Barresi Lab üyeleri Biz, verdikleri destek ve bu yazının yararlı yorum için teşekkür etmek istiyorum. Biz onun sürekli teknik yardım için Alexander Workman yanı sıra hayvan bakım personeli Smith College Zebra balığı koloni korunmasında yardım ettikleri için teşekkür ediyorum. Ayrıca bu protokol Filmin bazı mikroskopi ekipman kredileri için Mike Hallacy Rudi Rottenfusser ve Carl Zeiss Microimaging teşekkür ederim. Bu çalışma, bir NSF tarafından finanse edilen araştırma bursu, 0615594 tarafından desteklenmiştir.

Bölüm 1: 594 Alexa Etiketli Embriyolar 1.1 Mikroenjeksiyon Plaka ve İğne Hazırlık <ol><li> Mikroenjeksiyon plakaları yapma <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Üç beş 1-mm olukları Westerfield, 2007 1 bir teknik kullanarak bir agaroz kalıp içinde oluşan enjeksiyon tabak hazırlayın. Bu olukları snuggly etkin ve sistematik microinjections bir çizgi embriyolar yapacak. Plakalar yapmak için önce, üç 1 mm 4-inç uzun olmayan filament kılcal damarlar ve dikkatle yarısında onları kırmak. Bu 2-inç uzunluğunda kılcal damarların superglue, tutkal iki yan tarafı düz bir yüzey üzerinde. Tutkal üçüncü üç kılcal damarların bir piramit şekli oluşturarak, koru içinde yuvalanmış bu iki üst, kapiller. Kuru ve yeterli &quot;çukur kalıpları&quot; yapılıncaya kadar tekrarlamak için izin verin. </li><li> Embriyo orta erimiş% 1.5 agaroz (5mm derinlik) 20-25ml dökün (EM) [5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2 0.33mM MgSO 4 ve 0.00003% metilen mavisi] 100mm bir petri içine. Hemen plaka alt kalıp petri alt dokunuyor düz tarafı sağlanması için daha önce yapılmış piramit şeklindeki çukur kalıplar 04:57 yerleştirin ve tamamen agaroz ile kaplı. </li><li> Agaroz katılaşmış, kılcal cam kalıpları dışarı alınmalıdır. Kaldırmak için, üç kılcal kalıpları içeren büyük bir agaroz kare kesip. Yavaşça kesik kare ve atın çevre agar yerinden. Ince forseps kullanarak kare agar üzerinde parça ve Flip, çukur kalıplar tamamen kaldırmak. Yeni kalıp kuyuları yerinde tutmak için meydanın çevresinde petri içine erimiş agaroz dökün. Ayarlamanıza olanak sağlar. Tabaklar, 4 hafta boyunca kapalı ve depolanan parafilm ° C olabilir Agar herhangi bir büyüme belirtileri atın. </li></ol></li><li> Microinjections için İğneler. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Mikropipet kılcal çektirmenin iç filament ile 1 mm, 4-inç cam kapilerleri gerekli enjeksiyon iğne yapmak kullanın. İğneler Flamming / Kahverengi mikropipet Çektirme 550 ısı kullanılarak çekilmiştir, 120 kuvvet, hız, 200 ve bir zaman / 200 gecikme çekin. </li></ol></li></ol> 1.2 Embriyo Toplanması ve Mikroenjeksiyon Aparatı Kurulum <ol><li> EM ile dolu bir petri koydu ve korunur sonra döllenmiş yumurta hemen toplanır. Floresan dextrans enjeksiyon tek hücreli aşamada idealdir ve 16-hücreli evre 2 tarafından doldurulmalıdır. </li><li> Geniş bir ucu cam pipet kullanarak, EM ile dolu bir oda sıcaklığı enjeksiyon plaka kuyu içine embriyolar sınırdışı. Sıktı künt forseps ile yavaşça olukları dibine embriyolar kama. Koryon veya sarısı tehlikeye Embriyolar atılmalıdır. </li><li> 1-sulandırılmış floresan Alexa 594 çözüm 2μl (0.2 M KCl ağırlığının% 5) ile bir iğne yükleyin. Dekstran enjeksiyon iğnesinin uzunluğu çalışan gömülü filament nedeniyle kılcal etki enjeksiyon iğne ucu seyahat etmek için izin ver. </li><li> Stereotaktik mikromanipülatör kılcal sahibine bir iğne takın. </li><li> 40-50 Psi ve darbe süresi 500 milisaniye ile başlayan mikroenjektör aparat üzerindeki baskıyı ayarlayın. </li><li> Forseps (İdeal çapı 0.05-0.15mm) mühür kırmak için enjeksiyon iğne ucu hafifçe otlatmak. Steromicroscope kullanarak, tepesine iğne kalibre etmek için mineral yağ ile mikrometre üzerine dekstran sınırdışı. Hava basıncı, nabız süresi ve iğne ucu boyutunu ayarlayarak bolus boyutunu değiştirin. 