Name: application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Yazarlar Eric Fishback (Des Moines Üniversitesi, Des Moines, Iowa, ABD) çekim ve düzenleme video ile onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Stabil NHE3-wt veya NHE3-YRK ifade PS120 fibroblast benzeri hücreleri nazikçe Dr Mark Donowitz (Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi, Baltimore, MD, ABD) tarafından temin edilmiştir.

Not: İki amplifikatörler sıkma, tüm hücreli yapılandırma ve bir yüksek impendence amplifikatör (hücrede korumak için bir yama kelepçe amplifikatör yama ile birlikte electroneutral taşıyıcılar self-referencing İMKB tarafından etkinliği kaydetmek için gerekli olan electrometer İMKB yoluyla ışınlama etkinliklerini kaydetmek için) (tablo malzemeleri görmek). Yama kelepçe amplifikatör satın alma kurulu terminal doğrudan bağlıdır. Electrometer filtre ve sinyali yükseltmek için kullanılan fark amplifikatör bağlıdır. Fark amplifikatör terminal edinme kuruluna bağlı. Capmeter, hücre kapasitesi, izler yama kelepçe yazılım önceki çalışmalar20 dakika içinde kullanılan (tablo malzemeleri görmek). Kayıt odası ve perfüzyon çözümleri 37 ° C'de tutulur
1. hazırlanması Pipetler sorunum için
<ol><li>Borosilikat cam kılcal üzerinden Pipetler bir dış çap 1.2 mm için çek ( Tablo malzemelerigörmek) pipet çektirme2 kullanarak.</li>
	<li>Microforge kullanarak pipet Lehçe. Pipet ucu çapının 2-3 µm olmalıdır.</li>
	<li>Pipetler bir kavanoz tutucu Pipetler için (bkz: Malzemeler tablo) karşı karşıya pipet ucu yerleştirin. Dikkat: 1.4-1.6 iyi havalandırılmış kimyasal duman mahallede adımları izleyerek.</li>
	<li>BIS (dimetilamino) Dimetil silane ve karbon tetraklorür 10 damla 1 damla (~ 150 µL) oluşan siliconization karışımı karışımı ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Siliconization karışımı kavanozun içine dökün ve kapağını sıkıca kapatın.</li>
	<li>Karışım tamamen buharlaşıp kadar kavanoz için 24-48 h kimyasal duman başlıklı oda sıcaklığında siliconization karışımı ile kuluçkaya.</li>
	<li>Yaklaşık 2-4 mm bir sütun oluşturmak için uygun iyon-seçici reçine ile pipet tamamlanmıyor. Not: Hidrojen ionophore ben kokteyl B usedfor kayıt NHE etkinlik olabilir ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Pipet ucu iyon-seçici reçine dağıtmak için ucu dokunun ve pipet pipet ucu kavanoz tutucu dikey olarak yerleştirin.</li>
	<li>Checkunder reçine kokteyl ucunu sonuna ulaştı diseksiyon mikroskop. Gerekirse, reçine sonuna kadar itmek için pozitif basınç uygulayın.</li>
	<li>Backfill yarı-pipet ile uygun bir çözüm (~ 100 μL). Burada, 100 mM KCl ve 10 mM HEPES pH 7,0 ionophore kullanıyorsanız kullanın ben kokteyl B.</li>
	<li>İMKB için electrometer bağlamak ve kayıt için kullanılan banyo çözüm İMKB ucu yerleştirin. Electrometer sıfır.</li>
	<li>H+test-banyo çözüm pH değiştirerek seçici İMKB yanıt. Ortalama H+-seçici İMKB yanıttır ~ 58 mV pH birimi başına.</li>
	<li>Düzenli olarak kalibrasyon İMKB yanıtı değerlendirmek.</li>
</ol>2. yama kelepçe hazırlanması için kayıt Pipetler
Not: Donald Hilgemann tarafından yazısında tek kanallı kayıt21 tarihinde açıklanan yöntemi önerilir.
<ol><li>Pipetler borosilikat cam kılcal gelen dev yama için çek (2.0 mmOD / 1.5 mm kimlik) pipet çektirme2,22,23.</li>
