif edilen bir vahşi tip, transgenik olmayan bir balık kas izolen 1,1 adıma. Bu örnek, negatif kontrol olarak hizmet eder ve Akış Sitometrisi kapıları ayarlamak için yararlıdır. </li><li> Uygun bir canlılık boya ekleyin. Örneğin, kas hazırlanması 500 ul stok DAPI çözeltisi (500 ng / | il), 5 ul ilave edin. Analiz biraz önce vorteksleyin. 5 x 10 3 1 x 10 4 olaylarını Edinme. Transgenik balık izole kas hücrelerinin analizi ile takip kapıları yerleştirmek için ilk vahşi tip kontrol numuneleri analiz edin. NOT: sitometri analizi Akış genellikle disseke hücrelerin% 60&#39;dan fazla canlılığını (Şekil 2) muhafaza hangi süre içinde kas doku diseksiyonu sonra 1 saat içinde gerçekleştirilir. Hücreler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Toplam hücre canlılığı, tripan mavi boya ve bir hemositometre kullanılarak transplantasyon öncesinde yeniden değerlendirilebilir. </li></ol> Yetişkin rag2 Homozigot Mutant Zebra balığı içine İskelet Kası Hücreleri 3. İntramüsküler Nakli <ol><li> 10 μ temizleyin, Çizim ve% 70 etanol (5 kez) ile ve ardından,% 10 çamaşır suyu (5 defa), dışarı atılmasını ve daha sonra süspansiyon tamponu (0.9x PBS +% 5 FBS, 10 kez) ile L 26S G mikro şırınga. </li><li> Kapakçık hareketleri yavaş kadar sistem suda balık içeren bir Petri kutusu içine tricaine metansülfonat (MS222, 4 mg / ml stok çözelti) tek damla ilave edilerek 2-4 aylık homozigoz mutan rag2 balık ya da (kontrol olarak), vahşi tip bir alıcı balık anestezisi ve balık hala. Not: tricaine anestezi dozu alıcı zebrabalıkları yaşına ve boyutuna bağlı olacaktır. </li><li> Sol tarafı yukarı bakacak şekilde, bir nemli kağıt havlu veya sünger üzerinde anestezi alıcı zebrafish yerleştirin. </li><li> Latero-dorsal kas içine şırınga iğnesi takın (1A Şekil bakınız). Enjeksiyonlar 45 ° açıyla yapılır emin olun. Alıcı başına 1 x 10 6 hücre toplam balık başına (adım 1.12 hazırlandı) hücre süspansiyonu 3 ul enjekte edilir.</li><li> Dikkatle kurtarmak için bir plastik kaşık kullanarak temiz bir tanka enjekte zebrafish aktarın. </li><li> Parlak alan ve Epifloresans mikroskobu altında anestezi balık görüntüleme 10, 20, 30 gün sonrası transplantasyon de engreftman oranları için alıcı zebrafish değerlendirin. </li></ol> Yetişkin Homozigot rag2 Mutant Zebra balığı içine Bölüm 2. Embryonel Rabdomyosarkom (EBYS) Transplantasyon Zebra balığı Embriyolar 4. DNA Mikroenjeksiyon <ol><li> 6 saat veya O / N 37 ° C&#39;de Xhol ile DNA 10 ug, sindirerek rag2-kRASG12D plazmid 7 linearize. </li><li> Standart fenol DNA arındırın: kloroform ekstraksiyonu ve etanol ile çökeltilmesi. Iyonu giderilmiş su içinde 20 ul (alternatif olarak, ticari bir DNA fragmanı, arıtma kolonları kullanılabilir). </li><li> Bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirilmemiş ve sindirilmiş DNA çalıştırın ve DNA, b konsantrasyonunu belirlemeky spektrometre okuma. 1, 1: Seçenek olarak ise, 1 numuneler çalıştırmak 5 ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde 1:10 seyreltmeleri ve bir DNA merdiveni göre tayin edin. </li><li> 0.1 M KCl ve 0.5x Tris-EDTA içinde 15 ng sindirilmiş rag2-kRASG12D DNA / ml bir nihai konsantrasyonda, bir enjeksiyon karışım hazırlayın. Enjeksiyon hacmi 2 nl enjekte nihai DNA miktarı 30 pg olacaktır. Not: Üç farklı DNA yapıları kadar etkin bir şekilde birlikte enjekte embriyo DNA başına 60 pg fazla olabilir. Olmak Bu transgenler genomuna entegre olan ve gelişen tümör 26 içinde eş-ifade edilmiştir. </li><li> Ilgi konusu bir zebra balığı suşu (Şekil 1B) içine 27 tarif edildiği gibi esas olarak tek bir hücre aşamasında embriyoların içine doğrusallaştırılmış rag2-kRASG12D enjekte edilir. Enjeksiyonlar yüksek verimlilik için sarısında hücrede olup yapılmalıdır. Bu deneyde, bir çift transgenik AB-suşu ise; myf5-GFP, mylpfa mCherry kullanıldı. Standart yetiştirme s kullanarak zebrafish kaldırın28 rotocols. NOT: Enjeksiyon sağkalım sık kullanılan Zebra balığı gerginlik bağlıdır. Ortalama olarak, enjekte edilen embriyoların 30% ERMS gelişecektir. 