0.8-1nl bir birime eşdeğer bolus enjeksiyonları 3 boyunca sağlanmalıdır. Genellikle ipuçları sarısı parçacıklar tıkanabilir; basıncı ayarlayarak veya iğne ucu kırılma sorunu hafifletmek olabilir, aksi takdirde yeni bir enjeksiyon iğnesi yüklü olmalıdır. </li></ol> Floresan Alexa 594 1.3 Microinjections <ol><li> Yüksek büyütme altında, çukur bir ucundan başlayarak, düzgün bir şekilde delmek embriyo koryon ve hücre zarı sarısı içine girmek için. Hücrenin hemen altında dekstran çözümü enjekte edilir. Aynı pürüzsüz hareketi ile embriyo girmek için kullanılan enjeksiyon iğnesi kaldırmak için emin olun. Sonraki embriyo satır içi konumu ve çukur uzunluğu aşağı enjekte devam petri taşıyın. Periyodik olarak basınç ve bolus boyutunu kontrol edin. Bu ölümcül embriyo ve / zarar veya enjeksiyon iğne kırılması muhtemel olduğu gibi embriyo iken enjeksiyon iğnesi hareket ya da eğmemeye dikkatli olun. </li><li> Embriyoların olukları forseps ile yavaşça dışarı itmek. Antibiyotik Kalem ile dolu bir petri aktarabilirsiniz / EM Nusslein-Volhard ve Dahm (2002) (1ml 6.5m CaCl 2, 1 ml 3,5 M NaHCO 3, 60mg/ml penisilin, 100mg / 25ml 20x EM ve 10ml açıklanan Adım ml streptomisin stock) daha sonra transplantasyon için hazırlık. 28.5 ° C ve monitör döllenmemiş yumurta veya embriyo ölüm embriyolar inkübe edin. </li></ol> Bölüm 2: Gastrula Sahne transplantasyon 2.1 Dechorionating ve Nakli Plaka Hazırlık <ol><li> 5 dökerek dechorionating plakaları, plakalar Dechorionating epiboly yumuşak bir alt plakası, daha önce açıklanan% 1.5 agaroz çözüm kullanarak kendi sarısı yapışır ve plastic.The gün önce nakli gözyaşı var gerektirmeyen tamamlamamış Dechorionated embriyolar 100mm bir petri içine erimiş agaroz -10 ml. Agaroz sadece ince bir katman (2-3mm) dechorination sırasında embriyoların yastık için gerekli. Soğumasını bekleyin. </li><li> Nakli plakaları İhtisas plakaları ayrılmış kuyu 4&#39;te açıklandığı gibi yapılması gerekir. 100mm bir petri içine 30 ml% 1.5 agaroz çözüm dökün ve nakli de kalıp bir takın. Kalıp 104 üçgen divots her üç 90 derecelik iki tarafın oluşan ve 45 derece açılı yan içermelidir. Kuyulardan iki embriyo yan tarafında (Şekil 1A, mor kutu) tutmak için tasarlanmıştır. Kalıbın altındaki tuzak hava kabarcıkları dikkat edin. Agaroz sertleşmesine izin verin. Kalıp çıkarma, eğimli bir kenarı ile kare kuyu içeren bir batık alanını ortaya çıkarır. </li></ol> 2.2 Embriyo ve Nakli Aparatı Kurulum <ol><li> Donör ve ev sahibi embriyoların yerleştirilmesi <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Host ve donörlerin Geliştirme yaş eşleştirilmiş eşleşmeleri yakın korumak için takip edilmesi gerekir. Bunu yapmak için, embriyolar yavaşlatmak veya sırasıyla gelişimi hızlandırmak için farklı sıcaklıklarda (25-31 ° C) büyüdü olabilir. </li><li> Hem ev sahibi hem donör embriyolar, bu 5hpf tamamlanması gerekir gastrula sahne nakli durumda istenilen yaş öncesinde agar-kaplı dechorionating plaka 1 saat dechorionated el olmalıdır. </li><li> 