Name: detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Alle tierischen Verfahren wurden durch die IACUC der Columbia University und der geltenden Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt wurden befolgt. Hinweis: Bereiten Sie alle für die ISH Verfahren in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser verwendeten Puffer. Diese Empfehlung ist nicht unbedingt notwendig, nachdem ISH abgeschlossen ist, aber es wird vorgeschlagen, dass Puffer noch in autoklaviertem bidestilliertem Wasser hergestellt und / oder durch Filtern sterilisiert. 1. Nachweis der ATF4 mRNA lokalisiert Cholinerge Axone im Gehirn erwachsener Mäuse mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durch Immunhistochemie Gefolgt <ol><li> Probenvorbereitung für die Para fixierten gefrorenen Hirnschnitten <ol><li> Für das folgende Beispiel, bereiten Scheiben von festen gefrorenen Gehirn der Maus. <ol><li> Kurz gesagt, zu opfern, 9 Monate alten Mäusen durch Anästhesie mit Ketamin (100 mg kg -1 Körpergewicht) und Xylazin (10 mg kg -1 Körper weigHT) von transkardialer Infusion von 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) folgte. </li><li> Gehirne und post-fix in 4% Paraformaldehyd zu entfernen für 24 Stunden bei 4 o C </li><li> Nach der Fixierung, Waschen Proben dreimal in PBS und in 30% cryoprotect Saccharose in PBS (pH 7,4) für 24 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie Gehirne in OCT Einfrieren Verbindung, seriell Schnitt bei 20 &amp; mgr; m auf einem Kryostaten und montieren auf Poly-D-Lysin behandelten Objektträgern. Halten Hirnschnitten bei -20 o C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Entfernen Parafesthirnschnitten aus dem Gefrierschrank und der Luft trocknen für 30 min bei RT. </li><li> Dreimal mit 1x PBS waschen. </li><li> In einer Abzugshaube, Re-fix Hirnschnitten 20 min mit 4% Paraformaldehyd bei RT. HINWEIS: ACHTUNG: 4% Paraformaldehyd ist giftig und muss behandelt und entsorgt werden entsprechend folgenden Sicherheitsprotokolle. </li><li> Dreimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Entwässern Hirnschnitten. <ol><li> Vorbereitung 50%, 75% und 100%Ethanollösungen. </li><li> Einzutauchen Folien in 50% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen Folien in 75% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen Folien in frischem 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. Hinweis: Alternativ können Folien in 100% Ethanol bei -20 ° C bis zu 1 Monat gelagert werden. </li></ol></li></ol></li><li> FISH-Test, gefolgt von Immunhistochemie unter Verwendung von Hitze-induzierte Antigen / RNA Demaskierung <ol><li> Vor dem Start bereiten alle erforderlichen Material: <ol><li> Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und legen Sie eine Schale mit destilliertem Wasser in den Ofen, um eine feuchte Umgebung schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen. </li><li> Sonden (sowohl negative als auch Zielsonden) Entfernen von Kühlschrank und erwärmen diese im Hybridisierungsofen für 10 min. Lassen Sie die Proben abkühlen down bei RT. </li><li> Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-4 (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) bei RT. </li><li> Bereiten Antigen-Retrieval-Lösung: 10 mM Natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20 Hinweis: Lösung kann bei RT auf unbestimmte Zeit gespeichert und für zukünftige Färbung verwendet werden. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. HINWEIS: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. 50x Waschpuffer könnte auszufällen. Wenn ja, Wärme 50x Waschpuffer bei 40 ° C für 10 Minuten vor der Herstellung der Lösung, 1x. </li></ol></li><li> Folien aus 100% Ethanol und Luft trocknen entfernen 5 min bei RT. </li><li> Bereiten Sie eine Coplin-Gefäß mit 50 ml Antigen-Retrieval-Lösung. Tauchen Sie Folien in Antigen-Retrieval-Lösung und kochen Sie sie für 10 Minuten in einem Mikrowellenofen. HINWEIS: Alternativ Ort horizontal gleitet in einer 100 mmDurchmesser runde Glasschale, die 100 ml Retrieval-Lösung. <ol><li> Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit destilliertem Wasser und legen Sie sie in der Mikrowelle. HINWEIS: Das Wasser wird &quot;Puffer&quot; die Hitze bei der Durchführung Entlarvung. </li><li> Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in der Mikrowelle. Boil gleitet bei hoher Leistung für 5 Minuten. Unmittelbar nach Proben gestoppt Kochen, gleitet Wärme wieder bei hoher Leistung für zusätzliche 5 min. </li><li> Cool down Folien bei RT. HINWEIS: kritischer Schritt: siedendem Dauer und Verfahren ist vom Anwender festgelegt werden, abhängig von den Mikrowelleneigenschaften. Je schneller das Kochen beginnt desto höher die Chancen der Lösung Verdunstung. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass die Proben für kürzere Zeiträume mehr als zweimal, um eine Gesamt Demaskierung von 10 min abgeschlossen gekocht. Im Gegenteil, wenn der Heizbetrieb mit mittlerer oder niedriger Leistung durchgeführt wird, Demaskierung kann einmal für 10 min durchgeführt werden. Allerdings, wenn Proben nicht kochen continuously für eine Gesamtmenge von etwa 10 min wird diese in Teil Demaskierung sowohl der Ziel-RNA und Protein führen zu detektieren. </li></ol></li><li> Wash gleitet dreimal mit 1x PBS. </li><li> In 2 - 3 Tropfen (~ 100 &amp; mgr; l) des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. Hinweis: Das dapB Sondensatz richtet sich an ein bakterielles Gen und sollte keine Säugetier-RNA zu erkennen. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen der Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: ein Sondensatz Targeting-Reste 20 - 1381 der Maus ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. </li><li> Deckgläser mit Parafilm zu Sonde Verdunstung zu vermeiden, legen Sie sie in der befeuchteten Objektträger Box in der Hybridisierungsofen inkubieren sie bei 40 ° C für 2 Stunden. HINWEIS: Optional: zusätzliche Hirnschnitten mit einem Sondensatz Targeting Maus Polr2A hybridisiert und als positive Kontrollen verwendet werden. </li><li> Wash slides zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 1-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 2-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 3-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 4-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in dieDia-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und zweimal mit 1 × PBS. </li><li> Hinzuzufügen 100-200 ul (oder genügend Volumen, um vollständig zu bedecken Slices) einer Blockierlösung, die 3 mg / ml BSA, 100 mM Glycin und 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) auf die Objektträger, bedecken sie mit Parafilm und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> In 100 bis 200 &amp; mgr; l Anti-ChAT-Antikörper in Blockierungslösung (1/100) auf die Objektträger verdünnt, decken Sie sie mit Parafilm und Inkubation für 2 Tage bei 4 o C Stellen Sie sicher, dass Hirnschnitten nicht austrocknen. Falls erforderlich, erneut bewerben anti-ChAT-Antikörperlösung zu Hirnschnitten von 24 Stunden nach der Inkubation. </li><li> Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT. </li><li> In 100 bis 200 &amp; mgr; l der geeigneten Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (. ZB Alexa-594 Esel anti-Ziege für dieses spezielle Beispiel) auf die Objektträger, Deckel mit Parafilm und Incubaß für 1 h bei RT. </li><li> Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT. </li><li> Wash gleitet einmal mit destilliertem Wasser. </li><li> Berg Träger mit DAPI haltigen Eindeckmedium. </li><li> Visualisieren Hirnschnitten unter dem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol> 2. Nachweis von ATF4 mRNA lokalisiert, um Axone in Human Brain Proben unter Verwendung chromogener in situ Hybridisierung (CISH) von Luxol Fast Blue und Kresylviolett Gegenfärbung Gefolgt <ol><li> Probenvorbereitung für die Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete menschliche Gehirnproben <ol><li> Bake Scheiben in einem Trockenofen bei 60 ° C für 1 Stunde. </li><li> Entparaffinieren Hirnschnitten in einem Abzug. HINWEIS: ACHTUNG: Reagenzien sind giftig und müssen behandelt werden und verworfen folgenden die entsprechenden Sicherheitsrichtlinien <ol><li> Tauchen Sie Folien in Xylol alternativen Clearingstelle, zweimal für 10 min. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol zweimal für 1 min. </li><li> EINir-trockenen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ können Proben bei Raumtemperatur getrocknet werden, O / N, sondern muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidin (DAB) -basierte chromogenen ISH Assay gefolgt von Luxol schnell blau und Kresylviolett Fleck mit wärmeinduzierten und Protease-induzierte RNA Demaskierung <ol><li> Vor Beginn der Vorbereitung benötigte Materialien: <ol><li> Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und setzen Sie ein Fach destilliertes Wasser, das um eine feuchte Umgebung schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen. </li><li> Bereiten 1x vorbehandeln 2 durch Verdünnen der 10x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. Wenn Vorbehandlung auf einer heißen Platte durchgeführt wird, werden 100 ml Vorbehandlung Lösung zu einem Durchmesser von 100 mm Glasschale, um die Kontaktfläche zwischen der Schüssel und der heißen Platte zu erhöhen (falls Vorbehandlungin der Mikrowelle durchgeführt wird, kann ein Coplin-Gefäß statt dessen verwendet werden, wie in 1.2.3 angegeben). Wärme Lösung auf 100 o C und halten Sie sie koch nicht länger als 30 Minuten vor dem Untertauchen Proben. </li><li> Wärme negativen und positiven Proben 10 min bei 40 ° C und Abkühlen auf RT. </li><li> Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-6 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) bei RT. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in destilliertem Wasser. Hinweis: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. </li></ol></li><li> In ~ 4 Tropfen (~ 120 &amp; mgr; l) von 1 vorbehandeln zu jeder Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser waschen. </li><li> Führen wärmeinduzierten Demaskierung: <ol><li> Objektträger, um heiße vorbehandeln 2 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) Lösung und kochen für 15 Minuten. Hinweis: Boiling können auf einer heißen Platte Gewährleistung durchgeführt werdenkontinuierliche Kochen oder in der Mikrowelle folgenden kritischen Schritte in 1.2.3 angegeben). </li></ol></li><li> Dias zu destilliertem Wasser sofort übertragen und waschen 3 bis 5 mal. </li><li> Wasch gleitet 3 bis 5 mal mit frischem 100% Ethanol. </li><li> Luft trocknen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ Scheiben getrocknet werden O / N. </li><li> Führen Sie Protease-induzierte Demaskierung: <ol><li> 4 Tropfen vorbehandeln 3 (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), Deckel mit Parafilm und Inkubation 30 min bei 40 o C im Hybridisierungsofen. </li></ol></li><li> Wash gleitet 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser. </li><li> 4 Tropfen des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. </li><li> 4 Tropfen des Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: eine Sondensatz Targeting-Reste 15 - 1256 des menschlichen ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. OPTIONAL: zusätzliche Hirnschnitten können hyb seinmit einer Sonde, Satz gegen Menschen PPIB ridized und als positive Kontrollen verwendet. </li><li> Die Objektträger in der Folie Box und Inkubation für 2 Stunden. bei 40 o C im Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 1 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 2 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 3 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x warH-Puffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 4 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 5 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 30 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 6-Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 15 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Mix gleichen Volumen BROWN BROWN-1 und-2-Reagenzien (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), fügen ~ 120 &amp; mgr; l-Lösung in jede Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation 10 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und einmal in destilliertem Wasser spülen. HINWEIS: kritische Schritte: die folgenden Schritte sind entscheidend für dieeine optimale axonalen Gegenfärbung zu erhalten, ohne Maskierung der Anwesenheit von RNA-Granulat. </li><li> Vor der Durchführung Gegenfärbung das Vorhandensein von mRNA von Interesse unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen. Bestimmung von Referenzflächen in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von puncta gesamten Kontrastfärbungsverfahren zu überwachen. </li><li> Vorheizen Luxol schnelle Blau-Lösung bei 60 o C. </li><li> Die Objektträger in Luxol schnell blau und Inkubation 30 min bei 60 o C. </li><li> Spülen Sie mehrmals in destilliertem Wasser. </li><li> Dip Slides mehrfach in 0,05% Lithiumcarbonat-Lösung, um die Differenzierung zu starten. </li><li> Dip Slides zweimal in frischem 75% Ethanol. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Überprüfen Hirnschnitten unter einem Hellfeldmikroskop. Beachten Sie, dass grauer und weißer Substanz beginnen sollte, zu unterscheiden und RNA-Granulat noch als dunkelblau / schwarz puncta sichtbar sein. Überprüfen Sie, dass Axone beginnen, wie hellblau Fasern erscheinen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.28 bis 2.2.32. Perform Inkubationen mit Luxol Fast Blue-Lösung in 10 bis 20 min Schritten sorgfältige Überwachung der Gegenfärbung und die Anwesenheit von RNA Granulate. Hinweis: In der Regel wird eine optimale Gegenfärbung in 60 erworben - 90 min (Gesamt Inkubationszeit), aber die Zeit kann verkürzt werden, wenn der Verdacht besteht, dass RNA-Granulat kann durch die Luxol schnell Bläue (siehe Abbildung 2 für Beispiele) maskiert werden kann. </li><li> Folien Kresylviolett Lösung inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser. </li><li> Dip Schlitten 5 bis 10 mal in 70% Ethanol. </li><li> Entwässern Hirnschnitten bis 3 schnelle Änderungen von 100% Ethanol. </li><li> In einer Abzugshaube, klar Hirnschnitten durch Inkubation zweimal in Xylol alternative Clearingstelle für 2 min und ein drittes Mal für 5 Minuten bei RT. </li><li> Berg Hirnschnitten in Xylol-basierte permanentes Fixiermittel. </li><li> Analysieren Sie die Proben unter einem Hellfeldmikroskop. </li></ol></li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. 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D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung eines hochauflösenden ISH Technologie bei der Erkennung von axonally lokalisiert ATF4 mRNA. Diese und frühere veröffentlichte Studien zeigen, dass diese Technik mit Antikörper-basierte Proteinnachweis in Geweben oder sogar ganzen Embryonen 33 kompatibel. Wichtiger ist, es wurde kürzlich zur Detektion von mRNA im Arc Dendriten der hippocampalen Neuronen 34 eingesetzt. Es kann auch mit histologischen Farbstoffe zur Gewebefärbung...