300-600 embriyoların GFP-pozitif ve yeterince MCherry pozitif primer tümörler nakli ve analiz için oluşturulacak sağlamak amacıyla deney başına enjekte edilmelidir. </li></ol> Zebra balığı Larva İlköğretim ERMS 5. Eleme <ol><li> 10 ila 30 gün dışarıdan görünür birincil ERMS ortaya çıkması için enjeksiyon sonrası enjekte zebrafish gözlemleyin. </li><li> 30 gün sonrası enjeksiyon anda, operkulum hareketleri yavaş ve balık hala kadar balık sistemi su içeren bir Petri kabı içine tricaine methanesulfonate (MS222 4 mg / ml stok çözelti) tek damla ekleyerek alıcı zebrafish uyutmak. Not: tricaine anestezi dozu alıcı zebrabalıkları yaşına ve boyutuna bağlı olacaktır. Primer tümör taşıyan zebra tricaine düşük dozlarda gerektirir. </li><li> Birincil EBYS-yatak seçinBir Epifloresans mikroskop kullanarak, myf5-GFP pozitif ve mylpfa mCherry pozitif olan balık. </li></ol> 6. EBYS Tümör Hazırlık <ol><li> 10 dakika süre ile ya da herhangi bir kapakçık hareketi belirgin olana kadar 1.6 mg / ml tricaine metansülfonat (MS222) seçilen primer EBYS taşıyan zebrafish kurban. </li><li> Ayrı ayrı tümör taşıyan zebrafish işleyin. Temiz bir Petri kabındaki balık yerleştirin ve bir jilet ve ince forseps (Şekil 1B gösterildiği gibi) kullanılarak tümör çevresindeki teşrih. Temiz bir Petri kabı disseke tümör dokusu aktarın. </li><li> % 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş önceden soğutulmuş 0.9x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 100 ul ekle. Temiz bir jilet ile kıyma doku&gt; hücreleri kadar 20 kat homojen bir süspansiyon vardır. </li><li> Pipet süzülmüş 1000 ul kullanarak hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı birkaç kez aynı tampon 900 ul (0.9x PBS +% 5 FBS), pipet ekleyin. Bir 40 yoluyla Filtre# 956; tekabül 50 ml konik tüp içine m örgü süzgeç. Buz üzerinde muhafaza edin. </li><li> Tampon ilave 2-4 ml Petri kabı yıkayın ve aynı süzgeçten ile ve buna karşılık gelen, konik bir tüp içine geçmektedir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, santrifüjleyin. </li><li> Tampon 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> Tripan mavi boya ve hemasitometre kullanarak canlı hücrelerin toplam sayısını sayın. </li><li> Aynı tampon içinde istenen konsantrasyona seyreltilir hücreleri (0.9x PBS +% 5 FBS). Hücreler, alıcı başına 2.5 x 10 4 hücrelerinin toplam alıcı zebrabalıkları başına 5 ul nakli için / ml, 5 x 10 3 hücre olacak şekilde seyreltilir. </li><li> Akış sitometrisi analizi, aynı zamanda örnek içinde flüoresan hücrelerin nispi oranı nicemlemek için adım 6.5 süspansiyon küçük bir miktarı ile gerçekleştirilebilmektedir. NOT: kenara (Adım 3.5 filtreleme takip) hücre süspansiyonu 100 ul Set ve 400 ul sulandırmakAkış sitometrisi analizi için 0.9x PBS +% 5 FBS süspansiyon tamponu. Uygun yolluk sağlamak için, yetişkin vahşi tip, myf5-GFP ve mylpfa mCherry balık izole tek transgenik tümör dokusu veya kas kullanarak ek analiz yapmak. Bölüm 1, adım 2&#39;de açıklandığı şekilde, esas Akış Sitometri yapın. </li></ol> Yetişkin rag2 homozigot mutant zebrafish içine ERMS 7. Nakli <ol><li> (5 kez) içeri çekilmesi ve% 10,% 70 etanol, ardından ağartıcı çözeltisi (5 kez) uzaklaştırılması ile 10 ul 26S G mikro şırınga temizleyin ve sonra süspansiyon tamponu (0.9x PBS +% 5 FBS, 10 kez ve ardından ). </li><li> Kapakçık hareketleri yavaş ve balık hala kadar sistem suda balık içeren bir Petri kutusu içine tricaine metansülfonat (MS222 4 mg / ml stok çözelti) tek damla ilave edilerek alıcı homozigoz mutan rag2 balık anestezisi. </li><li> Islak kağıt havlu veya spo üzerinde anestezi alıcı zebrafish yerleştirinnge, ventral yüzü yukarı bakacak. </li><li> Periton boşluğuna (alıcı başına 2.5 x 10 4 hücre) hücre süspansiyonu 5 ul enjekte edilir. NOT: Aşama 4.1 de tarif edildiği gibi enjeksiyon iğne farklı tümörlerin enjeksiyonlar arasında temizlenmesi gerekir. 5-10 ul etkili bir alıcı balık boyutuna bağlı olarak, intraperitoneal olarak transplante edilebilir. Tümör melezleme alıcı balık başına 1 x 10 4 5 10 5 x sıralanmamış hücreleri (Tablo 1) enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir. </li><li> Dikkatle plastik kaşık ile temiz bir tanka alıcı zebrafish yerleştirin. </li><li> Parlak alan ve Epifloresans mikroskobu altında anestezi balık görüntüleme 10, 20, 30 gün sonrası transplantasyon de engreftman oranları için alıcı zebrafish değerlendirin. </li><li> Farklılaşma durumunu (Şekil 3H), standart histolojik analı değerlendirmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) dahil mansap uygulamalar için engrafted balık yararlanınsis (Şekil 3F), görüntüleme terapi yanıtları 15, ve / veya seri transplantasyon seyreltme analizi 11 sınırlayıcı dahil yaklaşır. </li></ol>

