Bu videoda, morfolojik ve proteomik analiz için embriyonik sıçanların superior servikal gangliyonunun culturing'ini göstereceğiz. Diseksiyona başlamadan önce kontrol ve diseksiyon ortamı nı hazırlayın. Kontrol ortamı F-12 ve düşük glukoz Lum içeren bir insülin-selenyum-transferrin karışımı ile takviye, glutamin, sinir büyüme faktörü, ve BSA.
Diseksiyon ortamı, kalem-strep ve BSA ile birlikte L-15 içerir. Medya hazırlığı için ayrıntılı protokoller için el yazmasına bakın. Nöronların kültüre için plakahazırlanması.
Steril distile su ile mililitre başına 100 mikrogram poli-D-lizin stoğu başına bir miligram seyreltin. Proteomik veya genomik analiz için, diseksiyondan bir ila iki gün önce, altı kuyulu plakaları yaklaşık iki mililitre steril 100 gram lık poli-D-lizin mililitresine katedin. Bu kuyuya hücre yapışmasını sağlamak için gereklidir.
Plakaları yapışkan filmle sarın ve tabakları bir gecede dört derece saklayın. Diseksiyon günü, diseksiyon başlamadan önce, kuyulardan poli-D-lizin çözeltisini çıkarın ve kuyuları steril distile suyla beş kez durulayın, ardından düşük glikozlu DMEM ile bir kez durulayın. Gangliyonun enzimatik sindirimi sırasında, hücreleri kaplamadan yaklaşık bir saat önce, DMEM'i plakalardan aspire edin ve 0.3 mililitre kontrol ortamı ile değiştirin.
Plakaları 35 derecede nemlendirilmiş bir odada %5 CO2 altında saklayın. Başlık, diseksiyon için aşağıdaki öğeleri ayarlayın. Her tüpte yaklaşık 20 mililitre diseksiyon media ile dört 50 mililitre steril konik tüpler.
Dört steril 35 milimetrelik tabak ve 1.5 mililitre diseksiyon ortamı. Santrifüj için 20 mililitre diseksiyon media ile bir steril 50 mililitre konik tüp. Bir 15 mililitre steril konik tüp gangliyonu santrifüj için, bir steril 10 mililitre tüp ayrıştırılmış hücreleri toplamak için.
En az bir dakika boyunca ince forseps bir çift sterilize etmek için kuru boncuk sterilizatör kullanın. Hayvanlarla ilgili çalışmalarda yapılan tüm prosedürler, Saint Mary's College of California'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Saint Mary's College of California'daki hayvan bakımı ve kullanım kılavuzları, Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi tarafından sağlanan yönergelere göre geliştirilmiştir.
Hamile sıçandan E21 embriyolarının alınması. Çevredeki alan iyice sterilize edilirse rahim boynuzunun çıkarılmasının kaputun dışında yapIlebilmektedir. Co2 soluma ile hamile bir sıçan ötenazi.
Karın bölgesinden kürk yamak ve sterilize etmek için% 70 alkol ile bölgede cilt silin. Steril makas ve forceps taze bir set kullanarak, deri ve daha sonra embriyolar içeren rahim boynuzları ortaya çıkarmak için kas ile kesti. Bu süreçte bağırsaklara zarar vermemeye özen görerek yeni bir makas ve çalgılar seti kullanarak, embriyolarla rahim boynuzunu çıkarın.
150 milimetre steril Petri çanak içine embriyolar ile rahim boynuzu transfer ve kaputiçine aktarın. Forceps ve makas yeni bir dizi kullanarak, rahim boynuzu gelen embriyolar kaldırmak ve amniyotik membranlar ve plasenta embriyoları ayırın. Embriyoları ötenazi yapmak için, sağ kol altında orta çizgi boyunca embriyoların omurilik kesti.
Bu SCG çıkarılması sırasında karotis arter kanaması azaltacaktır. Bu embriyoları diseksiyon ortamı içeren hazırlanmış 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Embriyoların medyaya gömüldüğünü emin ol.
Her tüp üç embriyo tutabilir. Embriyodan superior servikal ganglion izolasyonu. Diseksiyon medyasından bir yavruyu, substrat üzerindeki dorsal yüzeyi ile yarı katı substratla dolu steril 150 milimetrelik Petri kabına aktarın.
Üç steril 23 gauge iğnekullanarak, dikkatle boyun hiperextend ağız yoluyla her kol altında bir iğne ve ağız yoluyla üçüncü bir iğne ile çanak pub pin. Altında tükürük bezleri ortaya çıkarmak için steril ince çalgılar kullanarak boyun bölgesinde deri ile kesin. İnce forceps kullanarak bu bezleri çıkarın.
Sırasıyla köprücük kemiği ve trakea yakın sternokleidomastoid ve omohyoid kasları bulun. İlk olarak, enine sternokleidomastoid kasları kesin. Ve sonra dikkatle ince forceps kullanarak ince omohyoid kas kesti.
Bu kaslar çıkarıldıktan sonra, ön uçta karotis arter bifurkasyon, karotis arter bu çatal altında bulunan SCG ile trakea nın her iki tarafında görünür olacaktır. Kapalı forseps kullanarak, scg görselleştirmek için yavaşça karotis arter kaldırın. SCG'nin her iki tarafında bir tane forceps kullanarak karotisi çıkarın ve hazırlanan steril 35 milimetrelik yemeklere aktarın.
Bu doku büyük olasılıkla karotis arter ile SCG içerecektir, nodose gangliyonu ile vagus sinir, yanı sıra bölgede kas veya yağ diğer segmentleri. Diğer taraftaki diseksiyon işlemini tekrarlayın. Özetlenen kalan diseksiyon adımlarına devam etmeden önce tüm embriyolardan SG'leri çıkarın.
Doku örneklerinin işlenmesini kolaylaştırmak için izole edilmiş dokuları 35 milimetrelik tabakların ikisi arasında dağıtın. SCG'nin işlenmesinden sonra. SCG'yi parçalanmış dokudan ayırmak için, önce karotis bifurkasyona yakın bölgeden uzak durmaya özen görerek kas veya yağ gibi yabancı olmayan dokuları çıkarmak için ince kesetler kullanın.
Bu dokular çıkarıldıktan sonra, iki gangliyon görünür. SCG badem şeklinde iken nodose ganglion küçük ve dairesel. Vagus sinirini ve nodose ganglionu karotisten ayırmak için vagus sinirini yavaşça çekin ve scg'yi karotis arterden ayırın.
SCG çevreleyen kapsül kaldırmak için ince forceps kullanın. SCG'yi 35 milimetrelik yeni bir kültür yemeğine aktarın. Bu işlemi tüm diseksiyonlu doku örnekleri ile tekrarlayın.
Dokunun pipet duvarlarına yapışmasını önlemek için sterilize edilmiş, pamukla tıkanmış cam pipeti diseksiyonu ile kaplayın. Dokuların parçalanmasına yardımcı olmak için diseksiyon ortamını steril iki mililitre kollajenaz tip II, kalsiyum ve magnezyumiçermeyen HBSS'de dispase tip II ve 37 santigrat derecede 50 dakika kuluçkaya yatırmak için pipetkullanın. Kuluçka sürelerinin farklı kollajenaz/dispase gruplarla optimize edilmesi gerekebileceğini ve genellikle 40 dakika ile bir saat arasında değişeceğini unutmayın.
Kuluçkadan sonra, SG'leri ve kollajenaz/dispase'yi steril 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Plakaları durulamak ve çözeltiyi tüpe aktarmak için diseksiyon ortamını kullanın. Yaklaşık 10 mililitre ses getirmek için yeterli diseksiyon ortamı ekleyin.
200 x g, 1, 000-1, 200 rpm oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüj numune pelet. Supernatant aspire, pelet yerinden değil dikkat. 10 mililitre diseksiyon media ile peleti yeniden askıya alın, santrifüjü tekrarlayın ve süpernatantı atın.
Kültür ortamının bir ila iki mililitre ile değiştirin. Dar delikli, bükülmüş uçlu steril Pasteur pipetini kullanarak, kültür ortamıyla ön katlayın, beş ila altı kez hafifçe triturating ederek kümeleri mekanik olarak ayrıştırın. Büyük kümeler yaklaşık bir dakika razı olsun ve yeni bir 10 mililitrelik tüp için supernatant hücre süspansiyon aktarın.
SG'lerin neredeyse tamamen ayrışmasını sağlamak için her seferinde artan üç triturasyon kuvveti ile bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Hacmi sekiz ila 10 mililitreye çıkaracak kadar kültür ortamı ekleyin.
Bir hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve hücre yoğunluğunu hemositometre ile ölçün. Deneyler için uygun hücre yoğunluğunda hücre süspansiyonu kuyulara dağıtın. Hücrelerin kuyulara eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için kaplama işlemi sırasında hücre süspansiyonuna sürekli olarak karıştırın.
Morfolojik analiz için, 24 kuyulu bir plaka da kuyu başına 8.000 hücre etrafında hücreleri plaka. Ve genomik ve proteomik protokoller için, hücreleri kuyu başına 30.000 hücreye kadar çık. Bir nemli oda oluşturmak için alt steril su ile bir cam kurutucu plakaları aktarın.
Sızdırmazlıktan önce kurutucuda %5 CO2 ortamı elde etmek için yeterli CO2 enjekte edin, yaklaşık 120 mililitre. Plakaları 35.5 santigrat derecede koruyun. Bu, protokolde sıfır günü olarak adlandırılır.
Bu plakalar aynı zamanda düzenli olarak %5 CO2 inkübatörde muhafaza edilebilir. Yukarıda açıklanan yöntem sıcaklık ve pH değişikliklerini en aza indirir ve çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur. Kültürdeki SCG nöronların ve tedavilerin bakımı.
Bu resimler, birinci gün, birinci gün ve beşinci gün, parçalanmış superior servikal gangliyon hücrelerini gösteriyor. Gün sıfır görüntü kaplama üzerine hücreleri gösterir. Sıfır.
İlk gün, kaplamadan 24 saat sonra, kültür medyasının yarısını dikkatlice çıkarın ve iki mikromolar Ara-C, sitozin D-arabinofuranoside, bir anti-mitotik ajan ile değiştirin. Tedaviyi 48 saat boyunca hücrelerde bırakın. Genellikle tedavi nin bu uzunluğu kültürde olmayan nöronal hücreleri ortadan kaldırmak için yeterlidir.
Üçüncü gün, yavaşça yarım orta aspire ve kontrol ortamı ile değiştirin. Dördüncü günde, hücreler deneysel tedaviler için hazır. Kültürleri her gün uygun ortamla besleyin.
Kuyudaki ortamın yarısını taze orta ile hafifçe değiştirin. Beşinci gündeki resimde dendritik büyüme gözlenmeden geniş aksonal büyüme görülmektedir. Dendritik büyümeyi sağlamak için, nöronlar Matrigel'de yetiştirilebilir veya kemik morfogenetik protein-7 mililitrebaşına %10 serum veya 50 nanogram ile tedavi edilebilir.
Şekil 2, BMP-7 ile tedavi den sonra E21 sıçan SCG nöronlarının nöronal morfolojisinde değişiklikler göstermektedir. 10 X büyütmede temsili faz kontrast mikrografları, a panelindeki kontrol nöronlarında aksonlu dairesel nöronal hücre gövdesini ve uygun tedavileri takiben B.Kültür dönemli SCG nöronlarında oklarla gösterilen BMP-7 ile tedavi edildiğinde birden fazla kısa dendrite benzeri prosese sahip nöronların genomik analiz ve biyokimyasal çalışmalar için immünositokimyasal boyama kullanılarak morfolojik analiz için kullanılabileceğini göstermektedir. proteomik analizler gibi. İmmünboyama ve proteomik analiz için numune hazırlama için ayrıntılı protokoller için el yazmasına bakın.
Şekil 3 kültürlü embriyonik sıçanlarda MAP-2 proteininden immünboylama gösterir sempatik nöronlar. Paneller A d göstermek kültürlü SCG nöronlar kontrol ortamı ve paneller E H ile tedavi göstermek nöronlar BMP-7 ile tedavi 50 mililitre başına nanogram beş gün boyunca. C ve G'de mikrotübül ilişkili protein-2 ile nöronların immünositokimyasal boyanmasını gösteren temsili mikrograflar, B ve F faz kontrast mikrograflar ile D ve H bir nükleer leke, ve Mikrotübile ilişkili protein-2 gelen A ve D.Immunocytochemical boyama üç kanal ortaya hücre vücudunda ve panel C kontrol nöronların proksimal aksonları mevcut.Ve hücre vücudunda MAP-2 protein boyama , ve BMP-7 tedavi nöronlarda dendritler panel G.Here kontrol ortamı ile tedavi üstün servikal ganglia bir örnek çalışma, tespit 1, 100 protein.
Panther veritabanını kullanan gen ontolojisi proteinlerin çoğunun sitoplazmik olduğunu buldu. Ancak, örnekte hücresel kavşaklarda membrana bağlı proteinler ve proteinler vardı. Bu analiz ayrıca, örneklemde çok çeşitli nöronal sinyal yollarında yer alan proteinlerin tespit edildiğini ortaya koymuştur.
Sonuç olarak, bu videoyu izledikten sonra, morfolojik ve proteomik analiz için sıçan embriyonik üstün servikal ganglion nöronlar izole etmek ve kültür gerekir. Bu çalışma, Saint Mary's College of California'daki fakülte geliştirme fonu ve yaz araştırma programı tarafından finanse edilmiştir.