Axonalen mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung ermöglichen Axone auf extrazelluläre Reize in einem zeitlich und räumlich akuten Weise 1 reagieren. Intra-axonale Proteinsynthese wird am besten im Zusammenhang mit der Entwicklung des Nervensystems, wo sie eine entscheidende Rolle bei Wachstumskegel Verhalten 2-8 spielt verstanden Axon Pathfinding 9-11 und retrograde Signalisierungs 12,13. Aber weit weniger ist über die funktionelle Bedeutung der axonalen Proteinsynthese in post-Entwicklungs Neuronen bekannt sind, wenn axonalen mRNA und Ribosom Niveaus stark verringert 14,15. Mature Wirbel Axone haben lange geglaubt, translational inaktiv 16 zu sein. Die jüngsten Studien zeigen, dass lokale Übersetzung wird in reifen Axone unter pathologischen Bedingungen reaktiviert. Zum Beispiel wird eine Untergruppe von mRNAs zu regenerierenden Axonen nach einer Nervenverletzung und intra axonalen Proteinsynthese ist für die korrekte Regeneration dieser Axone 17 erforderlich rekrutiert. Darüber hinaus unsere Gruppe has gezeigt, dass bestimmte mRNAs sind Axone rekrutiert, nachdem lokale Engagement in der Alzheimer-Krankheit Aß-Peptid 1-42, und lokale Übersetzung des Transkriptionsfaktors ATF4 ist verpflichtet, die neurodegenerative Effekte von Aß 1-42 von Axonen zu der neuronalen Soma 18 propagieren. Schließlich Hochdurchsatz-Analysen haben ergeben, dass reife Axone haben ein komplexer und dynamischer als erwartet Transkriptom 18-21, vor allem unter pathologischen Bedingungen. Im Lichte dieser Untersuchungen wurde ein hochempfindliche und spezifische Methode zum Nachweis axonally lokalisierte mRNAs im adulten Nervensystem erforderlich ist. Ein Großteil der Arbeit an mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung in reifen Axone wurde an kultivierten Neuronen durchgeführt. Dies gilt vor allem für die Transkriptom-Analysen, da spezialisierte Kultivierungsverfahren bestehen, dass die Isolierung der Axone von der somato-dendritischen Raum 18-20 ermöglichen. Obwohl solche Studien haben wertvolle Ins gegebenight in die Rolle des lokalen Übersetzung in reifen Axone, die Frage, ob kultivierten Neuronen glaubwürdig die Situation in vivo oder mRNA Rekrutierung ist eine adaptive Reaktion von Axonen zu Kultivierungsbedingungen ist noch offen. Nur wenige Studien haben Hinweise auf mRNA Anwerbung für den Axonen in vivo fällig gestellt. Zum Beispiel hat das Transkript der olfaktorischen Markerprotein in Axonen bei erwachsenen sensorischen Neuronen 22 erfasst wurde. Ein Transgen, das die 3&#39;-UTR von β-Actin mRNA Axonen in den peripheren und zentralen Nervensystems Neuronen in Mäusen transportiert und vor Ort nach dem Entwicklungsperioden 23 übersetzt. Lamin B2 mRNA an retinalen Axonen lokalisiert in Xenopues laevis Kaulquappen und seine Erschöpfung wirkt Axon Wartung nach axonalen Entwicklung 21. Störung des axonalen Transport der mRNA-Codierung für Cytochrom C Oxidase IV verändert Mausverhalten 24. Schließlich wird ATF4 mRNA in ein erwachsener gefundenXON-Fluß von Mäusen und menschlichen Gehirnen im Rahmen von Aß 1-42 induzierte Neurodegeneration 18. Hochdurchsatz-Transkriptom Analysen haben sich als nützlich zu sein, um mRNA-Profilen in isolierten Axone in vitro zu identifizieren, sondern haben ihre Grenzen für die in-vivo-Studien, da im ganzen Gewebe Axone sind nie isoliert gefunden, aber mit neuronalen Zellkörpern, Gliazellen und anderen Zelltypen vermischt. Folglich müssen derartige Analysen mit bildgebenden Verfahren, die die subzelluläre Lokalisation von mRNAs bestätigen kombiniert werden. RNA in situ-Hybridisierung (RNA-ISH) erlaubt die Detektion und Darstellung von spezifischen RNA-Sequenzen, die in Zellen und Geweben. Jedoch waren ursprünglichen RNA ISH Assays nur für die Identifizierung von zahlreicheren RNAs 25, was selten der Fall axonally lokalisierten mRNAs geeignet. In den letzten Jahrzehnten zunehmenden Bemühungen in die Entwicklung neuer Technologien, die den Nachweis der mRNAs ermöglichen an der Einzelmolekülebene gesetzt <sup&gt; 25,26. Zum Beispiel haben Singer und Kollegen ISH Sonden entwickelt, um mRNAs in Einzelzellen zu erfassen, die aus in 5 nicht überlappenden Fluoreszenz-markierten 50-mers (Details siehe 27). Der Hauptunterschied zwischen den oben genannten Techniken und das hier beschrieben wird, ist, daß die später verwendet 20 Doppel Z-Struktur (nicht linear) Sonden, die typischerweise Ziel ~ 1 kb Region der RNA von Interesse sicherzustellen Spezifität und geringem Hintergrundniveaus. Sonden werden dann mit Vorverstärker und Verstärker-Sequenzen, die schließlich fluoreszenzmarkierte oder mit Enzymen, die chromogene Reaktionen ermöglichen konjugiert hybridisiert. Diese Amplifikationsschritte Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen Technologien ISH 28. Hier beschreiben wir zwei Protokolle mit RNAscope kombiniert entweder mit Fluoreszenz Immunzytochemie oder histologische Farbstoffe ermöglicht axonalen Gegenfärbung. Beide Protokolle sind geeignet zur axonalen Lokalisierung ATF4 mRNA in der Erwachsenen mo visualisierenverwenden und das menschliche Gehirn.