<ol>
	<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).</li><li>Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+hematopoiesis+using+zebrafish.">Assaying hematopoiesis using zebrafish.</a> Blood cells, molecule., &amp; diseases. 51 (4), 271-276 (2013).</li><li>Langenau, D. M., Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Expression+of+Human+MYCN+Selectively+Causes+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors+in+Transgenic+Zebrafish+Targeted+Expression+of+Human+MYCN+Selectively+Causes+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors+in+Transgenic+Zebrafish.">Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish.</a> Cancer Research. , 7256-7262 (2004).</li><li>Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -. J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEL-AML1+transgenic+zebrafish+model+of+precursor+B+cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).</li><li>Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOZ/TIF2-induced+acute+myeloid+leukaemia+in+transgenic+fish.">MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish.</a> British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).</li><li>Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells,+regional+tumor+heterogeneity,+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.+Suppl+Data.">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data.</a> Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li><li>Blackburn, J. S., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Evolution+Enhances+Leukemia-Propagating+Cell+Frequency.">Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency.</a> Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).</li><li>Blackburn, J. S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+assess+cancer+heterogeneity,+progression+and+relapse.">Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse.</a> Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).</li><li>Zhao, C., Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS one. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3+inhibitors+induce+the+canonical+WNT/&#946;-catenin+pathway+to+suppress+growth+and+self-renewal+in+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/&#946;-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).</li><li>Yang, X. -. J., Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+zebrafish+xenotransplantation+model+for+study+of+glioma+stem+cell+invasion.">A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion.</a> PloS one. 8 (4), e61801 (2013).</li><li>Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+Tumor+Subpopulations+Cooperate+to+Drive+Invasion.">Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion.</a> Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).</li><li>Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li><li>Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+melanoma+modifiers+using+a+zebrafish+autochthonous+tumor+model.">Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).</li><li>Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish.">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).</li><li>Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature methods. 11, 821-824 (2014).</li><li>Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+NOD-SCID+IL2rg&#8211;/&#8211;+mice+as+a+preclinical+model+for+cancer+research+and+its+potential+use+for+individualized+cancer+therapies.">Humanized NOD-SCID IL2rg&#8211;/&#8211; mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies.</a> Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li><li>Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analysis+of+adult+zebrafish+cells+enriched+for+skeletal+muscle+progenitors).">Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors).</a> Muscl, &amp; nerve. 43 (5), 741-750 (2011).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).</li><li>Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesoangioblast-like+myogenic+progenitors+in+mouse+models+of+muscle+regeneration.">Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration.</a> J Vis Exp. (83), e50532 (2014).</li><li>Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myogenic+precursor+cell+that+could+contribute+to+regeneration+in+zebrafish+and+its+similarity+to+the+satellite+cell.">A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell.</a> The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).</li><li>Rowlerson, a., Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+skeletal+muscle+in+two+teleost+fish:+Sparus+aurata+and+Brachydanio+rerio.">Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio.</a> Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).</li><li>White, R. M., Sessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Yetişkin dorsal iskelet kası Verimli ve sağlam engreftman rag2 homozigot mutant balık dorsal kas içine hücre enjeksiyonu ile takip çok basit bir hücre hazırlama yöntemi ile elde edilmiştir. Bazı ilişkili ölüm anında% 10 den% 35 deney bağlı olarak değişen, implantasyon prosedürü izleyerek genel olarak, kas içi enjeksiyon işlemleri, çok sağlam idi. Ek optimizasyon olasılıkla hücrelerin implante kolaylığı kolaylaştıracak enjeksiyon ve mikroskop ve mikromanipülatör kullanarak sabit enjeksiyon cihazının geliştirilmesi için küçük göstergesi iğne, kullanımı üzerine merkezi olacak. Yaklaşımımız da donor hayvandan alınan ayrıştırılmamış kas hücreleri kullanılır ve yalnızca yaklaşık% 30 kas progenitör hücre içermektedir. Muhtemelen alıcı balık içine artan engraftment neden zenginleştirilmiş hücre süspansiyonları sağlayacak kök hücreler ve FACS izolasyon etiket transgenik muhabiri hatlarının kullanımı. İskelet kası cDaha önce açıklandığı gibi 29 arşın da, zenginleştirilmiş ve transplantasyon kültürlü önce olabilir. Dikkate değer, bizim sonuçlar 10 gün kas uyumunu ve yenilenme değerlendirmek için sağlam ve hızlı bir deneysel platform olarak bu modeli kurulması, nakli sonrası önce niş kurulması ve donör kas dokusunun farklılaşma adımları meydana geldiğini göstermektedir. Ayrıca, bu deneyler açıkça ortaya cardiotoxin ya da baryum klorür ile kas yaralanma öncesi 30,31 bütünleşmesini önce iki gün gereklidir farelerde, tamamlanmış olan kontrast. Bu nakli prosedürü sırasında üretilen iğne yaralanması alıcı hayvan 32,33 içinde bir rejeneratif ortamda üretimini uyararak bütünleşmesini güçlendiren olasıdır. Biz de erken iskelet kas gelişimini etkileyen genetik mutasyonlar değerlendirmesini sağlayan, bizim yöntem kolayca genç Zebra balığı iskelet kas dokusunun nakli adapte olacağını tasavvurancak larva aşamasında öldürücülüğü neden. Biz de olmayan klimalı, rag2 homozigot mutant balık içine intraperitoneal enjeksiyon yoluyla zebrabalıkları ERMS nakledilmesiyle için ayrıntılı bir protokol hazırladık. Bu yaklaşım, bir singenik transgenik hattı içinde tümörler oluşturmak için gerek kalmadan çift transgenik primer tümörlerin yayılması için yararlı oldu. Bizim son çalışma hücre nakli yaklaşımlar, tek bir tümör hayvanların binlerce içine genişletilmiş ve büyüme, kendini yenileme ve neovaskülarizasyon 15 üzerindeki etkileri için değerlendirilebilir vivo, in EBYS uyuşturucu hassasiyetini değerlendirmek için yeni deneysel modeller sağladığını göstermiştir. Ayrıca, başarılı bir şekilde, T hücresi akut lenfoblastik lösemi, melanoma, ve EBYS 23 de dahil olmak üzere rag2 homozigoz mutant balığa tümörler geniş bir nakledilmiş olması. Geleceğe doğru baktığımızda, biz bu satırları kanser önemli fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yararlı olacağını tasavvurintra-tümöral heterojenite, işgali, metastaz, anjiyogenez ve tedavi direnci değerlendirilmesi de dahil olmak üzere vivo. Ayrıca, optik açık Casper suşu zebrabalıkları 34 rag2 homozigot mutant balık üretimi muhtemelen bu kanser işaretlerinden çoğunun doğrudan görüntüleme kolaylaştıracaktır. Toplam olarak, biz yetişkin rag2 homozigot mutant bağışıklık sistemi zayıflamış Zebra balığı normal etiketli-floresan ve malign iskelet kasının başarılı bütünleşme için ayrıntılı protokolleri sağlamak.