5.5hpf host ve donör embriyolar, sahne kalkan önce antibiyotik EM ile dolu bir nakli plakasına yüklenir. Embriyolar bir cam pipet kullanarak bireysel 1 mm kuyu içine yüklenir. Şöyle bir örnek: (iyi bir embriyo ortalama 9 embriyolar, satır başı) ilk satır donör embriyolar ile doludur (toplam 18 sıra her iki embriyo) ve aşağıdaki iki satır ana embriyolar ile doldurulur. </li></ol></li><li> Transplant aparat ayarlama <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Tam otomatik, joystick kontrollü zoom ve odaklama manipülasyon Zeiss Lumar floresan stereo mikroskop nakli yapılmaktadır. Nakli mikroskop bu otomasyon olmadan yapılabilir, dramatik, kolaylığı ve verimliliği yüksek bir sayıda nakli istenen özellikle artırmak. </li><li> Eppendorf AirTram ölçülerini orta konuma ayarlayın. Kılcal sahibine AirTram (Şekil 1A, kırmızı bir kutu) boru bağlayın ve Eppendorf otomatik mikromanipülatör (Şekil 1A) sahibinin güvenli. Bu mikromanipülatör tam otomatik ve kontrollü joystick. Yine, bu otomasyon tamamen gerekli değildir ama önemli ölçüde embriyo etrafına ve içine iğne gezinmek için olanlar yeteneğini geliştirir. Ancak, biz, AirTram herhangi bir zorluk vardı; Alternatif olarak, birçok araştırmacı hücre toplama yumuşak kontrol sunmak için söylenir OilTram tercih . </li><li> Kılcal damarların kullanılan, 15 metre eğimli ucu (Şekil 1A yeşil kutu) ucu ve 20 derece bükülmüş açısı 1mm açılması steril Eppendorf TransferTips (ES) . </li></ol></li></ol> 2.3 Gastrula Sahne Hücre nakli <ol><li> 6hpf anda mikromanipülatör kullanarak hafifçe pozisyonda, orta hat ve kalkan görünür ve kılcal ucu karşı bu tür hücre ekstraksiyon için embriyo döndürmek için kapiler ucu ile embriyo otlatmak. Aspire kapiller içine EM hücrelerine zarar hava-su arayüzü, bağlantı hücreleri herhangi bir şans önlemek için küçük bir miktar. </li><li> Zebrafish kaderi harita üzerinde, ön beyin hücrelerini hedef tam hayvan kutup ve kalkan 5 arasındaki orta hat hücrelerinin nakli gerektirir . Hafifçe delmek bu konuma donör embriyo ektoderm (rodamin enjekte veya GFP transgenik embriyolar). Gastrula ektoderm ve altta yatan sarısı arasında hücrelerinin kalınlığı incedir, genellikle birkaç saat içinde ölüme yol açacak bu nedenle, yumurta sarısı kazığa oturtmak için dikkatli kullanın. AirTram aspirat hücreleri kılcal yavaş yavaş kullanma. Her zaman su hattı görünürlüğünü korumak. Donör ise ucu hafif ajitasyon hücre-hücre kişileri gevşek yardımcı olacaktır. Donör embriyo yaklaşık 10-50 hücreler embriyo kaldırılmadan önce çıkarılması olmalıdır. </li><li> Donör, benzer şekilde yönlendirmek ev sahibi ve delgi kılcal çıkarın ve tam olarak sa içine hücreleri sınırdışıbana hayvan kutup ve ev sahibi embriyoların kalkan arasındaki konumu. </li><li> Transplantasyondan sonra, donör ve host embriyolar kuyulardan kaldırıldı ayrılmış ve antibiyotik EM ile dolu bir agar kaplı petri yavaşça yerleştirilir. Nakli kuyularda embriyolar bırakmak mortaliteyi artırmaktadır. 28,5 az inkübe embriyolar ° C </li></ol> 2.4 görselleştirme ve Görüntüleme Embriyolar <ol><li> Sabit ve canlı embriyoların Montaj. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Transgenik GFP veya rodamin enjekte edilen embriyolar türetilen ev sahipliği embriyolar ya da diri olarak sabit embriyolar görüntülenebilmekte ve görüntülü olabilir. Biz burada hem sabit ve canlı görüntüleme seçenekleri örnekler sunuyoruz. Fix embriyolar 4 C 1 gecede 0.1M fosfat tamponu (PB)% 4 paraformadehyde kullanarak 30hpf kurban edildi. </li><li> 0.1M PB 3 x 5 dakika sonra yıkayın embriyolar 2x ve durulayın. </li><li> Verdiğimiz örnekte, sabit ev sahipliği Asetillendirilmiş tubulin (α-AT) olarak daha önce 6 açıklanan yöneltilen antikorlar ile tüm aksonlar immunolabeled. </li><li> % 75 gliserol yerleştirin embriyolar, daha sonra 4 saklamak oda sıcaklığında lavabo ve ° C </li><li> Iki embriyo monte etmek için bir slayt hazırlayın. Oluşturun iki vazelin kare kare lamel iç şekil ve çap uygun bir slayt özetliyor. </li><li> Bir embriyo Deyolk ve önbeyin bir ön görünümü için ön beyin, orta beyin karşısında dik keserek teşrih. Bu doku gliserol az miktarda petrol kuyusu içinde yerleştirin. Orient uygun pozisyona doku ve lamel numune üzerine yerleştirin. </li><li> Canlı örnek Tricaine% 4 (EM) çözüm cam alt kültür yemekleri üzerine yapılan bir% 0,75 &#39;lik agaroz çözüm monte edildi. Agaroz katılaşmadan önce, embriyo görüntüleme için doğru yönlendirmek için bir tungsten iğne ile değiştirilebilir. Lamel karşı doğrudan analizi için ön beyin odaklı. </li></ol></li><li> Görüntüleme <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Her iki sabit ve canlı ana Leica SP5 Lazer Tarama Konfokal Mikroskop kullanarak görüntülü. Z-Yığınları kazanılmış ve 3 - veya 4-boyutlu görüntü işleme Volocity yazılımı kullanılarak tamamlandı. </li></ol></li></ol> Sonuçlar: Önbeyin Astroglial hücrelerin rolü adresine bir çaba hem küçük kümeler diensefalik ve telencephalic hücreleri ve bu hücrelerin hedef farklı genetik manipülasyonlar görselleştirmek için gereklidir. Kimerik embriyolar bu tür oluşturmak için, hangi embriyonun içinde Astroglial nüfusun bir kısmını olsun, genotip ve fenotip gastrula kullanımı ile astroglia etiketler GFP transgenik embriyolar, kullanımı birleştiren çok yönlü bir yaklaşım, kullanılan farklı hücre nakli düzenledi. Diensefalon bizim klonlar özellikle hedeflemek için, biz hayvan kutup ve kalkan 5 (Şekil 1B) eşit uzaklıkta orta hatta hücrelerin seçici ayıklamak için zebrafish gastrula kaderi harita kullanılmıştır. Çıkartılan bu tg [GFAP: GFP] hücreler daha sonra sonra 30hpf kaldırdı ve ön beyin anatomisi için referans simgesel olarak bütün aksonlar (α-Asetillendirilmiş tubulin) immunolabeled vahşi bir türü konak gastrula, aynı yerde naklediliyor. Burada bir örnek gösterildiği gibi, bir ev sahibi embriyo konfokal görüntüleme telencephalon ve diensefalon (Şekil 2A) boyunca izole GFP + hücreler ortaya koymaktadır. Tam bu GFP + hücrelerinin morfolojisi, bu hücrelerin en karakteristik radyal glial morfolojisi, soma ventrikül bölgesine bitişik bulunan ve büyük bir ucunu ayak radyal işlemi sonlandırır aldığını ifşa bu klonal tayininde görülebilir pial yüzey (Şekil 2A, içerlek). Toplanan bu optik dilim Z-yığın üç boyutlu render açıkça etiketli aksonlar (Film 1) ile ilgili bu hücrelerin yerini gösterdi. Nakledilen hücrelerin görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir başka yaklaşım başlangıçta tek hücreli sarısı içine Alexa 594 gibi bir floresan hücre boya, microinject yabani türü veya GFP transgenik embriyo düzenledi. Bir örnek olarak tek hücreli aşamada, içine Alexa 594 vahşi tip embriyolar enjekte edilir. Biz onlara kalkan aşamalı gastrula geliştirmek için izin verilen ve daha sonra yukarıda da belirtildiği gibi önbeyin hedef nakli yapılan, ancak bunun yerine