We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

İn vivo görüntüleme Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller kullanılarak patojensiz tesislerinde yapılır. NOT: Bu görüntüleme protokolü retina mikroglia ve infiltre monositler / makrofajlar fractalkine reseptör lokus (CX3CR1) kontrolü altında, yeşil fluoresan protein (GFP) ifade eden raportör fareler için kullanılır. Konfokal Tarayıcı Lazer Oftalmoskopide tarafından Retina GFP + mikroglia Vivo Görüntüleme 1. (cSLO) <ol><li> İşlem sırasında 35-37 ºC arasında fare sıcaklığını dengelemek için ayarlanmış su kontrollü ısıtma sistemi, açın ve iki ısıtma pedleri bağlayın. <ol><li> Konfokal tarayıcı laser oftalmoskop (cSLO) sistemi (Şekil 2A) başlatın. Bireysel fare tanımlamak ve 2 mm (Hasta Veri menüsü) bir kornea eğriliğini koyacaktır bilgileri girin, cSLO programını açın. </li></ol></li><li> Ima hazırlanınging. Güvenli yuvasından temiz bir 55º geniş alan objektif lens takınız. Temiz kağıdı ile kaplı bir ısıtma yastığı güvence altına alarak oftalmoskop görüntüleme platformu hazırlayın. Ped ve kağıdı düzleştirmek ve objektif lens hareketini engelleme onları tutmak için klipler kullanın. </li><li> % 1.3 2,2,2-tribromoetanol ve% 0.8 tert-amil alkol intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi (250 mg / kg vücut ağırlığı; 0.5 ml / 25 g vücut ağırlığı), bir 1 ml tek kullanımlık takılan bir 30½ G iğne kullanılarak Şırınga. Kendi kafesine fare dönün, bir ısıtma yastığı üzerinde tuttu. NOT: Teneffüs karşı enjeksiyon yoluyla anestezi teslim burun koni ve boru ücretsiz görüntüleme ve gözlere engelsiz erişim için fare, daha kolay konumlandırma izin verir. </li><li> Hayvan hareket durur ve kuyruk tutam tepkisiz sonra, eğilimli hayvan konumlandırılması ve 7 dakika boyunca damla her iki gözlerini kapatarak, tropikamid ve fenilefrin (% 0.5 her biri) ile öğrenci dilatasyon neden olur. </li><li> 5 dk, p sonraMinimal basınç uygulayarak, her iki gözlerinin üzerinde oftalmoskop platformun ortasına eğilimli fare ve fit kontakt lensler dantel. NOT: forseps yerine 40 kullanılabilmesine rağmen Kontakt lensler, küçük ve kırılgan ama dikkatle parmaklarınızla ele alınabilir. o göz kuruluğu en aza indirir ve görüntüleme sırasında kornea saydamlığını koruyan olarak kontakt lens kullanımı isteğe ama tavsiye edilir. </li><li> 7 dakika sonra, platformun (Şekil 2B) kenarına yakın sınırlanmadığı hayvan tutarak, objektif lens ve objektif lens yörünge paralel bakan sağ gözü ile fare yönlendirmek. Karşılaştırılabilir doygunluğu ve yönlendirme görüntüleri toplamak için sürekli objektif lens gözün mesafe yanı sıra görüntüleme oturumları boyunca ışık yolu göze hizasını korumak. Gözün gözlem müdahale uzun bıyıkları Clip. NOT: Bir sonraki 8-10 dakika için, fare taşımak veya yanıp ve nazik hareket ile olacak nefes olmazyüksek kontrastlı fundus yerlerinden dayalı tarama kafası konumunu ayarlar cSLO Göz İzleme ART (otomatik gerçek zamanlı) modu ile izlenir likte. O zaman geçmiş, fareler görüntüleme pratik yapma, nefes nefese ve yanıp sönen başlar. </li><li> Görüntüleme kontakt lens kullanmadan gerçekleştirilirse, PBS her iki göze kurumasını önlemek için her 2-3 dakikada damla uygulayın. </li><li> Retina damar sistemi ve optik diskin fundus görüntüsünü toplayın, iç retina üzerinde duruldu. <ol><li> Kızılötesi modu (IR) seçin ve 820 nm uyarma,% 100 lazer gücü,% 40-60 duyarlılık (Şekil 2C) ayarları yapın. </li><li> Yüksek hız modunda (12,6 kare / sn) Çalışma, oftalmoskopu sürmek için joystick&#39;i kullanarak göz bulun. Düşük büyütmede, yaralanma veya opaklık için kornea ve lensi incelemek ve retina (Şekil 3A) görüntüleme etkileyecek kusurları ya da yaralanma ile çalışma gözlerinden dahil değildir. </li><li> Optik disk alanını (yüzeyini bulunyakın göz hedefi getirerek optik sinir başı, OSB), sonra bunun görüntüsünü ortalamak ve joystick vidalanarak bu pozisyonu kilitleyin. Oftalmoskop Gözün bu hizalama bile elde resmin üzerinde odaklanmak ve emisyon anahtarıdır. </li><li> Kazılan optik gösteren gözünde bir referans odak düzlemi (59 ve 60 D), ya da daha derin (55 D) olarak retina vitreus yüzeyinde bulunan büyük kan damarlarını kullanarak, OSB yanı sıra, retinanın iç uçakları görselleştirmek diskler. Optimal odak açıkça belirgin onların lümeni ve duvarlar ile büyük kan damarları içinde kan hücreleri dolaşan çözmelidir. </li><li> Üniforma aydınlatma beyaz halo (hafif aşırı pozlamayı kullanarak) optik disk etrafında 55º fundus alanında çoğunda yayılan kadar dokunmatik kontrol paneli üzerindeki düğmeyi ayarlayarak görüntü doygunluğu optimize edin. Sonra, büyük damarlar boyunca hareket kan hücreleri açıkça çözülebilir kadar kontrast optimize etmek için doygunluğu düşük. Fokal karanlık Eğeralanlar değil nedeniyle retina hasarı, bir homojen parlak bir görüntü elde edilinceye kadar kameraya göz realign, devam etmektedir. Bu ayar konumuna ve kalite görüntülerin tekrarlanabilir setleri yakalamak için esastır. </li><li> Gerçek zamanlı olarak 30 kare (4.7 kare / sn; normalize) ortalama (yaşa bağlı olarak, çapı 1,4-1,7 mm), merkezi retina yüksek çözünürlüklü IR görüntüsü toplamak sinyal-gürültü oranını geliştirmek için, (Şekil 2D ). </li></ol></li><li> Hemen, GFP + mikrogliya ve / veya retina ve OSB iç uçakları lokalize sızan monositler bir floresan görüntü kazanır. Not: retina İR fundus görüntüsünün Optimizasyonu GFP + hücrelerinin floresan görüntü çözünürlüğünü, hem de yayılmış iç retina belirlemektedir. Damarsal kötü kararı ile tespit edilebilir retinanın, iç uçakları odaklanmak için başarısızlık, soluk GFP + hücre görünümleri (Şekil 3B) neden olur. IR Satu ayarlamak için başarısızlıkoranı düzgün ve eşit olarak GFP + hücre yoğunluğu ve boyutu (Şekil 3C) artefakt varyasyonları sokulması, floresan görüntü (FA) etkilemektedir. <ol><li> Korunur mavi, 488 nm lazer uyarma (460-490 nm bariyer filtre seti) ve satın alma ayarlarını (% 100 lazer gücü ve 100-125% duyarlılık) kullanarak, dokunmatik ekran panelinde görüntüleme modu (FA) floresan Swich Tüm fareler (Şekil 2E) için sabittir. </li><li> Tek bir xy noktası, retinanın iki boyutlu floresan görüntü toplayın ve hemen özdeş pozisyonda bir fundus görüntü yakalamak (100x tarama ortalama, her iki görüntüler için 55º tarama açısı; Şekil 2F). </li><li> Burun-zamansal ekseni (Şekil 2H) karşısında retina kaydırma, kontrol paneli (Şekil 2G) &#39;de &quot;kompozit&quot; seçme ve oftalmoskop sağa hareket ve sol tarafından bir çoklu görüntü yakalamak. NOT: Tek bir xy noktası görüntü taradıktan sonra (100x sgerçek zamanlı yazılım otomatik olarak optimum tarama veya tarama olanaksız olduğunda kırmızı sırasında ortalamalar yeşil bir daire ile sınırlı aynı ve yeni alanlara (yeni taramalar), ve dikişleri tüm xy-pozisyonları,) ortalamasını yapabilirsiniz. Elde edilen kompozit görüntü dikey eksende (55º x 120-124º tarama açı) yatay eksen x 3-4 mm üzerinde 1.5-1.7 mm açıklıklı. </li></ol></li><li> Yanıp sönen ve hareket yeniden başlatıldığında daha önce, anestezi uyaran sonra 15 dakika içinde her farenin Komple görüntüleme. </li><li> PBS ile kontakt lensler, hidrat gözleri çıkarın ve motilite tam iyileşme kadar davranışını kontrol etmek, onun ısındı kafesine hayvan dönün. </li><li> Aynı bireysel fare aralıklı cSLO görüntüleme oturumları kullanarak uzunlamasına çalışmalar için, anestezi kümülatif toksisite yanı sıra korneal tahrişi önlemek için en az 3 gün arayla görüntüleme tekrarlayın. </li></ol> 2. Canlı Görüntü İşleme ve Analizi <ol><li> Sıralı görüntü hizalama: <ol><li> Hizalamanirengi noktaları gibi damarsal ve optik disk kullanarak aynı gözün bir zaman serisi için fundus görüntüleri. Ticari bir slayt gösterisi sunumu programında, kendi optik diskler karboksi- uçağa hizaya gelene kadar bir önceki (üst resim sürüklenen olurken yarı saydam görünür), o zamana kadar üst görüntüyü döndürmek üzerinde her görüntüyü sürükleyerek tüm görüntüleri açın onun büyük kan damarları (uzak optik diskten gemiler odaklanan) aşağıdaki resimde damarsal örtüşüyor. Her resim için döndürme açısını kaydetme ve fare ve göz kimliğinin takip, ileride başvurmak üzere bu zaman serisi kaydedin. </li><li> Her zaman noktasında xy dönüşünü düzeltmek için kaydedilen açı uygulamanın bir raster grafik editörü programını kullanarak tek xy noktası floresan görüntülerin gelen dizi aynı hizaya getirin. Ayrıca, 300 (yeniden ölçekleme olmadan) dpi ve arka plan çözünürlüğü ayarlamak (RGB modunda seçin Düzeyleri ve siyah bir kan damarının lümeni örnek). Bu görüntüleri kaydetmeTIF dosyalarını olarak, kendi adlarına &quot;hizalanmış&quot; eklenerek. </li></ol></li><li> Mikrogliyal hücre segmentasyon: <ol><li> FluoRender açık, merkezi retinada en erken zaman noktası / yaşa tekabül &quot;hizaya&quot; TIF dosyası GFP + hücreleri tespit etmek. Ekrana sığacak şekilde görüntüyü yakınlaştırma, daha sonra (sakla görünür olarak RG kanalları hem seçerek, Render görünümü (kompozit, dik, değerli) ve özelliklerini (0.58 gama, 255 doyma noktası, 255 parlaklık, 195 alfa ve 1.00 gölgeleme) tanımlamak çift ​​tıklayarak Çalışma Alanı çerçeve içinde tarafından B kanalı; Şekil 4A). </li><li> Sürekli yüksek eşiği tutarken hücrelerin çoğunluğu asgari örtüşme ve hücre süreçlerinin (mavi) ile (beyaz) maskeli kadar düşük eşiği artırarak, (Workspace çerçeve üzerinde