<table><tbody><tr><td>custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse &lt;i&gt;Atf4&lt;/i&gt; mRNA (NM_009716)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>probe</td></tr><tr><td>custom probe targeting residues 15-1,256 of the human &lt;i&gt;ATF4&lt;/i&gt; mRNA (NM_001675.2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>-</td><td>probe</td></tr><tr><td>negative control probe-DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td>probe</td></tr><tr><td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td>probe</td></tr><tr><td>positive control probe-human PPIB (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>probe</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; hybridization kit</td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>&lt;i&gt;in situ&lt;/i&gt; hybridization kit</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold mounting&amp;nbsp; medium with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX mounting medium</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNAs werden häufig Wirbel Axonen lokalisiert und ihre lokalen Übersetzung für Axon Wegfindung oder Verzweigung während der Entwicklung und für die Wartung, Reparatur oder Neurodegeneration in postdevelopmental Zeiten erforderlich. Hochdurchsatz-Analysen haben kürzlich ergeben, dass Axone haben ein dynamischer und komplexer Transkriptom als bisher erwartet. Diese Analyse jedoch wurde meist in kultivierten Neuronen, wo Axone aus den somato-dendritischen Fächern isoliert werden getan. Es ist praktisch unmöglich, eine solche Isolation in ganze Gewebe in vivo zu erreichen. So um die Rekrutierung von mRNAs und ihre funktionelle Relevanz in einem ganzen Tier überprüfen, Transkriptom Analysen sollten im Idealfall mit Techniken, die die Visualisierung von mRNAs in situ ermöglichen kombiniert werden. In jüngster Zeit neuartige ISH Technologien, die RNAs in einer Einzelmolekülebene zu erfassen, wurden entwickelt. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse der subzellulären Lokalisierung von mRNADa lokalisierten RNAs werden in der Regel in geringen Mengen gefunden. Hier beschreiben wir zwei Protokolle zur Detektion axonally lokalisierte mRNAs unter Verwendung eines neuen hochempfindlichen RNA ISH Technologie. Wir haben RNAscope ISH mit axonalen Gegenfärbung in Kombination mit Fluoreszenz Immunhistochemie oder histologische Farbstoffe, um die Rekrutierung von ATF4 mRNA um Axone in vivo in der reifen Maus und menschliche Gehirne zu überprüfen.

