This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Bütün hayvan prosedürleri Columbia Üniversitesi IACUC ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için geçerli kurallar tarafından kabul edildi izledi. Not: RNaz içermeyen veya DEPC ile muamele edilmiş su içinde ISH işlemleri için kullanılan tüm tamponları hazırlayın. ISH tamamlanmıştır fakat tampon de otoklavlanmış çifte damıtılmış su içinde hazırlanır ve / veya filtreleme ile sterilize edilir önerilmektedir sonra bu öneri kesinlikle gerekli değildir. 1. İmmünohistokimya Ardından Situ Hibridizasyon Yetişkin Fare Beyin kullanarak Floresan in Kolinerjik Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen (FISH) tespiti <ol><li> Paraformaldehid sabit dondurulmuş beyin dilimleri için örnek hazırlama <ol><li> Aşağıdaki Örneğin, sabit bir dondurulmuş bir fare beyinlerinden dilimleri hazırlamak. <ol><li> Kısaca, ketamin anestezi 9 aylık fareler kurban (100 mg kg -1 vücut ağırlığı) ve xylazine (10 mg kg -1 vücut weigHT), PBS içinde% 4 paraformaldehit transcardial infüzyonu (pH 7.4) eklenmiştir. </li><li> 4 o C&#39;de 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid beyin ve post-fix kaldır </li><li> Tespit edildikten sonra, 4 O ° C&#39;de 24 saat süre ile, PBS (pH 7.4) içinde numuneleri% 30 sukroz içinde üç PBS içinde süreleri ve cryoprotect yıkama </li><li> Ekim göm beyinler bir kriyostat üzerinde, 20 mikron seri bölümünde, bileşik donma ve poli-D-lizin tedavi mikroskop lamı üzerine monte edin. -20 O C&#39;de kullanıma kadar beyin dilimleri tutun. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile dondurucu ve kuru hava ile ilgili paraformaldehid ile tespit edilmiş olan beyin dilimleri çıkarın. </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Bir çeker ocak içinde, yeniden düzeltme beyin oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid ile 20 dakika keser. NOT: DİKKAT: 4% paraformaldehit toksiktir ve uygun güvenlik protokolleri takip ederek ve atılmalıdır. </li><li> 1x PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Beyin dilimleri dehydrate. <ol><li> % 50,% 75 ve% 100 Hazırlamaetanol çözümleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 75 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca,% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, taze,% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. Not: Alternatif olarak, slaytlar 1 aya kadar C o -20% 100 etanol içinde saklanabilir. </li></ol></li></ol></li><li> FISH tahlil ısı kaynaklı antijen / RNA maskesinin kaldırıldı ile immunohistokimyasal izledi <ol><li> Başlamadan önce gerekli tüm malzemeyi hazırlayın: <ol><li> 40 o C hibridizasyon fırın ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam yaratmak için fırında damıtılmış su ihtiva eden bir tepsiye yerleştirin. </li><li> Bir slayt kutusu alın ve içine slayt kutusu nemlendirmek için distile suda ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Hibridizasyon fırında slayt kutusu yerleştirin. </li><li> Buzdolabı probları (negatif ve hedef problar her ikisi de) çıkarın ve 10 dakika için hibridizasyon fırında ısıtın. Sondalar dow soğumaya bırakınoda sıcaklığında n. </li><li> Oda sıcaklığında (Floresan Multiplex Reaktif Kiti dahil) büyütme reaktifleri AMP 1-4 dengelenmesi. </li><li> Antijen alma çözeltisi hazırlayın: 10 mM sodyum sitrat (pH 6),% 0.05 Tween 20 Not: Çözelti süresiz oda sıcaklığında saklanabilir ve gelecekteki boyanması için de kullanılabilir. </li><li> RNaz ücretsiz veya DEPC arıtılmış su içinde (Floresan Multiplex Reaktif Kiti dahil) 50x stok solüsyonu seyreltilmesi 1x yıkama tamponu hazırlayın. Not: 1 x yıkama tamponu 1 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir ve ileride boyanması için de kullanılabilir. 50x yıkama tamponu hızlandırabilir olabilir. Bu durumda, 1 x çözeltisinin hazırlanması önce 10 dakika boyunca 40 C &#39;de, ısı 50x yıkama tamponu. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca,% 100 etanol ve kuru hava slaytları çıkarın. </li><li> Antijen alma çözeltisi 50 ml ihtiva eden bir coplin kavanoz hazırlayın. Antijen alma çözeltisi içinde slaytlar daldırın ve mikrodalga fırında 10 dakika süreyle kaynatın. NOT: Alternatif bir yerde 100 mm yatay slaytlaralma çözeltinin 100 ml içeren çap yuvarlak cam tabak. <ol><li> Distile su ile 1 L beher doldurun ve mikrodalga yerleştirin. NOT: maskesinin kaldırıldı yaparken su ısı &quot;tampon&quot; olacaktır. </li><li> Mikrodalga içindeki antijen alma çözeltisi içinde slaytlar yerleştirin. Kaynatın 5 dakika boyunca yüksek güçte kayar. Numuneler kaynar durduruldu hemen sonra, ısı ekstra 5 dakika boyunca yüksek güçte tekrar kayar. </li><li> RT&#39;de slaytlar serinleyin. NOT: KRİTİK ADIM: kaynar süresi ve prosedür mikrodalga özelliklerine bağlı olarak, kullanıcı tarafından belirlenmelidir. hızlı yüksek derecede kaynama özellikli Çözelti buharlaştırma şansını başlar. Bu durumda, numuneler iki kez 10 dakikalık bir toplam olduğunu ortaya çıkarması zaman tamamlamak için daha kısa zaman periyotları için kaynatılır önerilir. Isıtma, orta ya da düşük güçte gerçekleştirilir Aksine, maskesinin düşürülmesi, 10 dakika boyunca bir kez yapılabilir. Ancak, eğer örnekleri continuousl kaynatın yokYaklaşık 10 dakikalık bir toplam Y bu tespit edilecek olan hedef RNA ve protein hem de kısmi maskesinin düşürülmesi neden olabilir. </li></ol></li><li> Yıkama 1x PBS ile üç kez kayar. </li><li> Arka plan boyama değerlendirmek için kullanılan beyin kesitleri ayarlanmış dapB prob 3 damla (~ 100 | il) - 2 ekleyin. Not: dapB prob seti bakteriyel gen hedef ve herhangi memeli RNA tanıması gerekir. </li><li> Ilgi RNA tespit etmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış hedefleme prob 3 damla - 2 ekleyin. Not: Bir prob seti artıklarını 20 hedef - Atf4 mRNA bu örnekte kullanılan fare 1.381. </li><li> Parafilm Kapak slaytlar, prob buharlaşmayı önlemek hibridizasyon fırının içindeki nemlendirilmiş slayt kutusuna koyun ve 2 saat boyunca 40 o C&#39;de onları inkübe. Not: İsteğe bağlı: Ek beyin kesitleri fare Polr2A hedef alan bir prob seti ile hibridize ve pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. </li><li> Yıkama slides iki kez oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile yıkandı. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 1-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 2-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 3-FL 3 damla, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe, parafilm slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> 2 Ekle - Her beyin dilim amplifikasyon reaktif AMP 4-FL 3 damla, koyun, parafilm slaytlar kapakSlayt kutusu ve hibridizasyon fırınında 15 dakika boyunca 40 o C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yıkama 1x PBS ile 2 dakika süre ile 1 x yıkama tamponu oda sıcaklığında iki kez, iki kez kayar. </li><li> Ekle 100 - slaytlara 3 mg / ml BSA, 100 mM glisin ve% 0.25 Triton X-100, PBS içinde (pH 7.4) içeren bir bloklama solüsyonu (tam dilimleri kapak ya da yeterli hacim) 200 ul, parafilm ile kapak ve Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> , Slaytlara çözeltisi (1/100) engelleme seyreltilmiş bir anti-ChAT antikorun 200 ul parafilm ile kapak ve 4 O ° C&#39;de 2 gün süreyle inkübe - 100 ekleme Beyin dilimleri kurumasına yok emin olun. Gerekirse, 24 saat inkübasyon sonrası beyin dilimleri anti-ChAT antikor çözüm yeniden uygulayın. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Ekle 100 - Uygun Alexa-konjuge sekonder antikor, 200 ul (., Örneğin, bu özel örnekte, Alexa-594 eşek anti-keçi) slaytlara, parafilm ile inkubasyon ile kapakoda sıcaklığında 1 saat için yedi. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez kayar. </li><li> Yıkama damıtılmış su ile bir kez kayar. </li><li> Montaj DAPI içeren montaj ortamı ile kayar. </li><li> Bir floresan mikroskop altında beyin dilimleri gözünüzde canlandırın. </li></ol></li></ol> Luxol Hızlı Mavi ve Cresyl Violet counterstaining Ardından Situ Hibridizasyon (CISH) kromojenik kullanılarak İnsan Beyninin Samples Aksonlar için Atf4 mRNA Yerleşen 2. Algılama <ol><li> Formalin ile sabitlenmiş, parafin gömülmüş insan beyninin örnekleri için örnek hazırlama <ol><li> 1 saat 60 o C&#39;de kuru fırında pişirin dilimleri. </li><li> Bir çeker ocak içinde Deparaffinize beyin kesitleri. NOT: DİKKAT: reaktifler toksik ve ele alınması gerekir ve uygun güvenlik yönergeleri izleyerek atılır <ol><li> 10 dakika boyunca iki kez ksilen alternatif temizleme ajanı slaytlar bırakın. </li><li> 1 dakika boyunca iki kez% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> Birir-kuru dilimler oda sıcaklığında 5 dakika. Not: Alternatif numuneler RT O&#39;da kurutulmuş olabilir / N ancak 24 saat içinde kullanılmalıdır. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidin (DAB) ısı kaynaklı ve proteaz kaynaklı RNA maskesinin kaldırıldı kullanarak luxol hızlı mavi ve mor leke cresyl ardından kromojenik ISH tahlil tabanlı <ol><li> Başlamadan önce gerekli malzemeleri hazırlayın: <ol><li> 40 o C hibridizasyon fırın ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam yaratmak için distile su içeren bir tepsiye yerleştirin. </li><li> Bir slayt kutusu alın ve içine slayt kutusu nemlendirmek için distile suda ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Hibridizasyon fırında slayt kutusu yerleştirin. </li><li> RNaz ücretsiz veya DEPC arıtılmış su içinde (CISH Reaktif Kiti dahil) 10x stok solüsyonu seyreltilmesi ile 1x ön muamele 2 hazırlayın. Ön-muamele sıcak bir plaka üzerinde gerçekleştirilirse, ön-muamele, eğer (çanağı ve sıcak plaka arasındaki temas yüzeyini büyütmek için, 100 mm çapında bir cam tabak için bir ön işlem çözeltisinden 100 ml ilave1.2.3 belirtildiği gibi, bir mikrodalga fırın içinde gerçekleştirildiğinde, bir coplin kavanozu) yerine kullanılabilir. 100 o C Isı çözümü ve örnekleri batış önce artık 30 dakika daha kaynayan tutmak. </li><li> Isı negatif ve pozitif sondalar 10 40 o C&#39;de dakika ve oda sıcaklığında soğumasını. </li><li> Oda sıcaklığında (CISH Reaktif Kiti dahil) büyütme reaktifleri AMP 1-6 dengelenmesi. </li><li> Damıtılmış su (CISH Reaktif Kiti dahil) 50x stok solüsyonu seyreltilmesi 1x yıkama tamponu hazırlayın. Not: 1 x yıkama tamponu 1 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir ve ileride boyanması için de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Her beyin dilim için önceden işleme 1 ~ 4 damla (~ 120 | il) ilave parafilm ile kapatın ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Taze damıtılmış su içinde 3-5 kez yıkayın. </li><li> Isı kaynaklı maskesinin kaldırıldı gerçekleştirin: <ol><li> (CISH Reaktif Kiti dahil) sıcak önceden işleyin 2 Transferi slaytlar 15 dakika çözüm ve kaynatın. Kaynama sağlayan sıcak bir plaka üzerinde yapılabilir Not:Sürekli kaynama ya da 1.2.3 belirtilen kritik adımlar) Aşağıdaki bir mikrodalga. </li></ol></li><li> Hemen distile su slaytlar aktarmak ve 3 ila 5 kez yıkayın. </li><li> Yıkama taze% 100 etanol içinde 3 ila 5 kez kayar. </li><li> Hava kuru dilimler, oda sıcaklığında 5 dakika. Not: Alternatif dilimler kurutulabilir O / N. </li><li> Proteaz kaynaklı maskesinin kaldırıldı uygulayın: <ol><li> (CISH Reaktif Kiti dahil) önceden işleyin 3 4 damla ekleyin, parafilm ile kaplayın ve hibridizasyon fırında 40 o C&#39;de 30 dakika inkübe. </li></ol></li><li> Yıkama taze damıtılmış su içinde 3 ila 5 kez kayar. </li><li> Arka plan boyama değerlendirmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış dapB probu 4 damla ekleyin. </li><li> Ilgi RNA tespit etmek için kullanılan beyin dilimleri ayarlanmış hedefleme probu 4 damla ekleyin. NOT: kalıntılarını 15 hedefleme prob seti - İnsan ATF4 mRNA 1,256 bu örnekte kullanılmıştır. İSTEĞE BAĞLI: Ek beyin dilimleri hyb olabilirİnsan ppiB hedef alan bir prob seti ile ridized ve pozitif kontroller olarak kullanılmıştır. </li><li> Slayt kutusuna slaytlar yerleştirin ve 2 saat süre ile inkübe edilir. hibridizasyon fırında 40 o C&#39;de. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime AMP 1 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime AMP 2 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime AMP 3 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 30 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> 1x oldu ile iki kez yıkayın slaytlaroda sıcaklığında 2 dakika süre ile H tamponu. </li><li> Her beyin dilime AMP 4 reaktif 4 damla ekleyin, parafilm slaytlar kapak, slayt kutusuna koyun ve hibridizasyon fırında 15 dakika süreyle 40 o C&#39;de inkübe. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her bir beyin dilime AMP 5 reaktif 4 damla, parafilm ile slaytlar kapağı ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her bir beyin dilime AMP 6 reaktifi 4 damla, parafilm ile slaytlar kapağı ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki defa açılır. </li><li> Her beyin dilime ~ çözeltinin 120 ul ekleyin, (CISH Reaktif Kiti dahil) eşit BROWN-1 hacmini ve BROWN-2 reaktif karıştırın parafilm kapağı ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkama oda sıcaklığında 2 dakika için 1 x yıkama tamponu ile iki kez kayar ve damıtılmış su içinde bir kez yıkayın. NOT: KRİTİK ADIMLAR: Aşağıdaki adımlar için kritik olanRNA granüllerinin varlığı maskeleme olmadan optimal aksonal counterstain edinin. </li><li> Bir aydınlık mikroskop altında ilgi mRNA varlığını kontrol counterstain gerçekleştirmeden önce. Counterstain prosedür boyunca puncta varlığını izlemek için hangi beyin örneklerinde referans alanlarını tanımlayın. </li><li> 60 o C&#39;de ısıtın luxol hızlı mavi çözüm </li><li> Yer luxol hızlı mavi slaytlar ve 60 o C de 30 dakika inkübe </li><li> Damıtılmış su içinde birkaç kez çalkalayın. </li><li> Daldırma farklılaşmasını başlatmak için% 0.05 lityum karbonat çözeltisi içinde birkaç kez kayar. </li><li> Dip taze% 75 etanol içinde iki kez kayar. </li><li> Damıtılmış su içinde durulayın. </li><li> Bir aydınlık mikroskop altında beyin dilimleri kontrol edin. Gri ve beyaz cevher koyu mavi / siyah puncta olarak hala görünür ayırt ve RNA granülleri olmaya başlaması gerektiğini unutmayın. Aksonlar açık mavi lifler gibi görünen başlar doğrulayın. </li><li> Tekrarlayın 2.2.32 ile 2.2.28 adımları. Perfor20 dk adımlar dikkatle counterstain ve RNA granül varlığının izlenmesi - 10 luxol hızlı mavi çözeltisi ile m inkubasyon. Not: Genellikle, optimum counterstain 60 kazanılır - bu RNA granüller luxol hızlı mavi leke (örnekler için bakınız Şekil 2) tarafından maskeli olabileceği şüphesi varsa 90 dakika (toplam kuluçka süresi) ancak zaman kısaltılabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kresil violet solüsyonu slaytlar inkübe edin. </li><li> Damıtılmış su içinde slaytlar durulayın. </li><li> Dip% 70 etanol içinde 5-10 kez kayar. </li><li> % 100 etanol 3 hızlı değişiklikleri ile beyin dilimleri dehydrate. </li><li> Bir çeker ocak içinde, 2 dakika ve oda sıcaklığında 5 dakika süre ile üçüncü kez ksilen, alternatif temizleme maddesi içinde iki kez inkübe edilerek açık bir beyin kesitleri. </li><li> Ksilen bazlı kalıcı montaj ortamda Dağı beyin dilimleri. </li><li> Bir aydınlık mikroskop altında örnekleri analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse.">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li><li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones.">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li><li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+&#946;-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2+-dependent+growth+cone+guidance.">An essential role for &#946;-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li><li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth.">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506 (2014).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+Is+an+RNA-Binding+Protein,+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly.">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li><li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li><li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival.">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li><li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons.">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li><li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome.">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079 (2012).</li><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions.">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li><li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yazıda axonally lokalize Atf4 mRNA&#39;nın tespiti yüksek çözünürlüklü ISH teknolojisinin kullanımını tarif eder. Bu ve daha önce yayınlanmış çalışmalar, bu teknoloji dokular ya da hatta tüm embriyolar 33 antikor bazlı protein tespiti ile uyumlu olduğunu gösterir. Önemli olarak, bu son hipokampal nöronlar 34 dendritleri olan ark mRNA&#39;nın tespiti için kullanılmıştır. Aynı zamanda, dokuya boyama için histolojik boyalar ile kombine edilebilir. ...

