The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + Killing Seçim <ol><li> Hücre çizgileri <ol><li> Kararlı olarak NHE-eksikli hücrelerin transfekte (örneğin, CCL39 türetilmiş PS120 hücre çizgisi 16) bir fibroblast hücre çizgisinde etkili transfeksiyon verimi ve seçim üretecek memeli ifade vektörü ve transfeksiyon yöntemi herhangi bir kombinasyonu kullanılmıştır. NOT: Yıllarca Kalsiyum Fosfat yağış 19 iyi transfeksiyon verimi ile kullanılmıştır. Bu, Lipofectamine2000 gibi ticari reaktifler ile daha yakın değiştirilmiştir, transfeksiyonlar imalatçının talimatlarına uygun olarak yerine getirilmektedir. </li></ol></li><li> Çözümler <ol><li> Aşağıda tarif edilen üç steril çözeltiler hazırlayın. Filtrasyon (0.22 mikron) tarafından bu çözümleri sterilize edin. <ol><li> 50 mM NH4CI, 70 mM kolin klorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM gl içeren bir NH4 + Yükleme çözeltisi hazırlayın (pH 7.4)ucose ve pH 7.4&#39;te 15 mM MOPS. </li><li> 120 mM kolin klorür, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz, pH 7.0, 15 mM HEPES içeren bir durulama çözeltisi (pH 7.0) hazırlayın. </li><li> PH 7.4&#39;te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES içeren bir kurtarma çözeltisi (pH 7.4) içinde hazırlayın. </li></ol></li></ol></li><li> CO2 bozabilir bu tamponlama neden olur 5% &#39;si olarak, - seçim başlamadan önce, (&quot;serbest&quot; kuluçka CO2 olarak adlandırılır) dış tanktan ek CO2 ile 37 ° C&#39; de kullanılabilen bir hücre kültürü kuluçka elde asidifikasyon. Ile yaklaşık 2 x 10 8 hücreleri (tipik olarak yaklaşık 20 konfluent 100 mm plakalar) için ilgi NHE sentezleyen hücre soyu yükseltin. </li><li> H prosedürü öldürme +: <ol><li> 3 de, yükleme Çözüm, 1 saat için ilgi hücre NHE-ifade eden hücreleri inkübeCO 2 -ücretsiz inkübatör 7 ° C. </li><li> Yükleme çözeltisi aspire ve daha sonra, yukarıda tarif edilen, durulama çözeltisi içinde iki kez yıkayın. Asitlenmesini üretecek bir dik NH 4 + gradyan oluşturulmasını zedeleyecek artık dışı NH 4 Cl ortadan kaldırmak için verimli bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Aspirasyon ile durulama ortamı ortadan kaldırmak ve CO2 serbest inkübatör içinde 37 ° C&#39;de tekrar geri kazanım çözeltisi içinde bir saat için kuluçkalayın. </li><li> Normal kültür ortamında (% 7.5 FCS, tipik olarak DMEM) ile kurtarma ortamı yerine ve (% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemli bir atmosferde 37 ° C), standart kültür koşullarında hücreler büyür. </li></ol></li><li> Stabil klonlar ortaya kadar haftada iki kez seçim bu döngüyü tekrarlayın. NOT: Hücre kültürü ve seçim koşulları konusunda özel dikkat. Iş Ay o daha eğilimli herhangi bir kontaminasyon tarafından harap olabilirkültür ve tekrarlanan hücre manipülasyonlar uzun bir süre sonra CCur. <ol><li> Burada, klonlar yükseltmek ve bireysel olarak daha bölümlerde 2-3 açıklanan onları karakterize, ya karakterizasyon önce hücresel nüfus oluşturmak için onları bir araya havuz seçebilirsiniz. </li></ol></li><li> Sayaç-seçilmesi ebeveyn asit duyarlı fenotip (Şekil 1B) döndürülür olabileceği olanlar tarafından asitlenme dirençli hücreleri korumak için zaman zaman seçim (yaklaşık iki haftada) uygulayın. </li></ol> 2. Hücre içi pH Ölçümleri 2.1) Floresans pH Görüntüleme <ol><li> 490 nm&#39;de uyarıldığında, pH&#39;a duyarlı ve üretici protokollerine göre bir 445 mil izosbetik noktası sahip rasyometrik pH&#39;a duyarlı fluoresan boya BCECF / AM kullanın. <ol><li> Seçenek olarak ise, üreticinin protokollerine aşağıdaki diğer pH&#39;a duyarlı prob kullanılır. </li></ol></li><li> Bir görüntüleme set con kullanınyüksek hassasiyet video kamera bağlanmış bir ters mikroskop sisting. 450 nm ve uyarma için uygun kuvars nötr yoğunluk filtreleri ile eşleştirilmiş 490 nm dar bant girişim filtreleri ile bu seti donatın. <ol><li> Mümkünse oranı da hem λ1 ve / veya λ2 için, ya doyurarak veya çok düşük ayarlanmış bazal floresan değerlerini önlemek 1. yaklaşır, böylece λ1 ve λ2 kurulum karşılaştırılabilir floresan değerlerine filtreler ve aydınlatma koşulları uygun seti kullanın. Bu hücre içi pH değişiyor olsa oranı tespit edilmiş olmayabilir gibi o önemli eserler verebilir. NOT: Bu sistem uygun emisyon dalga boyunda (BCECF için 535 nm) hızlı perfüzyon, zaman atlamalı, yukarıda zikredilen iki dalga boylarında uyarım ve satın izin gerekir. Yazılım otomatik veri toplama ve depolama sağlayan sistemi donatın. </li></ol></li></ol> NHE İleri Faaliyet 2.2) Ölçüm (eldesiSitosolden protonlar) <ol><li> NH4 + Yükleme çözeltisi içinde 1 saat süren kuluçkalamadan hücreleri asitleştirin CO2 yokluğunda (adım 1.4). </li><li> Son beş dakika boyunca solüsyon ile BCECF-AM (5 uM nihai konsantrasyon) ilave edilir ve daha sonra hücre dışı prob ortadan kaldırmak için NH 4 + yükleme çözeltisi durulayın. </li><li> Mikroskop hücreleri monte ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek. Durulama çözeltisi (yukarıya bakın) serpmek. Bu asitleştirme tekabül eden floresans bir düşüşüne yol açar. </li><li> PH stabilize sonra, Li + / H +, Na + / H + veya K + / H + değişimi aracılığı ile pH yükselmesinin oranını ölçmek için aşağıdaki çözümlerden herhangi serpmek. Her bir çözelti bir potansiyel birleştirme katyon H + değişimi için test edilecek olan içerir. Bunlardan biri taşınıyorsa, bu değerden uygun olacak 495 nm&#39;de bir floresan artışı ile sonuçlanırond hücre içi pH zam için: PH 7.4&#39;de 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES PH 7.4 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES PH 7.4&#39;de 125 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES </li></ol> NHE Ters Faaliyet 2.3) ölçümü NOT: Burada ilke transmembran iyonik eğimleri ters etmektir. <ol><li> Ölçümden önce, ilgi konusu hücre içi katyon ile yük hücreleri (aşağı bakınız). </li><li> BCECF / AM (bkz: adım 2.2.2) ile 5 dakika boyunca onları inkübe; , yıkayın video mikroskobu onları monte edin. </li><li> Yükleme çözüm serpmek ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek. </li><li> Bazal istikrar, görüntü hücreleri bir hücre dışı asidik ortam 120 m içeren perfüze olan pH değişimleri sonraE kolinklorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve pH değeri 6.5 olan 15 mM MES,. </li><li> LiCİ yüklemesi için, pH 7.4 ile 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözelti içinde, 2 saat boyunca kuluçkalayın. Atom emme spektroskopisi ile ölçülen hücre içi lityum yaklaşık 60 mM arasında bir değer elde edilir. </li><li> Na yüklemesi için, 1mM ouabain varlığında pH 7.4&#39;te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözeltiye, iki saat süreyle kuluçkalayın Na / K ATPaz engellemek için. Bu koşullar altında, hücre içi Na konsantrasyonu, 40 mM arasındadır. Not: sitosolik K + konsantrasyonu 140 mM aralığında ve bir dışarı doğru yönlendirilmiş K + gradyanı elde etmek için, bu nedenle kolay olduğu gibi K + yükleme gerekli değildir. </li></ol> 2.4) Veri Tedavi ve Kalibrasyon: Not: Bu adım ileri ve geri ölçümler için de geçerlidir. <ol><li> Her bir deneyin sonunda, 6.5 ile 7.4 arasında pH değerlerine ayarlanmış 140 mM KCI, 20 mM HEPES ve 5 uM nigerisin eden bir çözelti ile hücreleri serpmek. </li><li> Metin biçiminde altındaki görüntüleri floresan ölçümleri gibi verileri (gri düzeyleri yoğunluk seviyelerini temsil eden) ve ihracat toplayın ve bir elektronik tablo programı kullanarak aşağıda açıklanmıştır davranırım. </li><li> Her bir hücre ya da aşağıdaki denklem kullanılarak ilgili bölge için hücre içi pH değerini hesaplayın: pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max R)) x F dk (λ2) / F max (λ2) </li><li> F min (λ2) / K ma x (λ2), deneyler boyunca 450 nm floresansta bir azalma ile sonuçlanır sistemi ağartıcı veya kaçak var ise, bu oran kullanın. Ancak bu, çok nadiren des kullanılan koşullarda gözlenenaçıklanan şekilde deneyleri. </li><li> Kalibrasyon verileri her pH ölçümü sonunda mevcut gibi gelen hesaplanan değerler kalibrasyon için kullanılan pH değerleri farklı olup olmadığını kontrol edin. Bu durumda, aşağıdaki yordamı kullanarak kalibrasyon tüm deneysel belirlenen pH değerleri ayarlayın: <ol><li> Aşağıdaki katsayısı (Q, kalibrasyon değerleri arasında ölçülen değerler / Fark arasındaki fark) hesaplayın. Hesaplanan değerler karşılık gelen kalibrasyon değerlerini eşit olacak şekilde Q ile bütün veri kümesi ilave veya çıkarma ile son ayarlamayı yapın çarpın. </li></ol></li></ol> Hızlı Li + Alımına tarafından NHE7 başlangıç ​​Oranları 3. Ölçümler <ol><li> Çok yuvalı plakalar üzerinde Tohum hücreleri (6 yanı sıra 24) üzerinde ya da 20 de tarif edilen alternatif olarak nigericin / sığır serum albümini (BSA) asitlendirme tarif NH4 + yükleme tekniği kullanarak bunları asitleştirmek. </li><li&gt; Durulama Plakalar iki kez hızla yukarıda tarif edilen durulama çözeltisi kullanılarak ve daha sonra arzu edilen miktarda (hafif, Km değerlerinde altında) 1-10 mM lityum içeren alım Çözeltilerin hücreleri ve katyon istenen konsantrasyonlar ve / veya ilgi duyulan inhibitörleri inkübe zaman. </li><li> Bu taşıma başlangıç ​​oranları koşullarda faaliyet sağlamak için kısa ve tutarlı alım süreleri (genellikle bir dakika veya altında) koruyun. Ayrıca alımı için kullanılan tüm çözümler izotonik olduğundan emin olun. </li><li> Alım süresi sonunda, dikkatli bir şekilde alımı ortamı ortadan kaldırmak ve buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücreler dört kez yıkayın. (Dördü ideal için az 10 sn) lityum akışını önlemek için mümkün olduğunca hızlı bu yıkar gerçekleştirin. </li><li> Lyse% 25 Nitrik asit hücreler. % 25 nitrik asit, oyuk başına 250 ul uygulanır ve daha sonra pipet ucu ile her bir oyuğa hurda ve yeni mil bütün iyi süspansiyonu transfer, en az 1 saat bekletincrocentrifuge tüp. </li><li> Selüler artığın ayrılması için 15,000 x g&#39;de (oda sıcaklığı), 5 dakika boyunca, onları santrifüj, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine lizat aktarın. </li><li> Atomik absorpsiyon spektroskopisi 21 ile süpernatanların lityum içeriğini ölçün. NOT: Farklı şirketler Lityum oyuk katot lambası ile donatılmış gereken atomik absorpsiyon spektrometre sağlamak. Bu makineler çok hassas ama aynı zamanda oldukça hassas olarak üreticinin talimatlarını izleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway:+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters.">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li><li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H(+)-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis.">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li><li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent's+disease.">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li><li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration.">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li><li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6.">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li><li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+Na+/H++exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation.">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation,+microcephaly,+epilepsy,+and+ataxia,+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome.">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li><li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum.">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain &amp; Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li><li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry.">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li><li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder.">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li><li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+studies+in+ADHD.">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li><li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer's+disease+in+the+ADNI+cohort.">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred.">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li><li>Sardet, C., Franchi, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+primary+structure,+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na+/H++antiporter.">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na+/H++antiporter.">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Na+/H++Exchanger+NHE7+effects+a+Na++coupled,+but+not+K++coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis.">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li><li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes.">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li><li>Lacroix, J., Po&#235;t, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na/H+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens.">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenomic+Effects+of+Cisplatin:+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling.">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li><li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2,+NH3,+and+metabolic+inhibitors.">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-H++exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped,+fluorescent+pH+indicator.">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells.">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li><li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhBG+and+RhCG,+the+putative+ammonia+transporters,+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron.">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li><li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B:+a+new+gas+channel.">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, mevkiye-yönelik mutagenez ile birincil dizisini değiştirmeden, plazma membranında, hücre içi, Na + / H + değiştiriciler ifade eden hücreleri seçin açıklamaktadır. Bu değiştirici hemen karakterize edilebilir. Bu yöntem, plazma membranında veziküler, Na + / H + değiştiricileri ifade edecek hücre hatları seçmek için hücre içi proton hücresel zehirlilik dayanmaktadır. Bu örneğin, Li +, K +,</su...