	<li>Kullanım bir microforge geniş pipet ucu (10-22 mikron)23yapmak ters bir mikroskop sahnede monte. Bir boncuk erime (~ 0.5 mL) microforge yumuşak cam kalın Platin tel üzerine. Not: Nispeten kalın bir platin tel gereklidir (dev yama Pipetler imal etmek ~0.5 mm).</li>
	<li>Yumuşak cam boncuk yakın yama pipet getirin ve çekilmek belgili tanımlık uç başlayana kadar tam ısı uygulayın. Platin tel biraz Isıtma centerduring doğru hareket eder.</li>
	<li>Isı kapatın ve pipet ucu yumuşatılmış cam boncuk itin. Soğutma tel geri çekmek ve pipet ucu kesin.</li>
	<li>Pipet ucu düz ve istenilen çap pipet ucu oluşturmak için ısı yeniden uygulayın. Uç çapı bağlı olmak hücre boyutunu (Bu çalışmada 8-10 mikron) yamalı.</li>
</ol>3. hücre hazırlanması
<ol><li>Fosfat tampon serum (PBS) Ca2 + ve Mg2 +, tripsin-EDTA çözüm ve büyüme Orta olarak 37 ° C'de ısıtın</li>
	<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Arabellek 1 mL 35 mm çap hücre kültür plaka için kullanın.</li>
	<li>Tripsin 0.5 mL 35 mm çap hücre kültür plaka için hücreleri ekleyin. Not: hücreler yuvarlak-up, de-hücreleri eklemek plaka sallamak başlattığınızda.</li>
	<li>Tripsin eylem 5 mL (35 mm çap hücre kültür plaka için tutar) % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş tam büyüme ortamının ekleyerek durdurun. Not: Tripsin reaksiyon zamanında hücre-türüdür bağımlı.</li>
	<li>Hücreleri kümeleri oluşumunu önlemek için sallanan ile bir sallamak yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri trypsinization sonra en fazla 2 saat için kullanın. Not: Zaman hücre kültürünü bağlı olarak değişebilir.</li>
</ol>4. bir Intra-pipet perfüzyon sistemi hazırlanması
<ol><li>Uygun bir boyut kuvars Boru kesme (150 µm OD / 75 µm kimliği) içi-pipet perfüzyon çizgi hazırlamak için.</li>
	<li>Kuvars hortumunun bir tarafı 200 µL pipet ucu yerleştirin. Kuvars boru ucu üzerine tutkal ve ucu keskin bir ustura ile sonunda kesti.</li>
	<li>Intra-pipet perfüzyon çözüm için bir depo olarak hizmet verecek silikon tüp küçük bir parça için perfüzyon hattı (kuvars boru ucuna kadar yapıştırılmış) bağlayın.</li>
	<li>Silikon tüp artı basınç için bir şırınga bağlayın.</li>
	<li>Kuvars boru polietilen boru perfüzyon pipet sahibinin aracılığıyla ücretsiz sonu port ( Tablo malzemelerigörmek) Ekle.</li>
	<li>Pipet çözüm perfüzyon satırıyla değerlendirin.</li>
</ol>5. hazırlık çözümleri
<ol><li>Bir ağır tamponlu pipet çözüm NHE (115 mM potasyum Aspartat (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM borular, 12,5 mM BEZLERİ ve 12.5 mM MES, aspartik asit ile ayarlanır pH 6.0) kaydetmek için hazır olun. Not: stok pipet çözüm ve filtre hazırlayın. MG-ATP kayıt önce ekleyin.</li>
	<li>Bir taze banyo çözüm (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2ve 0,1 mM Tris-HCl pH 8.2) her zaman hazır olun.</li>
</ol>6. kayıt ışınlama aktivitesi
<ol><li>Işınlama aktivitesi sıcaklık bağımlı olduğundan kayıt odası ve 37 ° C'de tüm çözümleri korumak.</li>
	<li>Hücreleri kayıt odasına koyun. Beklemek-e kadar onlar odası altına bırakın ama izin verme odasına iliştirin.</li>
	<li>Uygun bir hücre seçin. Hücre çapı ile oküler mikrometre ölçmek. Benzer çapları içeren hücreleri seçin. Not: Genellikle, büyük bir hücre daha hücresel yüzey ve muhtemelen daha fazla taşıyıcı böylece da daha fazla ışınlama aktivitesi having onun plazma membran üzerinde ifade olacaktır. Belirli taşıyıcı ve hücre tipi altında eğitim ışınlama aktivitesi bağlıdır gibi Ancak, bu mutlaka doğru değildir.</li>