Aksonal mRNA istihdam ve yerel çeviri bir zamansal ve mekansal akut bir şekilde 1 ekstrasellüler uyaranlara yanıt vermek için aksonları etkinleştirin. Intra-aksonal protein sentezi en iyi akson 9-11 pathfinding ve retrograd 12,13 sinyalizasyon, büyüme konisi davranış 2-8 yılında çok önemli roller oynamaktadır nörogelişimsel bağlamında anlaşılmaktadır. Aksonal mRNA ve ribozom seviyeleri büyük ölçüde 14,15 azalır Ama çok daha az post-gelişimsel nöronlar akson protein sentezi fonksiyonel önemi hakkında bilinmektedir. Olgun omurgalı aksonlar uzunluğunda 16 translationally inaktif olduğu düşünülmektedir. Ancak son çalışmalar, yerel çeviri patolojik koşullarda olgun aksonların içinde yeniden olduğunu göstermektedir. Örneğin, mRNA bir alt sinir yaralanması ve intra-aksonal protein sentezi, bu aksonlar 17 doğru rejenerasyonu için gerekli olan aşağıdaki yenileyici aksonlar için işe. Ayrıca, bizim grup haS, Alzheimer hastalığı peptid Aβ 1-42 ve transkripsiyon faktör ATF4 lokal çeviri yerel nöronal soma 18 aksonlardan Aβ 1-42 nörodejeneratif etkileri yaymak için gereklidir sonra spesifik mRNA&#39;lar aksonlar için işe olduğunu göstermiştir. Son olarak, yüksek verimlilik analizleri olgun aksonlar özellikle patolojik koşullarda, 18-21 beklenenden daha karmaşık ve dinamik bir transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmalar ışığında, son derece hassas ve özel yöntem, yetişkin sinir sisteminde lokalize axonally mRNA&#39;lar tabi tespit etmek. MRNA işe ve olgun akson yerel çeviriye çalışmaların çoğu kültürlü nöronlar üzerinde yapılmıştır. Özel kültür yöntemleri somato-dendritik bölmesi 18-20 den akson izolasyonu izin vermesini var çünkü transcriptome analizleri için bu özellikle doğrudur. Bu tür çalışmalar, değerli ins verilmiş olmasına rağmenolgun akson yerel çeviri rolüne ight, soru kültürlü nöronlar sadakatle vivo durumu temsil veya mRNA işe kültürleme koşullara aksonların bir uyum cevabı ise hala açık olup olmadığını. Az sayıda çalışma in vivo aksonlar olgun mRNA işe kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, koku markör proteini kodlayan transkript yetişkin duyu nöronları 22 akson tespit edildi. Β-aktin mRNA &#39;nın 3&#39; UTR içeren bir transgen farelerinde periferal ve merkezi sinir sistemi nöronlarının akson taşınır ve yerel olarak gelişim dönemlerde 23 sonra çevrilmiştir. Xenopues Kurbağa yavrularını laevis de Lamin b2 mRNA retina aksonlar lokalize ve tükenme aksonal gelişimi 21 sonra akson bakım etkiler. Sitokrom C oksidaz IV mRNA kodlama aksonal taşıma Müdahale fare davranışını 24 değiştirir. Son olarak, Atf4 mRNA yetişkin a bulunanAβ 1-42 bağlamında fare ve insan beyin Xons nörodejenerasyonu 18 indüklenen. Yüksek üretim transcriptome analizleri, in vitro olarak izole akson mRNA profillerini belirlemek ancak aksonlar izolasyon bulunabilir, ancak nöronal hücre gövdeleri, gliyal hücreleri ve diğer hücre tipleri ile iç içe hiçbir zaman bütün dokularda yana in vivo çalışmalar için sınırlamalar olması yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu durumda, bu analizler, mRNA bir hücre içi lokalizasyonu teyit görüntüleme teknikleri ile kombine edilmelidir. In situ hibridizasyon (ISH RNA) RNA hücre ve dokularda spesifik RNA dizilerinin algılama ve görselleştirme sağlar. Ancak, orijinal RNA, ISH testlerinin nadiren axonally lokalize mRNA için durum oldukça zengin RNA&#39;ların 25 tanımlanması için uygun idi. Çabaları artan son yıllarda için tek-molekül düzeyinde mRNA algılanmasına