Çoğu hücre içi bölmeleri olgunlaşması, insan ticareti, proteinler veya hormonlar ve yükleme nörotransmitterlerin geri dönüşümü için önemli bir parametredir asidik lümen pH görüntüler. Bu sitosol ve vesiküler içeriği arasındaki pH gradyanı veziküler CIC klorür taşıyıcılar 2 bağlanmış, vaküoler H + ATPazların 1 ile elde edildiği gösterilmiştir. Her iki knock-out (KO) farelerde ve insan hastalarda, bu taşıyıcıları önemi onların genlerinde 3-6 mutasyonlar neden ağır fenotip tarafından vurgulanmıştır. Sodyum-hidrojen değiştirici SLC9A ailesinin üyeleri, aynı zamanda, Na + / H + değiştirici NHEs olarak adlandırılan hücre-içi pH ve hücre hacmi düzenlenmesinde anahtar etkileyiciler yanı sıra epitelden asit-baz eşdeğerleri vektör taşıma olduğu gösterilmiştir . Plazma zarı NHEs yanı sıra, üç yüksek + / H + değiştiriciler, NHE-6, 7, Na korunmuşve 9, trans-Golgi ağı ve erken endozomlarda 7 olarak ifade edilmiştir. Onların genlerinde mutasyonlar Angelman benzeri veya Christianson sendromları 8-9, aile temelli otizm 10 ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğu 11-12 ile bağlantılı olmuştur. Bu dönüştürücüler ayrıca Alzheimer hastalığı yatkınlık 13 ve X-bağlantılı mental retardasyon bitişik genler gibi nörodejeneratif sorunlara 14 sendromları dahil edilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar beyin gelişimi ve / veya fonksiyon bu hücre içi NHEs önemini vurgulamak. Bu eşanjörleri hücre içi lokalizasyonu doğru onların iyon seçicilik ölçümleri, ulaşım yönü, kinetik parametreleri, ve düzenleme önler. Hücre içi bölümlerinde ifade tüm nakliyeciler için olduğu gibi, onların biyokimyasal faaliyetlerini değerlendirmek ve dolayısıyla tam olarak fizyolojik rolleri ve Mechan anlamak son derece zorizm kendi patolojik etkileri altında yatan. Yüksek sitozolik K + konsantrasyonu dayanarak, en çok yaygın kabul gören hipotez onlar K + birleştiğinde proton akış taşıyıcıları olarak görev olmasıydı. Bu değer sabit bir veziküler pH&#39;sını muhafaza etmek için V-ATPazların proton pompalama telafi edilebilir bir proton sızıntı olması, hipotez edilmiştir. Bu görsel maddenin amacı, plazma membranında veziküler taşıyıcıları ifade, ve (ii) bu nakil fonksiyonlarını ölçmek için, bağımsız iki yaklaşım göstermek için hücre çizgilerinin genetik olarak seçilmesi ile sağlayan bir yöntemi göstermek için, (i) &#39;dir. Üç yıl önce, Pouysségur ve Franchi NHE ailesinin 15 üyesi moleküler klonlama ve karakterizasyonu etkin bir genetik yaklaşım öncülük etmiştir. Bu tarama yöntemi olarak hücre içi proton toksisite dayanıyordu. İlk adım hücre hatları eksik elde etmek olduHerhangi bir Na + / H + değişimi bu taşıyıcı geri döndürülme oranı kullanılarak, plazma membranında ifade edilmiştir. Fibroblastlar (CCL39 hücre çizgisi), Na + ya da Li + önceden yüklenmiş ve daha sonra 2 saat süre ile bir asidik hücre dışı ortam (pH 6.5) içine yerleştirildi. Bu fonksiyonel, Na + / H + değişimi ifade eden hücrelerin ölümüne ve damar sertliği-yetersizliğine sahip hücrelerin (PS120 hücre çizgisi) 16 seçimine yol açmıştır. Bikarbonat içermeyen bir ortam içinde kültive edilince, bu hücreleri, akut hücre içi asitlenme çok hassastır. Bu tür hücreleri, akut hücre içi acidifications sunulur Sonuç olarak, eğer plazma membranında herhangi bir işlevsel proton akış mekanizması sentezleme pozitif (bakınız 17) seçilir. Bu gibi asitleştirme teknikler plazma membranında WT hücre içi NHEs zorla ifade sağlayan kusurları trafiğe sahip hücre çizgileri izole etmek için kullanılabilir. Ökaryotik, Na + / H deEşanjörleri elektro +, onlar