	<li>İyon-seçici elektrot pipet micromanipulator için mount, backfill yama sıkma pipet ile hücre içi çözüm çözüm2pipet ucu ulaştığından emin olun. Not: Pipet ucu kabarcıkları ortadan kaldırmak için birkaç nazik musluklar gerektirebilir.</li>
	<li>2,22,23kadar set Elektrofizyoloji baş aşaması için yama sıkma pipet bağlayın. Not: Bu son derece dayanıklı bir mühür oluşumu için uygundur pipet için bir giriş açısı sağlar gibi bu baş aşamada 45 derecelik bir açı hakkında yatay eksenine tutmak önemlidir.</li>
	<li>Küçük bir pozitif basınç uygulayın (~ 5 cm H2O) için belgili tanımlık uç engelleme olasılığını azaltmak ve banyo çözüm içine yerleştirmek için yama pipet.</li>
	<li>Ucu yakın hücre olduğunda yama kelepçe pipet hareket etmeyi kes.</li>
	<li>Pipet hücre dokunur ise pozitif basınç rahatlatmak ve hafif negatif basınç uygulayın (~ 5 cm H2O) elde etmek için bir > 1000 MΩ (Giga-ohm) mühür yama ile hücre zarı üzerinde pipet23.</li>
	<li>Yama pipet hücre ile aynı odak düzlemi İMKB olarak yerleştirin ve yama pipet ile İMKB yakınlığı hücreye taşımak (~ 5-10 µm)2,5 ama kaçının hücre İMKB (şekil 1A) iletişim için izin verir.</li>
	<li>Holding potansiyel 0 temin mV.</li>
	<li>Bütün hücre yapılandırmasını almak için kısa suctions serisi ile mühür rüptürü.</li>
	<li>İMKB (veya yama kelepçe pipet) hareket yavaş yavaş sağa ve sola veya yukarı-aşağı ışınlama (şekil 1B) etkinliklerini kaydetmek için.</li>
	<li>En az 5-8 doruklarına kaydetmek (şekil 1 c, B a).</li>
	<li>Kare dalga rezonans mühür ve hücre zarının kapasite (şekil 1) kalitesini izlemek için kayıt sırasında uygulanır.</li>
	<li>H+ akı tahmin (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) ücretsiz H+ konsantrasyonu hücre yüzeyine ve toplu bir çözüm (ΔH+) arasındaki farkı üzerinden <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Not: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> ve <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> h+ ve Difüzyon katsayıları sırasıyla, tampon BT toplam arabellek konsantrasyon, KD arabelleği ayrılma sabittir, r hücre RADIUS, ve <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> ilişkili H+ ücretsiz H+küçük bir değişiklik için konsantrasyon kararlı durum değişikliği belirler. H+ çözümünde ücretsiz bir proton gösterir. Önceki çalışmalar ile tutarlı olacak şekilde H+ Cerayanlar Elektrofizyolojik akı birimlerine Cerayanlar geçerli karşılıkları hesaplayarak dönüştürülür (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) pA3,5].</li>
	<li>Hücre boyutu hesaplanan hücre yüzeyine veya membran kapasitans proton akı normalleştirmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Işınlayıcılar çok önemli işlevler rağmen faaliyetlerini incelemek kullanılabilir olan yöntemlerden etkisiz ve yetersiz. Kullanılabilir yöntemleri iyon hareketi sırasında deney4hücre içi iyon kompozisyon dalgalanmalar dikkate almadan ışınlama aktivitesi tarafından aracılı ölçmek bir kısıtlamadır. Sunulan yöntem ekstraselüler ve hücre içi iyon bestelerinden hassas kontrol sağlar ve hücre içi iyon, protein ve lipit kompozisyonları3,</sup...