vurgulanmış olmalıdır) tek tek hücrelerin, eşik kırmızı kanalı seçmek için (255). Düşük eşik değeri floresan yoğunluğu (Şekil 4B &lt;bağlı 100 ve 170 arasında değişmektedir/ Strong&gt;). </li><li> Özgün adı (Şekil 4C) için &quot;cellsegm&quot; ekleyerek, yeni bir TIF dosya olarak görünür kırmızı kanalda sadece (Yakalama komutu) ile bu görünümü kaydedin. Genel raster grafik editörü yazılımı kullanarak, onun gri tonlama ters ve yukarıdaki gibi 300 dpi çözünürlüğü ayarlamak, ve RGB (Şekil 4D) olarak yeniden kaydedin. NOT: Otomatik FluoRender tarafından oluşturulan klasörler (proje) silin ve ileride başvurmak için uygulanan eşiği kaydedin. </li></ol></li><li> Mikrogliyal soma segmentasyonu ve morfometri: <ol><li> Alan ölçümü için GFP + hücre somata belirlemek için, otomatik yoğunluk ölçümleri ve eşik yetenekleri yanı sıra, eşik-tabanlı nesne sayma ve ölçümü ile görüntü analiz yazılımı kullanın. &quot;Cellsegm&quot; TIF dosyasını açın ve rescaling yöntemi (spline) ve kırmızı kanalı seçin (RGB kırmızı sekmesini tıklatın). &quot;Renkli görünüm kanalı&quot; seçimi kaldırarak görselleştirme geliştirin (kırmızı RG sağ tıklayınB sekmesi) ve &quot;renkleri tamamlayacak&quot; seçerek (Resim / gri tonlama ters ve beyaz arka plan (Şekil 4E) üzerinde siyah / gri hücreleri görmek için) Resmi ayarlayın. </li><li> Tüm görüntü (Kalibrasyon, Hızlı Kalibrasyon) boyunca yatay bir çizgi çizerek, yaşa bağlı olarak 1,4-1,7 mm görüntüyü ayarlayın. </li><li> Yoğunluk eşikleme (Şekil 4B) uygulayarak Segment bireysel hücre somata. Bunun için, kırmızı RGB kanalında iş ve Eşik Yoğunluk fonksiyonu açın (Object sayın; &quot;sayım update&quot; komutunu seçerek) ayrı somata temsil faiz (ROI) her eşiklenir bölge için iki boyutlu parametreleri izlemek için. </li><li> 255 seviyeleri düşük% 50-60 seçme ve görsel eşik renk maskesi (mavi) ve hücre soma çevre (gri) içinde arasındaki örtüşme değerlendirerek nihai eşik değeri detaylandırarak, yoğunluk histogram yoğunluk eşiği tanımlayın tek tek hücreler (FŞEKIL 4E). </li><li> Ölçümler% 10&#39;dan daha az (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) farklı ise 10 hücrelerinde segmentasyon önce bölgeyi ölçerek ve daha sonra lizozomal boyutlarını temsil ve seçilen eşik aralığı kabul hücre soma maskeleri doğruluğunu tahmin edin. </li><li> Manuel birden çok hücre bulunur ve doğrudan hücreler (Şekil 4F) görselleştirmek için ikili açma / kapama geçiş yaparken, bu elementler (İkili Araç Çubuğu denetimleri veya Nesne Kataloğu kullanarak ortadan kaldırmak veya ayrı ROI) ayırmak lizozomal ROI&#39;ları belirlemek. </li><li> Lizozomal alanları büyük ve daha küçük 50-60 mikron 2 aktif mikroglia karşılık gelen hücre somata ayrımcılık ve Alan Kısıtlama kullanarak, sırasıyla mikroglia devre dışı etmek ile ROI olarak mikrogliyal hücreleri sınıflandırır. NOT: Her bir hücre lizozomal alt küme farklı yalancı bir ikili tabaka ile tespit edilir, ve daha sonra diğer morfolojik parametrelerin karakterize edilebilir (perimeter, dairesellik, vb) yanı sıra ayrık retinal sektörlerde (Şekil 4G) içinde sayısal olarak. Bir ND2 dosyası olarak analiz görüntüyü kaydedin. </li><li> Lizozomal maske ve tek xy -point görüntü yazdırarak, bireysel aktive mikroglial hücrelerinde süreci ve dallanma karmaşıklığı doğrulayın (Şekil 4H kontrast% 50 arttı). El ile doğrudan hücre soma uzanan süreçleri saymak ya da çardak (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) kapsayan poligonun çapını ölçün. Not: Aktif hücre süreçleri eksikliği ya da birkaç ayı (&lt;4) ve kısa (&lt;2x lizozomal çap) olanları, bir dallanmış ve detaylı mili ihtiva aktif olmayan hücre süreçlerinin aksine, (&gt; 3-10x lizozomal çap) göreceli olarak çevrelerinde küçük soma. </li><li> El ile, bu nedenle de tarafından tespit edilmemiş olan algılanma limitinin altındadır; somata daha küçük &lt;20 um 2 ve / veya GFP ekspresyonu ile hücreleri tanımlamakyoğunluklu bir eşikleme. Elle tespit elemanları saymak için Detaylandırmalar içinde Taksonomi komutunu kullanın. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nörodejeneratif bir hastalık sırasında mikrogliyal hücre sayısı ve morfolojik aktivasyon canlı izleme hücre özelliklerinin ayrıntılı görselleştirme izin non-invaziv görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Görüntüleme sonra, mikroglial hücreler Mikroglia aktivitesi için çıktılan olarak lizozomal boyutu ve / veya işlem karmaşıklığını değerlendirmek için çok sayıda eşik adımlarının kullanımı ile morfometrik analiz için (bölünmüş) izole edilmelidir. Bu protoko...

Mikroglia sadece erken embriyonik gelişim beri ve yetişkinlik boyunca merkezi sinir sistemi (MSS) ikamet nöroimmün hücrelerdir. Reseptörlerinin karmaşık bir repertuar ile donatılmış, mikrogliyal aktivite ve bölgesel heterojenlik komşu nöronlar, glia, kan-beyin bariyeri ve nöroenflamatuar hücreleri 1,2 infiltre ile çift yönlü etkileşimi tarafından düzenlenir. Onlar homeostazisi 3,4 olarak tedirginlikler için kendi topraklarını örnek olarak bazal mikrogliyal fonksiyonlar, fizyolojik bakım ve onarım katkıda bulunmaktadır. CNS yaralanma ya da hastalık sırasında, mikroglia sonra reaktif fenotip onların geçişi tetikler nöronal sinyalleri ilk müdahale var, &quot;mikroglia 2,5-7 aktif olarak adlandırılan. Mikroglia aktivasyonu, hücre soma ve süreç yeniden boyutlandırma ve 6-9 biçimlenme kuple edilir geni ve protein ifadesi, karmaşık bir döngüsünü içerir. Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda, hücre yeniden dağıtım vekümeleme, hücre sayısının (adlandırılır mikroglioz) yerel genel bir artış eşlik edebilir. Bu ya da kan-kaynaklı monosit 3,4,7,10-14 işe olmayan hücre proliferasyonu ve kendini yenileme, kaynaklanabilir. Yaşa bağlı kronik CNS hastalıkları geniş bir yelpazede, mikroglioz ve mikrogliya aktivasyon paralel hastalığın ilerlemesini 15-19 sürdürmüştür. Nasıl Mikroglia darbe nörodejenerasyon onlar hastalığın başlangıcı ve ilerlemesine farklı katkıları olabilir hem nöroprotektif ve zararlı roller oynamaya başlıca nedeni, belirsizliğini koruyor. Kronik CNS hastalığı anlamaya yönelik canlı görüntüleme çalışmaları hayvan modellerinde ve insan merkezi sinir sistemi hasar görmüş mikrogliyal davranışı gözlenir ve mikroglial değişiklikler hastalığın erken aşamalarında 15-17,19,20 saptanabilen bir başlangıç ​​olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, tespit etmek ve in vivo olarak mikroglial aktivasyon izlemek için yaklaşımlar geliştirilmesi kritik öneme sahiptir. Non-invaziv deteBeyin mikroglia aktivasyonu bölgesel değişikliklerin ction moleküler görüntüleme veya biyolüminesans ve pozitron emisyon tomografisi veya manyetik rezonans görüntüleme 18,21,22 kullanarak, nörodejeneratif hastalığın ilerlemesi in vivo göstergesi önemli bir olarak kurulmuştur. Bu son derece nicel ve non-invaziv moleküler ve nükleer tıp görüntüleme yöntemleri bölgesel çözünürlükte gliozis algılar. Alternatif olarak, CX3CR1 GFP / + farelerde iki foton konfokal görüntüleme hücresel çözünürlükte 3,4,9,20,23-28 beyin mikroglia gözlenmesi izin verdi. Ancak, bu yaklaşım bile minimal invaziv beyin görüntüleme prosedürleri 29 kendi davranışlarını rahatsız potansiyel risk göz önüne alındığında, uzun vadeli ve kronik mikrogliyal değişiklikler tekrarlanan gözlem sınırlar. Alternatif olarak, retina, akut yaralanma sonrası in vivo görselleştirme doğrudan için en uygun koşulları ve yaşlanma boyunca bozulmadan MSS niş içinde mikrogliya tekrarlanan izleme sunar vePotansiyel kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında. Böylece, son çalışmalar görüntüye konfokal tarayıcı laser oftalmoskopi (cSLO) canlı CX3CR1 GFP / + fareler uyarlayarak GFP ifade retina mikroglia yüksek çözünürlüklü görüntüleme fizibilite kanıtlamıştır. Bu akut kaynaklı yaralanma ya da oküler hipertansiyon 30-36 Aşağıdaki kadar 10 hafta için tek tek farelerde GFP + hücre sayıları haftalık değişimleri izlemek için kullanılmıştır. Biz birkaç ay içinde uzun vadeli görüntüleme gerçekleştirmek ve kantitatif morfometrik analizi kullanılarak soma boyutuna göre mikroglia aktivasyonu değişiklikleri izlemek için bu yaklaşımı artırdık. Somal boyutu CX3CR1-GFP + mikroglia 9 in vivo görüntüleme gerçekleştirmek için kortikal dilim iki foton konfokal mikroskopi kullanılarak canlı görüntüleme çalışmalarında Mikroglia aktivitesi için faydalı bir ölçüt olarak tanımlandı. Bunlar ve diğer çalışmalarda da, WH lizozomal büyüklüğü ve Iba1 protein ekspresyonu düzeyleri arasında korelasyon gösterdiIch, aktivasyon 9,37 ile artar. Bu nedenle, aktif mikroglia canlı farelerde tespit edilebilir, ve bunların sayısı ve dağılımı MSS sağlık ve hastalık sırasında zaman içinde izlenebilir. Bu protokol cSLO canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri mikrogliyal hücre sayıları, retina ganglion hücre (RGH) dejenerasyonu (Şekil 1) sırasında dağılımı ve morfolojik aktivasyon izlemek için açıklanır. Böylece, bu çalışma kullanır: 1) yaşa bağlı optik sinir ve retina ve nörodejenerasyonunun uğrar miras glokom (DBA / 2J) bir fare modeli yaş 38,39 5 ile 10 ay arasında hastalığın ilerlemesinde kayda değer değişkenlik gösterir, 2) aylık Uzun vadeli retinada GFP + hücrelerin görselleştirme ve 3-5 ay, hücre somata ve ölçü izole etmek segmentasyon ve eşikleme 3) canlı görüntüleme analizi yaşlı heterozigot Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J farelerin miyelinsiz optik sinirin için cSLO in vivo görüntülemeIR alanı. Bu stratejiler, kronik glokom erken evrelerinde retina mikrogliyal aktivasyonun durumlarının kinetiğini değerlendirmek için uygulanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