transgenik konak gastrula tg [GFAP: nük-GFP] naklediliyor . Lazer Tarama mikroskopisi dorsal telencephalon Görüntüleme GFP arasında donör hücreleri floresan kırmızı kümeler + ön beyin içindeki çekirdekleri (Şekil 2B) saptandı. Biz daha Lazer Tarama Konfokal ile iki saat boyunca Z-yığınlar her üç dakikada toplayarak bu konak analiz. Volocity yazılım (Doğaçlama) kullanarak bu timelapse 4-boyutlu render rodamin hücre zarları dinamik hücresel hareketler gösterirnd GFP + çekirdek (Movie 2). <img border="0" src="/files/ftp_upload/1422/1422fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1422/1422fig1.jpg">Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için tıklayınız.</a> Şekil 1: deneysel yöntemler Nakli cihaz ve şematik. A) Apparatus gastrula aşamalı nakli yapmak için kullanılır. Zeiss Lumar floresan stereo mikroskop bu nakli yapmak için kullanılmıştır. Joystick kontrollü odak ve zoom (kırmızı daire solda). TransferMan NK Joystick kontrollü (sağda kırmızı daire) olan kılcal pozisyonu işlemek için kullanılmıştır. Kurulum sırasında 60-80 embriyolar, daha önce bir plastik kalıp (mor ana hatlarıyla kutu) ile 100mm bir petri yapılan bireysel agar kuyu içine yerleştirilir. Eppendorf tarafından üretilen kılcal nakli (TransferTip) 15μm iç çapı açılması ve 20 derece açılı ucu (yeşil ana hatlarıyla kutu) vardır. Hücre aspirasyon Eppendorf AirTram (kırmızı ana hatlarıyla kutu) ile kontrol edilir. B) ana embriyolara donörden gastrula sahne nakli prosedürünün İllüstrasyon. Embriyolar (burada görüldüğü gibi) veya Alexa 594 enjekte donör embriyolar (protokol açıklanan): Hücreler tg [GFP GFAP] elde edilir. Hücreler yarım kalkan ve hayvan kutup arasındaki orta hat kaldırıldı ve ana embriyoların aynı bölgeye nakledilmektedir. Konaklar sabit ve Konfokal Mikroskop Tarama Lazer kullanılarak görüntülenmiş. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1422/1422fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1422/1422fig2.jpg">Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2. Zebrafish Önbeynin gastrula sahne nakli Örnek A) nakledilen tg [GFAP: GFP] vahşi tip ana embriyoların önden görünümü. Zebrafish önbeyin diencephalons ve telencephalon hücreler. Aksonlar kırmızı etiketli (α-Asetillendirilmiş tubulin antikor) ve nakledilen hücrelerin yeşil (endojen GFP ifade) olarak etiketlenir. Embriyolar 30 hpf. Ankastre gösterir GFP + hücreler radyal glial morfolojisi. Rodamin floresanlama nakledilen hücrelerin (kırmızı) ile ev sahibi embriyo: canlı tg [nük-GFP GFAP] telencephalon B) Dorsal görünümü. Ev sahibi embriyoların Çekirdekler yeşil (GFP) etiketlenir. Kesikli çizgi önbeyin ön yüzeyi özetliyor. Düz çizgi, ventriküler dilimini gösterir. Ölçek çubuğu 10μm. Movie 1. Önbeyin commissures arasından ektopik etiketli radyal glial hücreler arasındaki ilişki bir gastrula hücreler sahnelenen tg [GFAP: GFP] embriyo GFP transgenik olmayan bir vahşi tip hattına naklediliyor. Lazer Tarama Konfokal Z-Yığın Volocity yazılımı kullanarak 3 boyutlu render için toplanan ve sonra işlendi. Başlangıçta, görüntü 30hpf zebrafish önbeyin bir ön görünümü ve yatay olarak Şekil 2B ile karşılaştırıldığında çevrildiğinden. Aksonlar ön komissür (AC, üst) ve post-optik komissür (POC, alt) içinde (bir Asetillendirilmiş tubulin, kırmızı) görülür. Yeşil hücreler, GFP + nakledilen hücrelerin önbeyin ve oluşturulan açık radyal glial morfolojisi kök saldı. Film ilerledikçe POC temas sonunda ücret sahip iki radyal glial hücreler üzerinde odaklanmaktadır. <a href="/files/ftp_upload/1422/Deschene&amp;BarresiMovie1.mov">Movie 1 indirmek için buraya tıklayın.