izin gelişen yeni teknolojiler konulmuştur <sup&gt; 25,26. Örneğin, Singer ve arkadaşları içinde oluşan tek hücrelerde mRNA algılamak için ISH sondalar geliştirdik 5 örtüşmeyen floresan (ayrıntılar 27&#39;ye bakınız için) 50-mers etiketli. Yukarıda belirtilen teknikler ve burada açıklanan bir arasındaki temel fark, daha sonra 20 çift Z-yapı (lineer değil), tipik olarak, faiz sağlanması özgüllük ve düşük arka plan seviyelerinin RNA ~ 1 kb bölgesini hedef sondalar kullanmasıdır. Sondalar daha sonra son olarak, flüoresan olarak etiketlenir veya kromojenik tepkileri izin enzimler ile konjuge edilmiş ön yükselteç ve amplifikatör sekansları ile hibridize edilir. Bu amplifikasyon adımları diğer ISH teknolojileri 28 ile karşılaştırıldığında sinyali-gürültü oranını iyileştirir. Burada floresans immunositokimya ile veya aksonal counterstaining sağlayan histolojik boyalarla, ya Birleştirilen RNAscope kullanılarak iki protokol açıklar. Her iki protokol erişkin mo Atf4 mRNA aksonal lokalizasyonu görselleştirmek için uygundurkullanımı ve insan beyni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNA&#39;ları sıkça omurgalı akson lokalize ve yerel çeviri akson yol bulma veya geliştirme sırasında ve postdevelopmental dönemlerde bakım, onarım veya nörodejenerasyonun için dallanma için gereklidir. Yüksek verim analizleri son zamanlarda aksonlar önce beklenenden daha dinamik ve karmaşık transcriptome sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu analiz, bununla birlikte daha çok aksonlar somato-dendritik bölmeleri izole edilebilir kültürlenmiş nöronlar yapılmıştır. Bu, in vivo olarak, tüm dokularda bu tür izolasyon elde etmek hemen hemen imkansızdır. Bu durumda, bir bütün hayvan mRNA ve bunların fonksiyonel alaka işe doğrulamak amacıyla, transcriptome analizleri ideal yerinde mRNA görülmesini sağlayacak teknikleri ile kombine edilmelidir. Son zamanlarda, bir tek-molekül düzeyinde RNA&#39;lar tespit roman ISH teknolojileri geliştirilmiştir. MRNA&#39;nın hücre içi lokalizasyonu analiz edilirken bu özellikle önemlidirBeri lokalize RNA&#39;lar genellikle düşük seviyelerde bulunur. Burada yeni bir derece hassas bir RNA ISH teknolojisini kullanarak axonally-lokalize mRNA&#39;ların tespiti için iki protokol açıklar. Biz olgun fare ve insan beyinlerinde in vivo akson için Atf4 mRNA işe doğrulamak için floresan immunhistokimya veya histolojik boyalar kullanarak aksonal counterstain ile RNAscope ISH birleştirdik.

Yukarıda tarif edilen prosedürlere kısa bir özeti Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Atf4 mRNA optimal deteksiyon ısıya bağlı maskesinin kaldırıldı kullanılarak kolinerjik aksonlarda granülleri MRNA aksonal lokalizasyonu değerlendirirken, bu aksonlar tespit edebilmek ve düşük bol RNA&#39;lar görselleştirmek mümkün önemlidir. Burada tarif edilen RNA, ISH teknolojisi, tek moleküllü çözünürlükte RNA&#39;lar beli...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K Görüntüleme.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Video: Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Yüksek çözünürlük<em&gt; İn Vivo</em&gt; 3T Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanma İnsan hipokampal alanlar için Manuel Segmentasyon Protokolü

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Çabuk<em&gt; In Situ</emSerotonin Sendromu ile Ratlarda Paraformaldehyde-öneki Beyin oligonükleotid Problar kullanarak&gt; Melezleme

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...