Onlar Ampute yüzgeçleri, yanı sıra hasarlı beyin, retina, omurilik, kalp, iskelet kası ve diğer dokuları 1 yeniden çünkü Zebra balığı rejeneratif çalışmalar için mükemmel bir model vardır. Hücre nakli, çeşitli dokulardan kök hücrelerin tanımlanması sadece son 2 araştırılmaktadır ise yetişkin zebrabalıkları hücre ve rejeneratif çalışmalar, büyük ölçüde, bir hasara yanıt olarak rejenerasyon karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır Stem. 10 - balığı aynı zamanda insan hastalıklarının 3 taklit transgenik kanser modelleri üretilmesiyle kanseri araştırması için giderek artan bir ikinci hale gelmiştir. Kanser ortamda, hücre transplantasyonu yaklaşımları yaygın olarak kabul ve kendini yenileme 11, fonksiyonel heterojenite 12,13, neovaskülarizasyon 14, çoğalması da dahil olmak üzere önemli kanser süreçlerinin dinamik değerlendirilmesine imkan haline gelmiş,tedavi yanıtları 15, ve işgali 16,17. Ancak, engrafted hücreleri sıklıkla saldırı ve greft 18 öldürmek bağışıklık savunma ev sahipliği nedeniyle alıcı balık reddedilir. Birçok yöntem nakledilmiş hücreler reddini üstesinden gelmek için kullanılmıştır. Örneğin, alıcı hayvanlar bağışıklık sistemi geçici transplantasyon öncesinde 18,19 için düşük dozda y-ışıma ile buharlaştınldığı edilebilir. Ancak, alıcının bağışıklık sistemi 20 gün sonrası radyoterapi kurtarmak ve donör hücreleri 18 öldürecek. Seçenek olarak ise, deksametazon tedavisi uzun immün baskılayıcı soğutucu sağlamanın ve 30 gün 14 insan tümörlerinin geniş naklini kolaylaştırmak, T ve B hücresi işlevini baskı altına alan için kullanılmıştır. Bu deneyler, sürekli ilaç dozajı gerektirir ve katı tümörlerin çalışma ile sınırlıdır. 22, donör ve recipi - Uzun vadeli engraftmant deneyleri genetik özdeş singenik hatları 20 kullandıkent hücreleri eşleşti bağışıklık bulunmaktadır. Ancak, bu modeller ilgi transgenik hatları tamamen singenik hatları üretmek için fazla dört nesildir singenik plana geçti gerektirir. Alıcı balık bağışıklık ret sorunları ortadan kaldırmak için, bizim grup son zamanlarda bir bağışıklık T ve B hücre fonksiyonlarında azalma ve dokularda 23 geniş naklini izin hangi tehlikeye rag2 E450fs homozigot mutant (ZFIN alel tanımı rag2 fb101) çizgi geliştirmiştir. Benzer bağışıklık sistemi zayıflamış fare modelleri, fare ve insan dokuları 24 hücre transplantasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, biz iskelet kası ve embriyonal rabdomyosarkomu (EBYS), yeni açıklanan rag2 homozigot mutant zebrafish içine, iskelet kası ile özellikleri paylaşan bir pediatrik sarkom nakli için yöntemler sunuyoruz. bir bağışıklık tehlikeye yetişkin zebrabalıkları durumuDoğrudan görselleştirmek ve normal ve malign dokularda kök hücre kendini yenileme değerlendirmek için büyük ölçekli hücre nakli çalışmaları yapmak bizim yeteneği genişler. Bu yöntemle, floresan 25 transgenik zebra balığı sağlam rag2 içinde aşılanmakta α-aktin-RFP yetişkin kas hücresi preparasyonları etiketli dorsal kas içine enjeksiyon aşağıdaki homozigot mutant Zebra balığı. Ayrıca, uyumunu ve primer myf5 GFP genişlemesini göstermektedir; rag2 E450fs homozigoz mutant zebrabalıkları intraperitonal enjeksiyonu takiben mylpfa- MCherry transgenik ERMS. Bu protokollerin yarar gösterilen örneklerde ötesine geçer ve kolayca ek zebra balığı rejeneratif doku ve kanser uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution 1x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93283-100ML</td>
			<td>microinjection. Injection mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Science Education</td>
			<td>S77375-1</td>
			<td>microinjection. Injection mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>microinjection. Plasmid linearization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104 (50) or 28106 (250)</td>
			<td>Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1753I-100</td>
			<td>Microinjection. For purification of linearized plasmid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose, 500 g</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>microinjection. Linearized plasmid quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx</td>