kanalları ölçmek için büyük bir başarı ile kullanılmaktadır elektrofizyolojik yaklaşımlarla ölçülebilir değildir. Bu yazıda, bu nedenle hücre içi pH ölçümleri ve lityum alımının hızlı kinetik bu değiştirici aktivitesini ölçmek için nasıl gösterir. Temel kavramlar aynı gibi, bu seçim bölümü için geliştirilmiş süreçlerin birçok fonksiyonel ölçümler için doğrudan kullanılan olduğunu fark etmek ilginçtir. İlginç bir şekilde, bu metinde tarif edilen yaklaşımı kullanılarak seçilmiş hücre çizgileri mevcut trafik kusur veziküler potasyum kanalı TWIK1 18 olarak plazma zarının diğer veziküler proteinlerin daha büyük bir ifadesine neden olduğu gözlenmiştir. Bu veziküler transmembran proteinler için genel bir tutma kusur mekanizmasının seçimi doğru işaret. Dolayısıyla bu seçim prosedürü ve Mayıs üretir hücrelerihücre içi bölmelerin zar proteinleri üzerinde çalışanlar için ümit veren bir araç oluşturmaktadır. Yanı sıra burada sunulan ölçüm teknikleri olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları çalışmak için geçerli olabilir.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

Endozomal asidifikasyonu gibi sinaptik vesiküller protein geri dönüşüm ve bozulma, reseptör duyarsızlaştırma ve nöro-yükleme gibi işlemler, geniş bir aralığı için önemlidir. Bu asitlenme CIC klorür nakliyecilere birleştiğinde proton ATPazların, aracılık tarif edilmektedir. Elektro-proton taşıyıcıları yüksek ölçüde muhafaza edilmiş, Na + / H + değiştiriciler (NHE) 6, 7 ve 9, bu bölmelerin olarak ifade edilmiştir. Genlerindeki mutasyonlar, insan bilişsel ve nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Onların hücre içi lokalizasyonu detaylı fonksiyonel karakterizasyonu engelledi gibi Paradoksal, rolleri, zor kalır. Bu yazının bu sorunu çözmek için bir yöntemi gösterir. Bu plazma membranında hücre içi NHEs tutma akut sitosolik asitlenme kalan kapasitesine sahip mutant hücre hatlarının seçimi oluşur. Daha sonra iyon seçiciliği ve aktivitesini ölçmek için iki tamamlayıcı protokol göstermektedir(i) bir floresan görüntü mikroskopi kullanılarak hücre içi pH ölçümleri göre, ve (ii) bir lityum alımının hızlı kinetik göre: Bu değiştirici. Bu tür protokoller olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları ölçmek için çıkarım olabilir. Ayrıca, burada sunulan seçim prosedürü bir hücre içi tutma arızalı fenotip hücreleri üretir. Bu nedenle, bu hücreler de plazma zarı diğer veziküler membran proteinleri ifade edecektir. Burada tasvir edilen deneysel strateji, bu nedenle daha sonra veziküler + / H + seçimi için kullanılan değiştiriciler, Na ile birlikte, plazma membranında ifade edilecektir diğer hücre içi proteinleri incelemek için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak kullanılabilmektedir.

Seçim: Şekil 1A&#39;da görüldüğü gibi, lH + öldürme seçimi, amonyum zayıf bir baz difüzyon dayanmaktadır. zayıf bazlar ve hücre içi pH üzerindeki asitler difüzyon etkisi Walter Bor ve işbirlikçileri 22 öncülük edilmiştir. Zarif bir fikir pozitif genetik seçimi için ölümcül bir asitlenme sonra Jacques Pouysségur 17 tarafından geliştirilen üretmek için bu olguyu kullanmak için. Böyle bir protokol kapsamında,...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Görüntüleme.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Video: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Biyokimya

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biyoloji

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Na fonksiyonel karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler