NIH hibe P20 RR16440 bir alt ve bir köprü hibe West Virginia Üniversitesi Araştırma ve Lisansüstü Eğitimi Office S. Weed tarafından desteklenir. Proje geliştirme erken aşamalarında L. Lopez-Skinner Teknik yardım minnetle kabul edilmektedir. Yazarlar ayrıca teknik yardım ve J. Myers ve M. Younes (Baş ve Boyun Cerrahisi Anabilim Dalı, MD Anderson Kanser Merkezi, Houston, Teksas) OSC19 hücreleri için minnettar P. Turner ve K. Secrest (West Virginia Üniversitesi; histolojik işlem ve prosedürler için Patoloji Doku Bankası), R. Wysolmerski pLL7.0 lentiviral vektör LifeAct mCherry inşa ve J. Bear (Kuzey Carolina Üniversitesi) (West Virginia Üniversitesi, Nörobiyoloji ve Anatomi Anabilim Dalı). West Virginia Üniversitesi Mikroskopi Görüntüleme Tesisi (NIH hibe P20 RR16440 ve Mary Babb Randolph Kanser Merkezi tarafından desteklenen) kullanımı ve non-lineer optik mikroskop laboratuarı (NLOM, West Virginia Üniversitesi Nörobilim Merkezi arasında işbirliği ve ortak bir tarafından desteklenen Fizik / West Virginia Nanobilim Girişimi Batı Virginia Üniversitesi) da şükranlarımızı sunarız. NLOM Nörobilim Merkezi NIH hibe P30 RR031155 kısmen desteklenmektedir.