			<td>microinjection. Linearized plasmid quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI(4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>flow cytometry/FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>flow cytometry collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special Order Research Products (SORP) program</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special Order Research Products (SORP) program</td>
			<td>flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-01</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphonate (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html</td>
			<td>Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Bench Underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td>Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singe Edge Industrial Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon-Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430828</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Set&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 &#181;L, needle size 26s ga (bevel tip)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80366</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Austin&#39;s A-1 Bleach, Commercial</td>
			<td>James Austin Company</td>
			<td></td>
			<td>Transportation. Any commercial&#160; solution can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial&#160; solution can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C0265-24</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004539&#160;</td>
			<td>Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml serological pipets</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357529</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Plus Pipetting Controller</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4090</td>
			<td>Transportation. Any automatic pipetting controller can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder free examination gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>All steps. Any commercial brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter pipet tips and micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>All steps. Any commercial brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11205-20</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP72 microscope digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish

Zebra balığı geliştirme, yenilenme ve kanser değerlendirmek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha yakın zamanda, allogreft hücre nakli ışınlanmış, singeneik ve bağışıklık sistemi zayıflamış yetişkin zebrabalıkları halinde normal ve habis hücrelerin izinlerini bütünleşmesini geliştirilmiştir. Optimize hücre nakli protokolleri ile birleştiğinde Bu modeller kök hücre fonksiyonu, rejenerasyon aşağıdaki yaralanma ve kanserin hızlı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, biz bağışıklık sistemi zayıflamış erişkin rag2 E450fs homozigot mutant zebrafish içine Zebra balığı yetişkin iskelet kası ve embriyonal rabdomyosarkomu (EBYS), embriyonik kas özellikleri paylaşan bir çocuk sarkomu, hücre transplantasyonu için bir yöntem mevcut. Daha da önemlisi, bu hayvanlar, T hücreleri olmadığı ve ilişkili olmayan ve donor hayvandan alınan dokularda geniş bir naklini kolaylaştırmak B hücresi fonksiyonunu azaltmıştır. Bizim optimize protokoller floresan kas hücresi HAZIRLIK etiketli gösterisirag2 homozigot mutant balık dorsal kas içine implante zaman α-aktin-RFP transgenik zebrafish gelen ations sağlam aşılamak. Ayrıca floresan farklılaşma durumuna göre hücreler ile sınırlı olan, floresan transgenik ERMS naklini göstermektedir. Özellikle, EBYS AB-gerinme myf5-GFP oluşturulan; mylpfa mCherry çift transgenik hayvanlar ve tümörler yetişkin bağışıklık tehlikeye balık periton içine enjekte. Bu protokollerin programı sırt kaslarının veya yetişkin zebrabalıkları periton içine implante edilebilir, normal ve malignan donör hücrelerin geniş bir bütünleşme için de geçerlidir.

İmmün içine hazırlanıyor ve α-aktin-RFP transgenik donörlerden iskelet kas hücreleri nakli için bir prosedür homozigot mutant zebrafish rag2 tehlikeye (Protokol Bölüm 1, Şekil 1A ve Şekil 2) gösterilmiştir. İskelet kas dokusu α-aktin-TTT transgenik olan donörlerden hazırlanmış olan ve Akış Sitometrisi analizi (Şekil 2B), aşağıdaki DAPI dışta bırakılması ile değerlendirildi Elde edilen tek bir hücre süspansiyonu% 84.3 canlı hücreleri ihtiva etmiştir. TTT-pozitif hücreler, bu tek bir hücre süspansiyonu (Şekil 2C) 35.3% içermiştir. (Balık başına enjekte edilen 1 x 10 6 hücre, Tablo 1, Şekil 2D-I) &#39;i çok çekirdekli elyafların içine tek hücrelerin farklılaşması ile değerlendirilen rag2 homozigoz mutant alıcı balık dorsal iskelet kasına hücre transplantasyonu, tutarlı ve güçlü bir bütünleşme yol açmıştır. Vahşi tipalıcı Balık 30 günlük deney (n = 13) üzerinde kas lifleri aşılamak için başarısız oldu. 10 gün sonrası nakli, 14 rag2 homozigot mutant zebrafish dışarı 9 enjeksiyonu (% 64.3, Şekil 2E, F) yakın site RFP-pozitif kas lifleri içeriyordu. Önemlisi, engrafted TTT-pozitif kas sonrası melezleme ve sergileyen güçlü ve kalıcı kas engraftmant (veriler gösterilmemiştir) 115 gün süreyle takip edilen hayvanların bir alt kümesi ile, post-transplantasyon 30 gün (Şekil 2G-I) devam etti. Bu sonuçlar, aynı protokol (Tablo 1) kullanarak bir grup 23 ile daha önceden rapor edilenlere benzerdir. Ayrıca rag2 homozigoz mutant alıcı balık (Protokol Bölüm 2, Şekil 1B ve Şekil 3) periton boşluğuna EBYS tümör hücrelerinin üretimi, hazırlanması ve nakli için bir yöntem sunulmuştur. EBYS doubl olarak hesaplanmıştıre transgenik myf5-GFP; mylpfa mCherry balık içi tümöral heterojenite ve nakli 11 aşağıdaki tümör hücre alt fonksiyonel analiz görselleştirme izin gösterilmiştir. Bunlar 10-30 yaşam gün ve tümör hücrelerinin sayısı alt baş uygulamalar için sınırlandırıcı arasında ERMS geliştirirken, balık küçük Ancak, her bir alt populasyonun daha moleküler karakterizasyonu zordur. Bir çözüm yetişkin alıcı Zebra balığı içine ERMS aşılanması ile tümör hücresi sayıları genişletmektir. Bugüne kadar, benzer deneyler CG1-streyn singeneik balık ile tamamlanmış olup, myf5-GFP için transgenik olan genetik olarak özdeş hatlarını geliştirmek için geri çaprazlama 4 kuşak fazla gerekmektedir; mylpfa mCherry. Bu sorunları aşmak için, biz bir AB-gerinme zebrabalıkları birincil ERMS aşılamak bağışıklık tehlikeye rag2 homozigot mutant alıcı zebrabalıkları yararını göstermiştir. Bütün birincil EBYS ra aşılanang2 tümör (Tablo 1) genişlemesini kolaylaştırmak homozigoz mutant hayvanlar. 0 7 vahşi tip kardeşler hastalığı 23 engrafted ise benzer sonuçlar son zamanlarda, nerede 24 27 rag2 homozigot mutant Zebra balığı engrafted EBYS bildirilen edilmiştir. Bir aşılanan ERMS temsili bir örneği, Şekil 3E&#39;de 30 gün sonra nakli gösterilir. Engrafted EBYS primer tümörün (Şekil 3B ve 3F) bulunan benzer embriyonel rabdomyosarkomu, histolojik özellikleri paylaşır. FACS analizi bu myf5-GFP ve / veya mylpfa-mCherry ifade eden hücreleri ve farklılaşmış hücrelerin ilerleyen fonksiyonel olarak farklı tümör bulunan ERMS doğruladı. Intraperitoneal enjeksiyon prosedür takip