CNS-resident nöroimmün hücreleri mikroglia, farklı fonksiyonları ve gen ekspresyon profilleri ile aktive durumuna geçiş, MSS hasarı yanıt olarak kendi morfolojisi ve boyutunu dönüşümü. Sağlık, yaralanma ve hastalık mikrogliyal aktivasyon rolleri tam olarak nedeniyle mikroçevresinin değişikliklere tepki olarak dinamik ve karmaşık düzenlemeye anlaşılamamıştır. Bu nedenle, non-invaziv monitör için çok önemlidir ve bozulmamış organizmada zamanla mikrogliyal aktivasyon değişiklikleri analiz eder. In vivo mikrogliyal aktivasyon çalışmaları CNS ortamı değiştirmeden izleme mikrogliyal davranış teknik sınırlamalar gecikmelidir edilmiştir. Bu uzun vadeli değişiklikler izlenir gereken kronik nörodejenerasyon sırasında özellikle zor olmuştur. Retina, non-invaziv canlı görüntüleme için uygun bir CNS organ görselleştirmek ve kronik hastalık sırasında mikroglia aktivasyonu dinamiklerini karakterize için güçlü bir sistem sunmaktadır. in vivo görüntüleme, hücresel çözünürlük ile mikroglia görselleştirmek için, konfokal oftalmoskopi (cSLO) ve CX3CR1 GFP / + raportör fareler kullanmak için yöntemler açıklar. Ayrıca, biz büyük hücre alt hücre aktivasyonu ve yoğunluğu aylık değişimleri (retinanın başına 200-300 hücre) ölçmek için yöntemler açıklanmaktadır. Biz in vivo görüntülerin otomatik eşik tabanlı morfometrik analizi uygulayarak retinada mikrogliyal aktivasyon canlı izleme için yararlı bir metrik olarak lizozomal alanının kullanımını doğrulamaktadır. Biz bu canlı görüntü alımı kullanmak ve kronik glokom bir fare modelinde retina nörodejenerasyon erken aşamalarında mikrogliyal aktivasyon ve mikrogliyozu dinamik değişiklikleri izlemek için stratejiler analiz eder. Bu yaklaşım retina ve optik sinir etkileyen kronik CNS rahatsızlıkları nöronal ve aksonal düşüş mikroglia katkılarını araştırmak için yararlı olacaktır.

Bizim son in vivo çalışmalar görselleştirmek ve geç nörodejenerasyona 59 kronik glokom ve ilişkilerinin erken aşamalarında kinetik ve OSB ve retinal mikrogliyal değişiklikler kalıplarını izlemek için bu canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri kullanılır. Burada bireysel genç heterozigot Cx3CR1-GFP DBA / 2J retina merkezi retina (Şekil 5) geniş bir alan boyunca mikrogliyal hücreleri görselleştirmek için bir cSLO görüntü elde etme protokolünü göst...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma at JoVE.co

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K Görüntüleme.  University of Utah.  Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip. 

Video: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Tıp

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototromboz<em&gt; In Vivo</em&gt;: Tek Gemi İnme Bir Model

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...