</a> Movie 2. Önbeyin nakledilen Alexa 594 Etiketli Hücreler Timelapse görüntüleme tg Alexa 594 ile enjekte gastrula hücreler naklediliyor. [GFAP: nük-GFP] transgenik embriyolar. Bu film, Z-yığınlar her 5 dakikada alındığı bir 2s timeseries bir 3-D projeksiyon temsil eder. Z-Yığınları konfokal mikroskop bir lazer tarama toplanan ve 4-D kaplamalar Volocity yazılım kullanılarak tamamlanmıştır. Nakledilen hücrelerin Alexa 594 (kırmızı) etiketli ve GFP + çekirdekleri yeşil. Bu timelapse çalışır gibi, 4D görüntü 30hpf az önbeyin bir sırt görünümü ile başlar net hareketi tüm nakledilen hücrelerin hücre membranlar GFP tespit edilir gibi, X ekseni hakkında döndürmek olacak + çekirdekleri de. <a href="/files/ftp_upload/1422/Deschene&amp;BarresiMovie2.mov">tıklayınız Film 2 Download.</a>

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio.">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+A+Practical+Approach.">Zebrafish A Practical Approach.</a> , (2002).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish,+a+practical+approach.">Zebrafish, a practical approach.</a> 1, 121-121 (2002).</li><li>Woo, K., Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+maps+of+the+zebrafish+embryo.">Fate maps of the zebrafish embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 5 (4), 439-439 (1995).</li><li>Barresi, M. J., Hutson, L. D., Chien, C. B., Karlstrom, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+regulated+Slit+expression+determines+commissure+and+glial+cell+position+in+the+zebrafish+forebrain.">Hedgehog regulated Slit expression determines commissure and glial cell position in the zebrafish forebrain.</a> Development. 132 (16), 3643-3643 (2005).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75 (5), 551-551 (1997).</li><li>Halloran, M. C., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1953 (2000).</li><li>Hardy, M. E., Ross, L. V., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+gene+misexpression+in+zebrafish+embryos+induced+by+local+heat+shock+using+a+modified+soldering+iron.">Focal gene misexpression in zebrafish embryos induced by local heat shock using a modified soldering iron.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3071-3071 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kimerik embriyolar oluşturma birkaç model sistemleri, yani meyve sineği (D.melanogaster), solucan (C.elegans), Zebra balığı (D.rerio) ve fare (M.musculus) içinde birçok araştırma soruları adresleri güçlü bir araçtır. Biz zebrafish model sistem benzersiz, nispeten kolay, hızlı ve çok yönlü kimeralar üretmek için uygun olduğunu savunuyorlar. Zebra balığı, önemli ölçüde daha erişilebilir fare modeli ile karşılaştırıldığında anne dışında gelişen bir omurgalı. Zebra balığı da embriyolojik hücre nakli gibi manipülasyonlar kolaylaştırır sinekler veya solucanlar, önemli ölçüde daha büyük. Ayrıca, transgenik teknikleri ile hücre nakli yöntemleri birleştirme yeteneği, geniş bir dizi gen fonksiyonu yerelleştirilmiş bir doku-spesifik bir şekilde manipüle edilebileceği olası deneyler sağlar. Örneğin, GFP + veya rodamin etiketli hücreleri küçük klonlar, genellikle bir homozigot transgenik donör kayıp ya da ortak antikorlar ile