sağkalım oranları% 95 fazla olmuştur. Alıcı Zebra balığı genellikle 30 gün sonrası transplantasyon zamanı noktadan sonra tümör yükünden yenik. (A) Normal ve (B) rag2 homozigoz mutant Malign iskelet kası hücre transplantasyonu için Şekil 1. Protokol şematik Zebra balığı. Opsiyonel adımlar (*) ile işaretlenmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" width="700px" /> Rag2 homozigot mutant zebrafish içine Şekil 2. İskelet kası engraftmant. (A) α-aktin-RFP transgenik donör Zebra balığı. Izole kas hücre süspansiyonu (B) Hücre canlılığı DAPI boya dışlama tarafından değerlendirilir ve akım sitometri gibi. Bir vahşi tipli kontrol ile karşılaştırıldığında (C) α-aktin-TTT vericisinden (kırmızı) kas hücre süspansiyonu içinde bulunan TTT-pozitif hücreleri oranı,(Gri). (DE) 30 gün sonrası transplantasyon parlak alan ve vahşi tip hayvanlara (D) veya rag2 homozigot mutant balık (E) floresan görüntüleri birleşti. Zamanla (F) Aşı oranları. Gri-engrafted balık gösterirken Kırmızı engrafted hayvan sayısını belirtir. Her bir zaman noktasında analiz edilen hayvan sayısı belirtilmiştir. Zaman (ok başları) üzerinden farklı kas liflerinin tutma gösteren (GI) 10 (G) gösterilen paneli E kutulu bölgenin yüksek büyütme görüntüleri, 20 (H) ve 30 (I) gün transplantasyon sonrası. Ölçek çubukları 2 mm eşit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" width="700px" /> Myf5-GFP Şekil 3. Nakli; rag2 homozigot mutant haline mylpfa mCherry EBYS . AB-gerinme myf5-GFP ortaya çıkan Zebra balığı (AD) rag2-kRASG12D kaynaklı birincil EBYS; hayatın 30 gün mylpfa mCherry zebrabalıkları. (EH) rag2 homozigot mutant Zebra balığı ERMS engrafted ve post-transplantasyon 30 gün analiz. (A, E), parlak alan ve birincil ve nakledilen ERMS floresan görüntüleri birleşti. Tümör alanı ana hatlarıyla ve ok ucu E enjeksiyon sitesini gösterir. (B, F) Hematoksilen ve kanser ile ilişkili artmış selülarite alanları gösteren birincil (B) eozin boyalı parafin kesitleri ve engrafted EBYS (F). (Cı-DAPI boya dışlama tarafından değerlendirilir ve akım sitometri G) Hücre canlılığı. (D, H), Floresan tümör hücresi alt-popülasyonları akış sitometri ile değerlendirildi. Ölçek çubukları 2 mm (A, E) ve 50 um (B, F) eşit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" width="700px" /> Kas ve EBYS hücre transplantasyonu için Tablo 1. Aşı sonuçları. (*) Daha önce aynı teknikleri kullanarak verileri 23 rapor işaretidir. Veri Doğa Yöntemleri izniyle edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>.

Watch this Scientific Journal Video about Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish at JoVE.com

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

normal-malignant-muscle-cell-transplantation-into-immune-compromised

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells. 

Video: Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

Yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon: bağırsak alımını biyoaktif bileşiklerin değerlendirmek için bir Model

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Yetişkin zebra balığı bağışıklama DNA tabanlı aşıların preklinik tarama için

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...