This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

<ol>
	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. 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M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. 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D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このレポートでは、軸索ローカライズATF4 mRNAの検出で高解像度のISH技術の使用を記載しています。これらおよび以前発表された研究は、この技術は、組織中の抗体ベースのタンパク質検出、あるいは胚全体33と互換性があることを示しています。重要なことは、最近34海馬ニューロンの樹状突起内のアークのmRNAの検出のために使用されてきました。また、組織染?...

軸索のmRNAの募集とローカル翻訳は、時間的および空間的に急性様式1に細胞外刺激に応答する軸索を可能にします。イントラ軸索タンパク質合成は、最良の軸索は、9-11を経路探索し、逆行12,13シグナリング 、それは成長円錐の動作2-8において重要な役割を果たしている神経発達の文脈で理解されています。軸索のmRNAとリボソームのレベルが大幅に14,15に減少している場合にははるかに少ないが、ポスト発達神経細胞における軸索タンパク質合成の機能的意義について知られています。成熟した脊椎動物の軸索は、長い16翻訳不活性であると考えられてきました。しかし、最近の研究では、地元の翻訳は、病理学的条件の下で成熟した軸索に再活性化されることを示しています。例えば、mRNAのサブセットは、神経損傷およびイントラ軸索タンパク質合成は、これらの軸索17の正確な再生のために必要とされる以下の再生軸索に補充されます。さらに、当社グループヘクタールSは、特定のmRNAがアルツハイマー病ペプチドAβ1-42へのローカルの暴露後に軸索に動員されることを実証し、転写因子ATF4のローカル翻訳は軸索のニューロンの細胞体18へのAβ1-42の神経変性作用を伝播するために必要です。最後に、ハイスループット分析は、成熟した軸索は、特に病理学的条件下で、18-21予想以上に複雑で動的なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの研究に照らして、成体の神経系において軸索局在化するmRNAを検出するための高感度かつ特異的な方法が必要とされています。 成熟した軸索におけるmRNA動員およびローカル翻訳の作業の多くは培養ニューロンに行われています。特殊な培養方法はsomato樹状区画18-20からの軸索の単離を可能にする存在するため、トランスクリプトーム解析のために、これは特にそうです。このような研究は、貴重なインを与えているが、成熟した軸索の現地翻訳の役割にIGHTは、培養神経細胞を忠実に生体内でまたはmRNAの募集は、培養条件への軸索の適応応答である場合は、状況を表しているかどうかの質問はまだ開いています。いくつかの研究は、in vivoで軸索を成熟mRNAの動員の証拠を提供しました。例えば、嗅覚マーカータンパク質をコードする転写物は、成人の感覚ニューロンにおける軸索22で検出されています。 βアクチンのmRNAの3 &#39;UTRを含む導入遺伝子は、マウスにおいて、末梢および中枢神経系ニューロンにおける軸索に輸送され、局所的に発達期間23の後に翻訳されます。ラミンB2 mRNAはXenopuesにおける網膜軸索に局在しているオタマジャクシをアフリカツメガエル、その枯渇は軸索の開発21た後、軸索の維持に影響を与えます。チトクロームCオキシダーゼIVをコードするmRNAの軸索輸送との干渉は、マウスの動作24を変化させます。最後に、ATF4 mRNAが成人aで発見されましたAβ1-42との関連で、マウスとヒトの脳のxonsは、神経変性18を誘発しました。 ハイスループットのトランスクリプトーム分析は、 インビトロで 、単離された軸索中のmRNAプロファイルを同定するために有用であることが証明さが、全体の組織の軸索における以降のインビボ研究は単独で見つからないが、神経細胞体、グリア細胞および他の細胞型と混在んために限界があるています。したがって、このような分析は、mRNAの細胞内局在を確認する画像技術と組み合わせされなければなりません。 in situハイブリダイゼーション （RNA ISH） における RNAは、細胞および組織中の特定のRNA配列の検出および視覚化を可能にします。ただし、元のRNA ISHアッセイは、まれにしか軸索ローカライズされたmRNAのためのケースではありません非常に豊富RNAを25の同定に適していました。努力を増加させる最後の数十年のために、単一分子レベルでのmRNAの検出を可能にする新たな技術の開発に置かれています<suP&gt; 25,26。例えば、歌手らは5蛍光非重複50マーを（詳細は27を参照）、標識されたことからなる、単一細胞でのmRNAを検出するためのISHプローブを開発しました。上記の技術と、ここで説明したものとの主な違いは、後者は20ダブルZ-構造（ないリニア）は、典型的には、関心を保証する特異性と低いバックグラウンドレベルのRNAの約1 kbの領域を標的プローブを使用していることです。プローブは、最終的に蛍光標識または発色反応を可能にする酵素と結合しているプリアンプやアンプの配列とハイブリダイズさせます。これらの増幅ステップは、他のISH技術28に比べて、信号対雑音比を改善します。ここでは、蛍光免疫細胞化学または軸索対比を可能にする組織学的染料のいずれかを組み合わせRNAscopeを使用して2つのプロトコルを記述します。両方のプロトコルは、大人のMOにATF4 mRNAの軸索の局在を可視化するのに適しています使用して、人間の脳。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNAはしばしば、脊椎動物軸索に局在していると、地元の翻訳は、軸索の経路探索やpostdevelopmental期間中、開発中の分岐やメンテナンスのため、修理または神経変性のために必要とされます。ハイスループット分析は最近、軸索は、以前に予想以上にダイナミックで複雑なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの分析は、しかし、主に軸索はsomato樹状コンパートメントから単離することができる培養神経細胞で行われてきました。これは、in vivoでの組織全体でそのような分離を達成することは事実上不可能です。したがって、mRNAの採用や、動物全体におけるそれらの機能的関連性を検証するために、トランスクリプトーム解析は、理想的には、 その場でのmRNAの可視化を可能にする技術と組み合わせる必要があります。最近では、単一分子レベルでのRNAを検出する新規なISH技術が開発されています。 mRNAの細胞内局在を分析する際に特に重要です、ローカライズされたRNAは、典型的には、低レベルで見出されているからです。ここでは、新規の超RNA ISH技術を使用して、軸索に局在するmRNAの検出のための2つのプロトコルを記述します。我々は、成熟したマウスとヒトの脳におけるin vivoでの軸索にATF4 mRNAの募集を検証するために、蛍光免疫組織化学または組織学的染料を使用して軸索対比でRNAscope ISHを組み合わせています。

上記の手順の概要は図1に示されています。 ATF4 mRNAの最適な検出は、熱誘導アンマスキングを使用して、コリン作動性軸索に顆粒 mRNAの軸索の局在を評価する際には、軸索を識別することができるように、低豊富なRNAを可視化できることが重要です。ここで説明するRNA ISH技術は、単一分子分解能でのRNAの検出を可能に?...

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Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K ビュー.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.