Eine kurze Zusammenfassung der oben beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Optimale Erkennung von ATF4 mRNA Granulat in cholinergischen Axonen mit wärmeinduzierten Demaskierung Bei der Beurteilung axonale Lokalisation mRNAs ist es kritisch, in der Lage, die Axone zu identifizieren und um niedrige reichlich RNAs zu visualisieren. Die hier beschriebene RNA ISH Technologie ermöglicht die Erkennung von RNAs in einer Einzel...

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Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K Aufrufe.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Serie: Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Genetik

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Biologie

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Probe Hybridization and Signal Amplification in RNA In Situ Hybridization: A Technique for Detecting Specific RNA Sequences in Tissue Sections

Source: Outh-Gauer, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59422" target="_blank">Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a sequential hybridization strategy that involves hybridizing mRNA probes to specific target mRNA. Following probe hybridization, signal amplification is performed to enhance resolution via reduction of signal-to-noise ratio during RNA-CISH of histological samples.

Sondenhybridisierung und Signalamplifikation in RNA in situ Hybridisierung: Eine Technik zum Nachweis spezifischer RNA-Sequenzen in Gewebeschnitten

Source: Outh-Gauer, S. et al. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (2019)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Head and Neck Cancer

Assays & techniques

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Source: Shokry, I. M., et al. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin ...

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app.jove.com/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender

Zusammenfassung

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