diferansiyel hücre içi etiketleme nedeniyle görselleştirmek için imkansız tam hücre morfolojileri karakterizasyonu sağlar. Ayrıca, transgenically etiketlenmiş veya floresan dolu hücreleri kullanarak, biz, zaman içinde canlı zebrafish embriyo donör hücreleri izleyebilirsiniz. Tek tek hücrelerin Timelapse görüntüleme bir roman bağlamında tüm organizmanın hücresel davranış analizi sağlar. Bizim laboratuvar de ısı çarpması, belirli bir akson rehberlik inkübasyon sıcaklık yükselmesi (verileri göstermiyor) aşağıdaki ipuçlarını donör hücreleri misexpressed olabileceği gibi hücre transplantasyon ile transgenik hatları indüklenebilir birleştirir. Bu teknik bize belirli bir proteinin gelişimi nasıl etkilediğini görmek için izin veren bir mekansal ve zamansal özgü bir şekilde, yerel bir ilgi protein misexpress son derece güçlü ve doğrudan bir bir yaklaşımdır. Bizim durumumuzda, bu tekniği commissures ve orta hat 5 glial hücreleri konumlandırma Yarık-Robo rehberlik ipuçlarının işlevi arkasında bilgimizi uzatabilirsiniz. Odak UV uncaging ve lokalize heatshock araçları (lazer ya da havya) gibi yerel misexpressing genler Diğer yaklaşımlar, genleri ve hücreleri 7-9 küçük bir küme işaretleri ifade işlemek için alternatif yol sunar, ancak hücre nakli kurar bir son ortamında analiz, UV, lazer ya da ısı hücre nakli, daha kontrollü bir deneysel yaklaşım ile indüklenen herhangi bir travma. Sonuç olarak, biz, bizim nörogelişimsel biyoloji araştırma çok önemli bir parçası olmak için hücre nakli prosedürleri bulduk. Farklı özelliklere sahip hücre klonları oluşturma, hücre davranışlar, gen fonksiyonu ve hücre özerklik temel sorulara yanıt gelişim biyolog için kritik bir araçtır.

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Özellikleri </td></tr><tr><td> Petri kutularına </td><td> Araç </td><td> Fisherbrand </td><td> 08-757-13 </td><td> 100 x 15 mm </td></tr><tr><td> Cam alt kültür plakaları </td><td> Araç </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-2.0-C </td><td> 35 x 15mm, 1.5 Kaplamasız, Gamma-ışınlanmış </td></tr><tr><td> Geniş Çaplı Cam Pasteur pipetleri </td><td> Araç </td><td> Fisherbrand </td><td> 63A-53-WT </td><td></td></tr><tr><td> Çukur kalıpları, cam elyaf kapilerleri (filament olmadan) ve enjeksiyon iğneleri (filament) </td><td> Araç </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B150F-4 </td><td> 4 inç (100 mm), 1,5 / 0,84 OD / ID (mm) </td></tr><tr><td> Nakli kılcal (TransferTip) </td><td> Araç </td><td> Eppendorf </td><td> 83000122-8 </td><td> Tip IV, steril, Int. 15μm; 20 derece bükün </td></tr><tr><td> Nakli kalıp </td><td> Araç </td><td> Adaptif Bilim Araçları </td><td> PT-1 </td><td> Bireysel embriyolar tutmak için 150 üçgen divots </td></tr><tr><td> Agaroz, Tip I </td><td> Reaktif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A6013-250G </td><td> % 1.5 agaroz EM </td></tr><tr><td> (Antibiyotik) Embriyo Orta </td><td> Reaktif </td><td></td><td></td><td> Westerfield, 2007 </td></tr><tr><td> Fosfat Tampon </td><td> Reaktif </td><td></td><td></td><td> Westerfield, 2007 </td></tr><tr><td> Bekçi Forseps </td><td> Araç </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td></td><td> 100 + mm ucu (mat), 50mm ucu </td></tr><tr><td> Rodamin B Dextran&#39;ın </td><td> Lineage tracer boya </td><td> Moleküler Problar, Invitrogen </td><td> D1824 </td><td> MW 10.000 Da, yeşil (570nm) hafif heyecan lizin-tamir