Taşıma iyonları ve solutes plazma zarı arasında hücre ve dolayısıyla, organizmalar1yaşam için önemlidir. Seçici taşıma iyonları ve solutes bir dizi özel kanal ve taşıyıcı proteinler tarafından sağlanır. Bu proteinler mutasyonların kez klinik koşulları, kanal ve taşıyıcı proteinler potansiyel hedefleri farmakolojik tedavi1için işleme çeşitli neden. Ne yazık ki, kanal ve ışınlama işlevi ve yönetmelik temel mekanizmaları anlama kez onların etkinlik2,3,4eğitim kullanılabilir yaklaşımlar tarafından sınırlıdır.
Özellikle, ışınlayıcılar kabaca olup onlar solutes taşıma sırasında hücre transmembran potansiyel alter bağlı olarak iki büyük gruba alt ayrılabilir: değiştirmek aşağıdaki sonuçlara yolaçabilir electrogenic iyon taşıyıcıları [Örneğin, sodyum-fosfat Co ışınlama 2a (NaPi2a), sodyum kalsiyum Eşanjör (NCX), vs.] veya electroneutral iyon değiştirme Işınlayıcılar [Örneğin, sodyum-proton Eşanjör (NHE), Sodyum Klorür co ışınlama odası, NaPi2c, vb.]. Taşıma araçları her iki çeşit faaliyetlerinin yoğun alımını radyoaktif izotoplar kullanılarak incelenmiştir ve floresan membran-permeant2boya. Her iki yaklaşımın belirli sitoplazmik iyonları toplu konsantrasyonu değişiklikleri ölçerek taşıyıcılar aktivitesini tahmin etmek, ve her iki yöntem kısıtlamaları, ılımlı duyarlılık ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi yetersiz kontrolü gibi çevre. Gerçekten de, birçok taşıyıcıları etkinliği (Örneğin, NHE3, NCX) taşınan iyonların sitoplazmik konsantrasyon bağımlı olduğunu ve bu iyon konsantrasyonlarının değişimler ışınlama aktivitesi2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynaması bekleniyor , 3 , 5. bu düzenleyici mekanizmaları hassas ölçümdür klasik yöntemlerle sınırlı.
Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için yama kelepçe yöntemleri ışınlama aktivitesi2,6incelemek için kullanılır. Özellikle, sistem sıkma yama ile kombine self-referencing iyon-seçici elektrot (sorunum)7,8 son zamanlarda electroneutral ışınlama aktivitesi3,4 ölçümü sağladı , 5. sorunum vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Taşımak ve hücre zarının bir tekrarlayan içinde uzak bir İMKB salınım moda bir gerilim farkı (µV) kaydeder. Gerilim farkları Difüzyon2,9Fick'ın ilk hukuk uygulayan bir kalibrasyon yöntemiyle iyon akı değerleri dönüştürülebilir. Sorunum ise dışarı-in hareket iyonları akı algılamak, hücreleri yama kelepçe yöntemi her iki bütün hücredeki veya iç-out yapılandırmaları membran potansiyeli ve hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulama sadece da lipidler ve proteinler3,5iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar.
Özetle, yama kelepçe yöntemi çok yönlülüğü ile çalışmak için diğer yöntemleri yama bu yöntemlerin ortak sınırlamaları aşmak uygun sıkma ışınlama aktivitesi yaptı karşılaştırıldığında. Kendi kendine referans sorunum ve yama kelepçe teknikleri ile birlikte electroneutral taşıyıcılar sıkı şekilde denetlenen bir deneysel ortamda etkinliğini ölçmek için ve roman biyofiziksel ve moleküler keşfetmek için benzersiz imkanı sunuyor Hücre zarı özellikleri3,4,5ulaşım. Bu yaklaşım, etkinliği NHE ile çalışmaya başarıyla kullanılmıştır. Memeli NHE protein ailesi ekstraselüler sodyum (Na+) electroneutral net değişimi için hücre içi proton (H+)10,11 bir içe Na+ degrade kullanan tromboksan. Memelilerde, 11 ilgili proteinler (NHE1-9 ve NHA1-2) ve sperm özgü NHE10,12,13NHE protein ailesi içerir.
NHEs (SLC9a aile) ubiquitously basit prokaryot gelen en canlı organizmalar daha yüksek Ökaryotlar bulunur ve hücre tuzluluk savunmak için kontrol dahil olmak üzere önemli hücre fonksiyonları10,11, çeşitli yer alırlar prokaryot, asit-baz homeostazı ve hücre Cilt Bakımı ve çeşitli özel epiteli10,12,14,15dakika sonra tuz ve su emilimini düzenleyen. NHEs kilit biyolojik rolü ve önemi işlevlerini çeşitli çalışmalar sayesinde tespit edilmiştir; Ancak, birkaç çalışmaları metodolojik sınırlamalar4nedeniyle memeli NHEs biyofiziksel ve moleküler özelliklerini araştırdı. Son zamanlarda, sorunum bütün hücreli yama sıkma sırasında kendi kendine başvuru uygulama değişiklikleri iyonları, proteinler ve fosfolipitler3hücre içi konsantrasyonlarda sahiplenilip NHE izoformlarının roman moleküler mekanizmaları ortaya koymuştur, 4.
Özellikle, bu el yazması gelen doğrulama yöntemleri ve etkinlik düzenlenmesi ve NHE izoformu 3 (NHE3), Na+, Cl-, HCO3- ve sıvı emme önemli bir oyuncu eğitimi için yaklaşımlar önerilmektedir Fırça sınır membran böbrek ve bağırsak epiteli14,16. NHE3 faaliyet duyarlılık farklar için hücre içi phosphoinositides içine yeni bir bakış açısı (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] ve phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) bildirdi. Cep taşıma proteinler, kanallar ve ışınlayıcılar, gibi phosphoinositides17tarafından düzenlenir ve NHE3 doğrudan PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P318bağlar. Geçerli edebiyat bağlı olarak, her iki fosfoinositid NHE35,18,19fizyolojik veya patofizyolojik düzenleme için ilgili olabilir. Cihazla ilgili izlenimlerimizi PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 NHE3 faaliyetinin yönetmelikte ayrı roller destekler. Bu ayrım yüzünden bütün hücreli yama kelepçe kayıt ile birlikte İMKB tekniklerin uygulanması. Bu teknik aynı zamanda fosfoinositid hücresel memnun yolu ile farklı phosphoinositides hücre içi perfüzyon NHE3 etkinlik ölçümü sırasında kontrolünü sağlar.

