Bu protokolün genel amacı, bir zebra balığı kas hastalığı modelinde kas yenilenmesini incelemek ve ölçmektir. Bu yöntem, sadece uygun maliyetli değil, aynı zamanda in vivo bir ortamda hastalıklı bir kasın rejeneratif potansiyelini puanlamada da yüksek oranda tekrarlanabilir yüksek verimli bir işlem hattı sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren Avnika Ruparelia, Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü'nde araştırma görevlisi.
Canlı embriyo genotipleme için, 24 odalı bir DNA ekstraksiyon çipinin üst yüzeyinden net koruyucu filmi soyun ve 13 mikrolitre embriyo ortamındaki tek bir uyuşturulmuş embriyoyu çipin her odasına aktarmak için kesik uçlu 20 mikrolitre filtre ucu kullanın. Tüm embriyolar yüklendiğinde, bir tarafı ilk sıraya, ardından çipin geri kalanını yerleştirerek çipi zebra balığı embriyo genotipleme platformuna hafifçe monte edin. DNA ekstraksiyon protokolü sırasında embriyo ortamının buharlaşmasını önlemek için manyetik platform kapağını çipin üzerine yapıştırın ve kapağı kapatın.
Taban birimini 2,4 volt, 0,051 amper ve 0,12 watt olarak ayarlayın ve DNA çıkarma protokolünü başlatın. Platform titreşime başlamalıdır, bu da kapağı hafifçe dokunarak değerlendirilebilir. Program çalışırken, her kuyuya bir mililitre embriyo ortamı ekleyerek 24 kuyulu bir plaka hazırlayın ve her embriyodan DNA materyalinin toplanmasında kullanılacak sekiz kuyulu şerit tüpleri etiketleyin.
Sekiz dakikalık ekstraksiyondan sonra, platformun titreşimini durdurmak için açma/kapa düğmesine basın, manyetik kapağı hafifçe çıkarın ve çipi platformdan kaldırın. Bir odadan 10 mikrolitre embriyo ortamını sekiz kuyulu şerit tüpün uygun kuyusuna aktarın ve hemen odalara iki damla taze embriyo ortamı ekleyin. Embriyoyu odadan daha önce hazırlanmış 24 kuyu plakasının uygun bir kuyusuna aktarın.
Tüm embriyolar transfer edildiğinde, plakayı 28 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Her embriyonun genotipini belirlemek için sekiz kuyulu şerit tüplerde toplanan genetik materyal üzerinde uygun aşağı akış genotipleme testlerini gerçekleştirin. Her embriyonun genotipi belirlendikten sonra, embriyoları 25 mililitre orta su içeren 90 milimetre Petri kabına aktarın ve kas yaralanmasına kadar plakaları 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Döllenmeden dört gün sonra, uyuşturulduktan sonra bir larvayı yeni bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın ve fazla ortamları diseksiyon mikroskobu altında tabaktan dikkatlice çıkarın. Balığı başın solda, kuyruğun sağda, sırt bölgesinin yukarısında ve ventral bölgenin aşağısında olacak şekilde yönlendirin ve anal gözenek üzerindeki apolikal kasta bir ila iki somit içine hızlı bir kesin bıçak yapmak ve mioseptuma yatay yapmak için 30 kalibrelik bir iğne kullanın. Yaralı zebra balığına bir damla embriyo ortamı uygulayın ve larvayı kuyu başına bir mililitre taze embriyo ortamı içeren 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna dikkatlice aktarın.
Tüm larvalar yaralandığında, zebra balığı görüntülenene kadar plakayı 28 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Kas yenilenmesini ölçmek için, uygun bir görüntü analizi yazılım programında bir günlük yaralanma sonrası görüntü açın ve yara bölgesinin etrafına bir şekil çizmek için çokgen aracını kullanın. Alanı ölçmek ve bölgenin birefringence yoğunluğu anlamına gelmek ve bu değerleri sağlanan şablonun D3 ve E3 hücrelerine kopyalamak için yazılımı kullanın.
Her biri bir ila iki yaralanmamış somite yayılan iki ek bölge çizin ve alanı ölçün ve bu bölgelerin her birinin birefringence yoğunlukları anlamına gelir. Bu değerleri şablondaki D4 ve D5 ile E4 ve E5 hücrelerine kopyalayın. Ardından, yaralanma sonrası üç gün görüntüsünde aynı bölgeler için ölçümü tekrarlayın.
Birefringence tüm görüntülerde aynı şekilde ölçüldüğünde, her bölgenin ortalama birefringence yoğunluğunu alanına bölerek her bölge için normalleştirilmiş birefringence'ı hesaplayın. Her zaman noktası için, yaralanmamış kas için bir referans noktası sağlamak için iki yaralanmamış bölgenin ortalama normalleştirilmiş birefringence'ını hesaplayın. Yaralanma sonrası ilk günde kas yaralanmasının boyutunu belirlemek için, yaralanma bölgesinin normalleştirilmiş birefringansını yaralanmamış bölgelerin ortalama normalleştirilmiş birefringence'ına bölün.
Kas yenilenmesinin boyutunu belirlemek için, yaralanma sonrası üç gün içinde yaralanma bölgesinin normalleştirilmiş birefringence'ını, bu aşamada yaralanmamış bölgelerin ortalama normalleştirilmiş yoğunluğuna bölün. Son olarak, rejeneratif indeksi, yaralanma sonrası üçüncü günde kas yenilenmesinin değerini, yaralanma sonrası ilk gün kas yaralanmasının değerine bölerek hesaplayın. Bu temsili analizde, iki Lama2 heterozipöz zebra balığı arasındaki bir haçtan embriyo debriyajı DNA ekstraksiyon çipine aktarıldı ve daha sonra genotiplendi.
Kas yaralanması, yaralanma sonrası ilk günde birefringence yoğunluğunda azalma ile sonuçlanırken, kasların başarılı bir şekilde yenilenmesi aynı bölgede birefringence artmasına neden olur. Ayrıca, vahşi tip larvaların normal bir kas deseni nedeniyle tek tip bir birefringence yoğunluğu göstermesine dikkat edilirken, Lama2 nakavt larvalarının kaslarındaki birefringence yoğunluğunun düzensiz ve kas bütünlüğünün azalması nedeniyle oldukça sporadik olması da dikkat çekicidir. Gözlemlendiği gibi, hem vahşi tip hem de Lama2 eksikliği olan larvalar, yaralanma sonrası üç günde, yaralanma sonrası bir günde kasın yenilendiğini gösteren önemli ölçüde artmış bir birefringence yoğunluğu göstermektedir.
Rejeneratif indeksin belirlenmesi, Lama2 eksikliği olan larvaların vahşi tip hayvanlara kıyasla kas yenilenmesinde çarpıcı bir artış sergilediğini ortaya koymaktadır. Bu protokol, kas hastalığı modellerinde kasların yenilenme yeteneğindeki değişiklikleri tanımlamamıza izin verirken, gözlenen değişikliklerden sorumlu mekanizmaları tanımlamak için aşağı akış hücresel ve moleküler analiz yapılması gerekir. Bu yöntem, kas kök hücre fonksiyonlarının bozulmasının ve ilişkili niş elementlerdeki bir bozukluğun kas hastalığı patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu belirlememizi sağlamıştır, bu nedenle yeni hastalık mekanizmalarını tanımlamamıza izin verir.