edilebilir, kırmızı (590nm) floresan boya </td></tr><tr><td> Diseksiyon Mikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> SZX7 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Stereo mikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Lumar </td><td> Tam Otomatik Joystick Kontrollü (Sycop) </td></tr><tr><td> Nakli Aparatı </td><td> Araç </td><td> Eppendorf Corp. </td><td> AirTram </td><td></td></tr><tr><td> Otomatik Mikromanipülatör </td><td> Araç </td><td> Eppendorf Corp. </td><td> TransferMan NK2 </td><td> Joystick Kontrollü </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Araç </td><td> Uygulamalı Scientific Instruments, Inc. </td><td> 00-42-101-0000 </td><td> MM33 sağ </td></tr><tr><td> Geri Basınç Ünitesi ile mikroenjektör </td><td> Araç </td><td> Uygulamalı Scientific Instruments, Inc. </td><td> MPPI-2 BPU </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Kahverengi mikropipet Çektirme </td><td> Araç </td><td> Sutter Enstrüman Şirketi </td><td> Model P97 </td><td> Program: Isı 550; Hızı 200; Zaman / Gecikme 200; Gücü 120 çekin. </td></tr></tbody></table>

tissue targeted embryonic chimeras: zebrafish gastrula cell transplantation

Hücreleri roman ortamlarda yerleştirilir ya da daha geniş bir bağlamda hücrelerin küçük gruplar değişmiş gelişimsel biyoloji alanında bazı temel sorulara cevap olabilir. Bir hücre ile etkileşim ve eşsiz bir ortamda nasıl davrandığını izlemek, hücre fonksiyonları karakterize için gereklidir. Belirli bir protein etkilerden hücreleri çevreleyen protein gelişim süreçlerinin çeşitli oynadığı rolleri lokalize misexpression anlayışlı bilgi sağlar belirlenmesi. Bizim laboratuvar benzersiz genotipik veya fenotipik kimeralar üretmek için genetik yaklaşımlar klasik nakli teknikleri ile birleştirmek için zebrafish model sistem kullanır. Biz nöron glial hücre etkileşimleri zebrafish önbeyin commissures oluşumu sırasında çalışma. Bu video laboratuarımızda Astroglial diensefalon nüfus ve orta hatta çapraz olarak projelendirme aksonlar etkiler özel rehberlik ipuçlarının rolleri rolünü araştırmak için izin veren bir yöntem açıklanır. Şeffaflık zebrafish embriyolar nedeniyle ektopik hücre yerleşimi veya lokalize gen misexpression bu tür için ideal modellerdir. Takip nakledilen hücrelerin yaşamsal bir boya veya floresan proteini ifade eden bir transgenik balık hattı kullanılarak yapılabilir. Gastrula başka embriyo sahnelenen bir hücre nakli için hayati bir boya tracer ile donör embriyoların nasıl hazırlanacağını özü ve nakli nasıl yanı sıra, burada göstermektedir. Biz zebrafish embriyoların Önbeynin ektopik GFP + transgenik hücrelerin gösteren veriler mevcut ve bu hücrelerin yerini commissures önbeyin saygı ile karakterize. Buna ek olarak, GFP + transgenik konak embriyo içine nakledilen Alexa 594 etiketli hücreleri konfokal timelapse lazer tarama mikroskopisi göstermektedir. Bu veriler, gastrula sahnelenen nakli Gelişimsel Biyoloji soruları çeşitli adresine ektopik hücrelerinin hedeflenen konumlandırma sağlar kanıt.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation at JoVE.com

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

tissue-targeted-embryonic-chimeras-zebrafish-gastrula-cell

Research

JoVE Journal

Biology

19.2K Görüntüleme.  Smith College. Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Video: Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...