1. Hücre Hatları, Vektör İnşaat ve lentiviral Üretim <ol><li> İnsan baş ve boyun tümör hücreleri hatları (OSC19 veya UMSCC1)% 10 fetal sığır serumu FBS (Hyclone kedi # SH30070.03),% 1 penisilin ile desteklenebilir (Cellgro kedi # 50-003-PB) DMEM oluşan eksiksiz bir medya kültüre edildi / streptomisin (Cellgro kedi # 30-002-CI), ve% 1 non-esansiyel amino asitleri (Cellgro kedi # 25-025-CI). </li><li> PLL7.0 lentiviral vektör LifeAct-mCherry kodlama sırası aktarmak için, ebeveyn mCherry cDNA Sbf1 tanıma site site mutagenez (Stratagene kedi # 200.518-5) kullanarak tanıma dizisi içine üç sessiz mutasyonlar getirerek değişmiş oldu. Sonra çıkan değiştirilmiş LifeAct mCherry dizisi PCR EcoR1/Sbf1 siteleri yanındaki ile amplifiye ve pLL7.0 LifeAct mCherry bir yapı oluşturmak için pLL7.0 içine subcloned. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct mCherry Virüs Üretim <ol><li> Viral üretim lentiviral İfade Sistemleri manuel (Sistem Bioscience sürümü 2-051.018) göre yapılmıştır. </li><li> Ambalaj hücre hattı 293T/17 hücreleri (ATCC kedi # CRL-11268)% 40, HNSCC hatları için kullanılan aynı eksiksiz bir medya izdiham büyüdü. </li><li> Hücreler, sırasıyla (Clontech kedi # 631.312) CalPhos kullanarak pLL7.0 LifeAct-mCherry, psPAX2, 03:02:01 oranı pVSV-G vektörleri ile transfekte. </li><li> 24 saat sonra, transfeksiyon ilk medya taze medya ile değiştirildi. </li><li> Medya daha sonra toplanan ve doldurulan her 12 saat 72 saat boyunca ve 4 ° C&#39;de saklanan </li></ol> 3. Kararlı LifeAct mCherry İfade Baş ve Boyun Hücre Hatları Üretim <ol><li> Toplanan medya 4 10 dakika 2000 rpm&#39;de spun ° C </li><li> Bir ml virüs içeren açıklık medya doğrudan 12 saat OSC19 veya UMSCC1 hücreleri eklendi. Hücreler daha sonra durulanır ve bir virüs ek bir ml, başka bir 12 saatlik süre eklendi. </li><li> Hücreler dirençli koloniler seçmek için iki hafta boyunca 200mg/ml puromycin içeren medya ile tedavi edildi. </li><li> Surviving klonlar LifeAct-mCherry ifade floresan mikroskobu ile görsel olarak tarandı. Bireysel pozitif koloniler steril 3mm klonlama diskler (Fisher kedi # 0790710A) kullanarak typsinized. </li><li> Pozitif hücreleri geri dondurulmuş veya ortotopik enjeksiyon için kullanılan kadar 200mg/ml puromycin içeren medya tutuldu. </li></ol> 4. Ortotopik Tümör Xenograftlarında Oluşumu <ol><li> Bütün hayvan prosedürleri, West Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan (09-0821) ile bir protokol uyarınca yapılmıştır. </li><li> LifeAct mCherry ifade tümör hücrelerinin, tripsinize santrifüj ve 2.5 x 10 4 hücreler 50 mcL eksiksiz bir medya yeniden süspanse idi. </li><li> Tümör hücreleri, 27 bağlı bir ml şırınga ½ iğne içine yüklenmiştir. </li><li> Bayan atimik Fox1 nu / nu fareler yaşı 8 hafta (Harlan Laboratuvarlar), 80mg/kg ketamin ve 10mg/kg ksilizin kombinasyonu ile anesteziye edildi . Anestezi fareler bir ısıtma yastığı 37-40 ° C arasında muhafaza edildi. </li><li> Steril forseps kullanarak, dil ucu hafifçe kavradı ve oral kavite dikkatlice dışarı çıkardı. </li><li> Hücreler yavaş yavaş dilli arterler kaçınarak, dil merkezinde soğanlı bir kitle oluşturmak için her dilin bir yan içine enjekte edildi. </li><li> Fareler 2.1mg/kg yohimbin ile enjekte edilen ve anestezi kurtarma sırasında 2-3 saat takip edildi ısıtma yastığı için iade edildi. </li><li> Canlandırıldı sonra, fareler, yumuşak bir transgenik hamur diyet (Bioserve kedi # S3472) içeren steril kafeslere yerleştirilmiştir. </li><li> Fare 2-3 günde tartılır ve tümör başlangıcı için görsel olarak monitörize edildi. </li></ol> 5. Ex-vivo Görüntüleme Mouse Dilleri hazırlanması <ol><li> Farklı zaman noktalarında (enjeksiyon sonrası genellikle 2-4 hafta) tümörler barındıran Fare karbondioksit Solunduğunda ötenazi uygulandı. </li><li> Dilleri, ayıklanan 1X PBS ile durulanır ve monofilaman dikiş ipliği, yerel bir hobi dükkan ve bir boyutu 8 dikiş iğnesi kullanarak geleneksel bir parafin doku gömme kaseti bir tarafında (StatLab Cat # H104) bağlıydık. </li><li> Dilleri immobilize sonra, tüm kaset montaj 30mm doku kültürü çanak yerleştirilir ve 1X PBS dalmış. </li><li> İşlenmiş dilleri hemen iki foton uyarma mikroskopi için kullanılmıştır. </li></ol> 6. İki foton Mikroskopi Dil Tümörleri görüntüleme <ol><li> Dil kasetleri, dik bir mikroskobu (Sutter Aletleri Hareketli Mikroskobu (MOM)) amacı altında konumlandırılmış bir geri çekilebilir manivela kolu (Oda Servisi, Siskiyou enstrümanlar) özel olarak tasarlanmış bir tutucu güvenli 1X PBS içeren bir 60mm çanak batmış. </li><li> 40X/0.8NA suya daldırma objektif lens görünür tum on veya üzerinde doğrudan yerleştirildiveya lezyonlar. Safir lazer yoğunluğu 60 mW ve 755 nm dalga boyu giriş mCherry sinyali optimize etmek için (Mira, Tutarlı): Dilleri Ti ile iki foton mikroskobu ile görüntülenmiş. </li><li> Seri 1mm lazer tarama görüntüleri, toplam 15 ve 100 mikron (tümör hacmine göre) arasında bir doku derinliği üzerinde 1 mikron artan derinliklerde toplanmıştır. Görüntüler ScanImage, Karel Svoboda laboratuvar (Janelia Çiftlikleri, HHMI) tarafından geliştirilen MATLAB platformu dayalı bir açık kaynak programı kullanarak ele geçirildi. ScanImage raster tarama desen x / y galvanometric tarama aynaları kontrol etmek için iki kanallı bir çıkış oluşturur ve aynı zamanda bir veri toplama kartı (PCI-6610S ile photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) aynı anda maksimum dört-kanallı sinyal girişi yakalar National Instruments). PMT sinyalleri monitör ekranında görüntülemek için NI-DAQ kurulu besleyen önce düşük gürültü akımı preamplisi (SR570, Stanford Araştırma Sistemi) tarafından güçlendirilir. ScanImage amacı z-ekseni kontrol z yığın görüntüleri toplar ve tek bir ya da çevrim modunda zaman atlamalı görüntüleri toplar. Görüntüler tek bir TIFF dosyası 16 bit derinliği kaydedildi. </li></ol> 7. Amira Yazılımı kullanarak Görüntü Analizi <ol><li> Tümör ölçümü için Amira görüntüleme: Aimra yazılım, z-yığın görüntü kümesini içeren bir TIFF dosyası açın. </li><li> Dosya adını vurgulayın ve üç boyutlu render oluşturmak için Voltex işlevi uygulamak. Toplu işgal hücrelerin birkaç küçük, ayrışmış invaziv gruplar (IG) ile büyük bir primer tümörün görüntü işlenen görüntü tipik olarak görülür (Şekil 6A). </li><li> Primer tümörün kitle seçmek için, sonra, &quot;Etiket Alan&quot; Etiketleme &quot;,&quot; Open Data &quot;seçeneğini seçin. </li><li> Birincil Eşikleme tüm z-yığın fotoğraf tümör seçin ve üç boyutlu içinde sadece primer tümörün kitle dahil sağlamak için z-düzlemi görüntüleri kaydırmak. Bu genellikle alanında büyük boyutlu görüntü ve sık sık, görüntülü z-düzlemi ile geçiş olarak bölümlenmiş görünür. </li><li> Eşiğe doğru ve görüntü atarak herhangi bir tümör sinyal vermeden bunu ortadan kaldırmak için sihirli değnek / eşik fonksiyonu kullanın. &quot;Inside Dosya&quot; etiketi vurgulayın ve ⊕ düğmesini tıklatın. &quot;Tüm Dilimler&quot; onay kutusunu seçin. Bu her z yığın artış eşiklenir primer tümör alanı çevresinde renkli bir sınır oluşturur. </li><li> ÇK seçmek için, &quot;Yeni&quot; fonksiyonunu seçin. Bir tek IG seçin ve z-düzlemi kaydırma primer tümör ile ilişkili değildir sağlamak. </li><li> &quot;Tüm Dilimler&quot; seçin ve ⊕ düğmesini tıklatın. Dosya (IG 1 ex) yeniden adlandırın </li><li> 7.4 eşikleme prosedürü tekrarlayın ve belirlenen IG 7.5 vurgulayarak adım. Primer tümörün kitle belirtmek için kullanılan renk farklı bir anahat rengini seçin. </li><li> Z-düzlemi ile tüm ÇK belirtilir sağlamak için tarama, görüntü boyunca her ek IG için gerekli tekrarlayın. Resmin üzerine gelecek tanımlama, her bir tespit IG yardımcıları için farklı renkler kullanma. </li><li> Primer tümörün ve tüm ÇK seçilir sonra, açılan menüden &quot;Segmentasyon&quot; seçeneğini seçin, daha sonra &quot;Malzeme İstatistikleri&quot; seçeneğini seçin. Bu hacim ölçümü yanı sıra, X, Y ve X tümör çekirdek merkezi tümör noktadan ÇK mesafeler hesaplamak için primer tümörün koordinatları sağlar. </li><li> Hacimleri hesaplandı, primer tümörün merkezi bir çekirdek, her IG mesafeyi belirlemek. Sonra &quot;Segmentasyon&quot;, &quot;Malzeme İstatistikleri&quot; seçin. Bu adım, tüm ölçümler piksel içine hesaplar. Mikroskop objektif kalibrasyon ve büyütme (zoom fonksiyonları gibi) herhangi bir ek artış dayalı mikrometre piksel dönüştürün. Bu deneylerde kullanılan mikroskop ve ayarları için, 1 piksel = 0,298 mm 40X objektif bir kalibrasyon vererek, herhangi bir zoom ile kullanılmıştır. Primer tümörün üç boyutlu (X1, Y1, Z1) ve her IG (X2, Y2, ilk IG Z2 eski) parametreleri veren bir Excel elektronik tablo, veri alma. </li><li> Primer tümörün merkezinde her IG mikron işgal mesafe, formül √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2) kullanılarak hesaplanır . </li><li> Tümör invaziv indeksi (T) T I = N T x V T x D T, N T = görüntü ÇK toplam sayısı, V T = tüm ÇK toplam hacmi, D T formülü kullanılarak hesaplanır. = toplam mesafe, primer tümörün merkezi tüm invaziv grupların gitti. </li></ol> 8. Nikon NIS-Elements Yazılım Üç boyutlu render <ol><li> Üç boyutlu render Nikon NIS-Elements yazılımı içine tümörün tamamını görüntü siyah-beyaz orijinal 16-bit TIFF dosyaları ithal ederek, daha fazla topografik ayrıntı elde edilebilirpaketi (Nikon, Melville, NY). &quot;File&quot; seçeneğini seçin, ardından &quot;ND&quot;, sonra &quot;Dosya Sıra ND Dosya oluşturma&quot;. TIFF z serisi görüntü yığını seçin ve uygun adım boyutu belirtin. </li><li> Xy düzleminde ND belge Kalibre. Manuel kalibrasyon kullanarak bir piksel boyutunu belirtin. </li><li> &quot;Volume View&quot; seçin. &quot;HQ&quot; fonksiyonu, yüksek kalite için z-düzleminde ek dilimler hesaplamak için kullanın. &quot;3D Renderer Ayarlar&quot; &quot;Gelişmiş Renderer&quot;, &quot;Ultra Yüksek Detayları&quot; ve &quot;Tam Çözüm&quot; kalitede kullanın. Tümör yüzeyler vurgulamak için &quot;Alpha Blending&quot; seçin. </li><li> Sunum için üç boyutlu görüntü optimize edin. Tümör ve ilişkili ÇK ve gerektiği gibi bitki Zoom. Xyz uçakları görüntü döndürün ve LUT ayarlayabilirsiniz. </li><li> Sunum için görüntü yakalayın. &quot;Düzen-Görünüm Oluştur Snapshot (8 bit RGB)&quot; seçeneğini seçin. Adı ve buna göre dosyayı kaydedin. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Genel şematik ortotopik dil tümör üretimi ve in situ iki foton görüntüleme önemli adımlar gösteren. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 fare dillerine OSC19 hücreleri ifade LifeAct-mCherry Enjeksiyon. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Rezeke tümör içeren fare dil iki foton görüntüleme için hazırlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 içeren bir tümör görüntüleme için hazır bir iki foton mikroskopi pozisyon dil Oryantasyon. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 ScanImage gösteren ilk iki foton görüntü ham veri toplama vuruldu Temsilcisi ekran. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 ortotopik OSC19 tümörü Görüntü analizi ve tümör invazyonu ölçümü. Amira Voltex render (A) ve tek bir eşiklenir z-bölüm Temsilcisi ekran görüntüsü görüntüleri (B) birincil primer tümör ile özetlenen, mavi özetlenen, mor, invaziv grup 1 (IG-1), IG-2 kırmızı ve IG özetlenen -3 yeşil tanımlama prosedürü bir örnek olarak sıraladı. Arrowheads ÇK ifade eden (A) ve (B) C. hacim Arsalar karşı tümör invazyonu indeksi (Ti) hesaplamak için kullanılan sekiz ayrı ÇK için mesafe işgal etti. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 Temsilcisi tümörlerin görüntüleri ve görüntüleri, geleneksel bir IHC yaklaşım ile karşılaştırıldığında bu protokolü tümör grupları işgal etti. UMSCC1 ortotopik tümör barındıran bütün bir fare dil A. Parafin bölümü . Immünohistokimyasal boyama HNSCC özel hücre işaretleyici emmprin (Zymed; kedi # 34-5600) karşı primer antikor ile geleneksel prosedürleri kullanarak yapılmıştır 1:1000 dilüsyon ve OmniMap DAB anti-Rb algılama kiti (Ventana kedi # 760 kullanılarak görüntülendi -149) tarafından demir hematoksilen boyama izledi. Görüntüler toplam dil alanı kapsayan bir Optronics MicroFire CCD kamera ile bir Olympus ZX70 Provis mikroskop 4X büyütme tek tek toplanır ve StereoINvestigator görüntüleme paketi (Bioscience MBF) kullanılarak yeniden inşa edildi. Tümör dil ucunda açıktır. Invaziv ön ve bireysel tümör hücre grupları (ok) gösteren genişlemiş bir bölge temsilcisi OSC19 bir tümör (B) C. Nikon NIS-Elements render gösterilmiştir. Gelişmiş kontur detay ve ÇK açık görselleştirme (ok başları) açıktır. Tüm görüntüleri bar = 100 mm.

<ol>
	<li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+models+of+head+and+neck+cancers.">Xenograft models of head and neck cancers.</a> Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+cancer+in+the+head+and+neck+region.">Animal models of cancer in the head and neck region.</a> Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).</li><li>Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+nude+mouse+model+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma.">An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma.</a> Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).</li><li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue.">Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).</li><li>Sano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+combination+anti-endothelial+growth+factor+receptor+and+anti-vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+targeted+therapy+on+lymph+node+metastasis:+a+study+in+an+orthotopic+nude+mouse+model+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue.">The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).</li><li>Kupferman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+induces+EMT+and+has+a+key+role+in+invasion+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).</li><li>Ammer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saracatinib+Impairs+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+by+Disrupting+Invadopodia+Function.">Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function.</a> J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).</li><li>Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+labeled+anti-epidermal+growth+factor+receptor+antibody+to+image+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+xenografts.">Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts.</a> Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).</li><li>Gleysteen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeled+anti-EGFR+antibody+for+identification+of+regional+and+distant+metastasis+in+a+preclinical+xenograft+model.">Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model.</a> Head Neck. 30, 782-789 (2008).</li><li>Bhirde, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+killing+of+cancer+cells+in+vivo+and+in+vitro+with+EGF-directed+carbon+nanotube-based+drug+delivery.">Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.</a> ACS Nano. 3, 307-316 (2009).</li></ol>

Ortotopik fare modelleri, baş ve boyun kanseri 1,2 birçok açıdan inceleyerek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır . Biz Scot 3 ortotopik sistemi iyi kurulmuş bir baş ve boyun tümör hücresi invazyonu erken olayları incelemek için bir sistem olarak mCherry etiketli hücreleri iki foton mikroskobu görüntüleme ile kombine var. Bu yöntemde, hücreler özellikle altı hafta ya da daha küçük, yetersiz dil boyutu nedeniyle farelerin tümör enjeksiyon sitesinden sızıntı olabilir kaydetti var. Biz bu sorunu önlemek için, yaşlı farelerin kullanın. Yaşlı farelerin büyük dil büyüklüğü, aynı zamanda dil lingual arter ve aşırı kanama rüptürü kaçınarak yardımcı olur. Tümörü almak, dil dramatik ilk enjeksiyon yerinde şişer büyük ölçüde geliştirilebilir. Bu şişlik azalır enjekte edilen sıvı olarak bir-iki saat içinde emilir. Tümör büyüme dil yüzeyinde küçük beyaz bir yumru olarak belirtilen enjekte hücre sayısı belirgin bir-iki hafta enjeksiyon görünür. Ayrıca burada sunulan çalışmalarda kullanılan 40X amacı, bireysel tümör hücreleri ayırt edemez ama ÇK HNSCC işgali tipik modu özetlemek invaziv hücre kümeleri olarak tanımlar olduğunu unutmayın. Bugüne kadar bu model kapsamlı 4-7 IHC veya bioluminescent yöntemleri kullanılarak izlenir servikal lenf nodu metastazı ile ölçülen etkinlik, belirli molekülleri rol Scot büyüme bir işgalinden birkaç anti-tümör ilaçların yanı sıra test etmek için kullanılır olmuştur. Tümörler, bütün tümörler invaziv çok hücreli kümeleri gibi yerinde görüntü iki foton mikroskopi uygulama sağlayan, bu sistem tezahür yakın dil yüzeyi (Şekil 7) kurdu. Prosedürü de hücresel çözünürlük ile tümör invazyonu görselleştirmek için de kullanılabilir. İki foton mikroskopi ortotopik 8,9 ve 8,10 modelleri xenograft baş ve boyun kanseri için deneysel tedaviler daha önce çalışmak için kullanılmıştır. Ancak, bu raporlar ve protokol arasında iki önemli fark vardır. İlk olarak, bu çalışmalarda hedef / muhtemelen dolaşımı için yeterli erişim, sadece tümör hücreleri algılama sınırlayıcı, baş ve boyun tümör hücreleri tanımlamak için ekstrasellüler etiketleri kullanmayın. İkinci olarak, birincil siteye yakın tümör hücrelerinin muhtemel özetlediği erken metastatik etkinliği deneysel bir parametre olarak değerlendirilmektedir olmadığını işgali. Bizim protokol fare dilleri tümör ilerlemesi esnasında herhangi bir noktada doğrudan tümör hücresi invazyonu ölçmek için yeteneği sağlar. Burada anlatılan yöntem disseke dillerini kullanarak prosedürü açıklar iken, biz henüz erken invazyon, lokal lenf nodu tutulumu ve uzak metastaz aynı anda izlemek, biyoparlaklık ile birlikte kullanmak için canlı farelerde görüntü tümör invazyonu için bu yöntemi uyum sürecinde aynı hayvan. In vivo görüntüleme için protokol değişiklikler yanı sıra pratik bir sistem olarak düzgün görüntüleme işlemi sırasında anestezi farelerde oral kavite sulamak için, görüntüleme sırasında fareler konumlandırma için uygun bir sahne tasarımı ve bakımı gerektirir. Optimize sonra, bu uyarlamalar potansiyel pro-invaziv moleküller ve yerel işgali ve daha uzun süreler boyunca hayvanların daha uzak metastatik tutulum test anti-invaziv bileşiklerin rolü çalışma imkanı sağlayacaktır.

multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma

Loco-bölgesel işgali baş ve boyun kanseri metastaz riski ile bağlantılı ve hasta yönetimi stratejilerinin tasarımı ve uygulanması konusunda zor bir meydan okuma sunuyor. Ağız kanseri Ortotopik fare modelleri, bu faktörlerin çalışma kolaylaştırmak için geliştirilmiştir etkisi işgali ve anti-tümör terapatikler değerlendirmek için model sistem olarak hizmet. Bu sistemlerde, oral kavite dokularında içinde dissemine tümör hücrelerinin görselleştirme genellikle geleneksel histoloji ya da in vivo bioluminescent yöntemleri ile yapılmıştır. Bu tekniklerin doğru üç boyutlu birincil sitesinden kaynaklanan erken tümör hücresi invazyonu görselleştirmek ve ölçmek için birincil dezavantajı doğasında yetersizlik. Burada dilli tümörün yayılması çok vektörel görselleştirme izin iki foton görüntüleme ile dil skuamöz hücreli karsinom (Scot) için kurulmuş bir model birleştiren bir protokol açıklar. OSC-19 baş ve boyun tümör hücre hattı, stabil bir şekilde mCherry floresan protein (LifeAct mCherry) erimiş F-aktin bağlayıcı peptid LifeAct ifade etmek için tasarlanmıştır. Bu hücreler enjekte Fox1 nu / nu fareler güvenilir dil iki foton mikroskopi ex-vivo uygulama tarafından görüntülendi izin tümörleri oluşturur. Bu teknik, tümör kitlesi ortotopik görünüm için ve yerel, bölgesel tümör mikroçevresinin aksamadan eksize dilleri hücreleri istila sağlar. Buna ek olarak, bu sistem birincil tümör hücreleri hareket işgal mesafeleri hesaplanarak tümör hücresi invazyonu miktarının sağlar. Genel olarak bu işlem için geliştirilmiş bir model sistem Scot işgali ve tedavi tedaviler, lokal invazyon ve uzak metastatik yayılmasını önlemek için özel katkıda bulunan faktörler analiz sağlar. Bu yöntem de, sonuçta bir in vivo ortamda diğer görüntüleme yöntemleri ile kombine edilebilir potansiyele sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma at JoVE.com

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

18.9K Görüntüleme.  Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University. Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Video: Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murin Mesane Kanseri bir Ortotopik Model

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Tıp

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Bir Ortotopik Fare Beyin Tümörü Modelinde Kombinasyon Radyoterapi

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Anaplastik Tiroid Kanseri Ortotopik Fare Modeli

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Fare Kornea Neovaskülarizasyonunun bir Alkali-yanık Yaralanma Modeli

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

Için RNAscope<em&gt; In situ</em&gt; Head transkriptional Aktif Human Papilloma Virüs Tespiti ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Ortotopik Pankreas Kanseri Fare Modeli Dinamik Kontrast Geliştirilmiş Manyetik Rezonans Görüntüleme

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Bir &quot;Hasta gibi&quot; Ortotopik singenik Fare Modeli Hepatoselüler karsinomu metastazı

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...