<table><tbody><tr><td>Patch clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differential Amplifier (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software Based on MatLab</td><td>MatLab with acquisition toolbox</td><td></td><td>The capmeter software is recommended</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperature Control System</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>In-line heater</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Used for ion selective electrodes</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen ionophore I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Tubing</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Used for patch clamp pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Used for intra-pipette perfusion system</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium aspartate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

İyonlarının hücre membranlar yoluyla taşıma iyon içeriği içinde ve hücre yaşam için vazgeçilmez bir hücre dışında ayrıntılı denetimini sağlar. Bu taşıma mekanizmaları özel taşıyıcı proteinler faaliyetleri tarafından aracılık. Özellikle, pH dynamics ince Na+gibi plazma zarı proton (H+) ekstrüzyon sistemleri tarafından kontrol edilir/h+ Eşanjör (NHE) protein ailesi. NHE yönetmelik temel mekanizmaları incelemek için kapsamlı çabalarına rağmen geçerli anlayışımız NHE aile biyofiziksel ve moleküler özelliklerinin etkili NHE etkinliği ölçmek için yöntemler sınırlı yer nedeniyle yetersiz . Bu makale, kullandığımız H+-bütün hücreli sırasında seçici elektrot yama NHE kaynaklı H+ akı ölçmek için sıkma kayıt. Biz genellikle bazı sınırlamaları aşmak için bu yaklaşım yöntemleri radyoaktif uptake ve floresan membran permeants gibi NHE etkinliği ölçmek için kullanılan önerdi. Açıklanan yöntemi kullanarak NHE etkinliğini ölçümü yüksek hassasiyet ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi H+ konsantrasyonları daha verimli kontrolünü sağlar. H+-seçici elektrotlar vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Bir H+-seçici elektrot kadar hareketli ve hücre zarının bir tekrarlayan, salınım moda uzakları H+ akı üzerinde bağımlı bir gerilim farkı kaydeder. Süre H+-seçici elektrot hareketli hücreden yama kelepçe yöntemi tüm hücreli yapılandırma hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır H+ akı algılamak için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulanması sadece da lipidler iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar. Işınlama aktivitesi NHE izoformu 3 (NHE3), moleküler temelini NHE3 yönetmelik çalışması için bu teknik yaklaşım kullanarak phosphoinositides tarafından ölçüldü.

Bütün hücre yama kelepçe kayıt sırasında self-referencing İMKB NHE3 etkinlik düzenlenmesi çalışmaya phosphoinositides tarafından uygulanmıştır. Endojen plazma zarı NHEs ifade eksikliği, PS120 fibroblast benzeri hücreler24, kullanılmıştır. NHE3 vahşi-türü (NHE3-wt) veya NHE3 mutantlar bunu yapmamalıydın [tirozin 501, arginin 503 ve lizin 505 yerine alanin ile Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] bind phosphoinositides stabil PS120 fibroblast ben...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K Görüntüleme.  Des Moines University. Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Video: Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Biyoloji

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Biyokimya

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of membrane carrier proteins reconstituted in lipid bilayer membranes is a powerful but delicate method for the assessment of their physicochemical and pharmacological properties. The substrate turnover number is a unique parameter that allows the comparison of the activity of different membrane proteins. In an electrogenic transport, the gradient of the translocated substrate creates a membrane potential that directly correlates to the substrate turnover rate of the protein. By using silver chloride electrodes, a diffusion potential, also called liquid junction potential, is induced, which alters electrode potential and significantly disturbs precise membrane potential measurements. Diffusion potential can be minimized by a salt bridge, which balances electrode potential. In this article, a micro-agar salt bridge is designed to improve the electrophysiological set-up, which uses micropipettes for the membrane formation. The salt solution is filled into a microcapillary pipette tip, stabilized by the addition of agarose, and can be easily mounted to a standard electrode. The electrode potential of a micro-salt bridge electrode is more stable compared to a standard electrode. The implementation of this system stabilizes electrode potential and allows more precise measurements of membrane potential generated by a pH gradient. Using this system, the proton turnover rates of the mitochondrial carriers UCP1 and UCP3 are reinvestigated and compared to earlier measurements.

In electrophysiological measurements, the presence of a diffusion potential disturbs the precise measurement of the reverse potential by altering the electrode potential. Using a micro-agar salt bridge, the impact of the diffusion potential is minimized, which allows a more precise measurement of substrate turnover numbers of reconstituted recombinant membrane proteins.

Rekombinant membran proteinlerinin Proton ciro oranı analiz etmek için bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Nörobilim

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

<meta charset="utf8"></head><body>Genetik Olarak Tasarlanmış Spiking HEK Hücreleri Üzerindeki Elektroporasyon Etkilerinin Değerlendirilmesi

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be affected by electric pulses even in therapies where they are not the primary targets, and this can cause adverse side effects. Therefore, to optimize the electroporation-based treatments of excitable and non-excitable tissues, there is a need to study the effects of electric pulses on excitable cells, their ion channels, and excitability in vitro. For this purpose, a protocol was developed for optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells. With the use of a fluorescent potentiometric dye, the changes in transmembrane voltage were monitored under a fluorescence microscope, and relevant parameters of cell responses were extracted automatically with a MATLAB application. This way, the excitable cell responses to different electric pulses and the interplay between excitation and electroporation could&#160;be efficiently evaluated.

<meta charset="utf8"></head><body>Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

For studying responses of excitable cells in vitro, the protocol describes optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells as well as changes in transmembrane voltage with automated extraction of relevant parameters.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

Rekombinant membran proteinlerinin Proton ciro oranı analiz etmek için bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi