We thank Sergio G&#243;mez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.

Hayvan deneyleri onaylanmış protokollere ve Alman hayvan koruma yasasının yönergeleri izleyerek göre gerçekleştirilmiştir. Hayvan deneyleri yürüten tüm personel kategori B veya Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu C&#39;ye göre eğitim programları geçti. Ters Genetik tarafından Rekombinant Canlı Atenüe Grip Aşıları 1. Nesil NOT: ters genetik rekombinant influenza virüslerinin nesil için detaylı bir protokol önceki çalışmalarda 5 tarafından açıklanan ve bu raporun kapsamı dışında olmuştur. Kısaca, soğuk adapte influenza aşıları (CAV) kurtarma biyogüvenlik seviyesinin altında bir biyogüvenlik sınıf II kabini içinde 2 (BSL2) çevreleme yapılması ve aşağıda ayrıntılı adımları içerir edilir. transfeksiyon ve enfeksiyon protokolü izler Martinez-Sobrido ve ark. 5. <ol><li> Bir reassortant soğuk adapte influenza üretarka plan olarak soğuğa uyarlanmış suş A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), hem de hemaglütinin (HA) ve bir tadil edilmiş nöraminidaz (NA) A / PR / 8/34 (H1N1) suşuna ait (kullanarak aşı Şekil 1A). NA geni modifikasyon tavuk ovalbümin (OVA) -türevi peptid SIINFEKL&#39;yi (Şekil 1B) kodlayan kısa bir cDNA dizisi protein sap (kalıntılar 65-72), bir korunmuş sekans bir PCR-esaslı yerine konmalıdır. SIINFEKL peptiti C57BL / 6 farelerine 12 tepkisini I-kısıtlamalı lH-2b MHC sınıf bağlamında son derece immünodominant peptittir. </li><li> % 1 penisilin / streptomisin (P / E) ile desteklenmiş DMEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 6 oyuklu plakalar içerisinde oyuk başına Levha 10 6 293T hücreleri. </li><li> Plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın: Ekle NA kodlayan PB2, PB1, PA, NP, E, NS influenza A / Ann Arbor / 6/60 soybaşı için cDNA ve plasmidlerin 1 ug kodlayan plazmidlerin her biri 1 ug -SIINFEKL veİnfluenza A / PR / 8/34 HA. (/ Oyuk 100 ul bir son hacim için 15 ul) OptiMEM önceden ısıtılmış ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile transfeksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> De / transfeksiyon karışımı 100 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de 16 saat% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> 5 saat CO 2 33 ° C&#39;de DMEM% 0.3 BSA% 1 P / E hücre ortamı değiştirmek ve% 5. </li><li> L-1-tosilamid-2-feniletil klorometil keton (TPCK-tripsin) ile muamele büyükbaş hayvan pankreasından tripsin 1 ug / ml ihtiva eden DMSO içerisinde 10 6 influenza permisif MDCK hücreleri ekleyin. 33 ° C&#39;de 3 gün% 5 CO2 - 2, 293T-MDCK ko-kültürler koruyun. </li><li> 5 dakika boyunca 260 x g&#39;de santrifüj ile MDCK 293T hücresi ko-kültürler süpernatantlar ve net toplayın. </li><li> Steril şartlarda 10 gün eski tavuk embriyonlu yumurta - 9 aşılamak. Martinez-Sobrido ve arkadaşları tarafından gösterildiği gibi, bunun için, yumurta kabuğu üzerine bir delik açın. 5. </li><li> Yumurta kabuğu zekâ Kapakh bir pamuklu çubuk kullanarak ve 33 ° C&#39;de 3 gün boyunca aşılanmış tavuk yumurtası inkübe balmumu erimiş. </li><li> Enfekte embriyolu yumurtaların alantoik akışkan hasat:% 70 etanol ile yumurta kabuklarını yıkayın. Çok yavaşça üst kısmında çatlak ve steril forseps kullanarak allantoik membran kaldırmak bir ile yumurta açın. (- 10 ml, tipik olarak 6) mümkün olduğu kadar çok sıvıyı toplamak için bir 10 ml&#39;lik bir pipet kullanın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 260 x g&#39;de santrifüj ve yeni tüplere alantoik temizlenmiş sıvı transferi. </li></ol> 2. İzleme Aşı özgü Bağışıklık <ol><li> Peptid taşıyan dendritik hücrelerin İzleme (DC) <ol><li> Fare aşılama için, hassas buharlaştırıcı kullanılarak oksijen içinde% 5 izofluran ile fareler uyutmak. Fare burun doğrudan damlacıkları yoluyla SIINFEKL peptiti eksprese eden aşı 10 3 plak oluşturucu birim (pfu) ihtiva eden PBS içinde 50 ul yönetmek için bir 200 ul bir pipet kullanın. </li><li> Post-aşılama, euthaniz Üç günizofluran anestezi ile E fareler, servikal dislokasyon ile takip etti. </li><li> Sadece forseps ile göğüs kafesi altındaki orta hatta fare cildi kaldırın ve makas ile deri yoluyla küçük bir kesi kesti. 5 cm uzunluğunda her iki ucundan yanal orta hattan sonra, baş ve kuyruk hem doğru deri yoluyla iki 2 cm&#39;lik kesiler kesti - kesi açısından, 3 yapmak. Peel geri cilt periton ve toraks boşlukları ortaya çıkarmak için. Dikkatle toraks maruz periton çevreleyen zarların kesti. </li><li> Mediasten DIAFRAGMA ve kafes kaburga alt kesti erişmek için. Biraz dorsal ve ventral trakea kenarına yakın, brakiyosefalik arterin medial bitişik timus yanal bitişik, bulun ve 2 mediastinal lenf düğümleri (mLNs) çıkarın. </li><li> MLNs kavisli bir forseps kullanmak hasat. Lenf düğümleri altına forseps yerleştirin ve yavaşça onları yukarı çekin. DMEM 1 ml ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka içinde, lenf düğümleri yerleştirin ve bir bağlant kaldırmave veya yağ dokusu düğümü çevreleyen. <ol><li> 1 ml &#39;lik şırıngaya iliştirilmiş iki 26 G iğne ile iyice her bir örnek alay. Diğer iğne ile lenf nodu açık kırarak lenf nodu alay için, bir iğne ile basılı tutun. Bu doğru yapıldığında, lenf düğümünden patlama konsantre hücreleri kolayca medyada görülmektedir. Tek hücre süspansiyonları elde etmek için bir 70 um naylon filtre vasıtasıyla tüm doku materyali geçirin. </li></ol></li><li> Soğutuculu santrifüj 260 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj tek hücre süspansiyonları. Kırmızı kan hücrelerinin lize kırmızı kan hücresi Parçalama (rbcL) Tamponu 2 ml hücre pelletini. Liziz oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ilerlemesine izin verir. </li><li> Buz soğukluğunda PBS 2 ml santrifüj ve hücre yeniden süspanse ile rbcL tamponu nötralize. </li><li> Levha hücreler 100 ul nihai hacim içinde 10 7 hücre / ml bir konsantrasyonda 96 oyuklu plakaları U-şekillidir. </li><li> Analiz, blok hücre Fc-reseptörleri akış sitometrisi kullanılarakBuz üzerinde 15 dakika boyunca 10 6 hücre başına anti-fare CD16 / CD32 antikorlarının 1 ug. </li><li> Santrifüj plakalar ve plaka Flicking tarafından süpernatantlar atın. Tercih edilen yüzey antikoru kombinasyonu ile, ayrı ayrı kuyuların inkübe edin. Tipik haliyle, lenf düğümleri dendritik hücrelerin saptanması için, antikor kokteyli içermelidir: 0.25, anti-CD11c ug, CD11b, 0.25 ug, MHC sınıf II, 0.5 ug, CD103, 0.25 ug ila 100 arasında bir nihai hacim içinde CD8α 0.15 ug ul. </li><li> Negatif gating, anti-CD3, CD19, NK1.1 veya nesilli kokteyli (Şekil 2A), 0.25 ug ekleyin. Alternatif yolluk stratejileri yanı sıra birden fazla floresan boyalar uygun tazminat protokolleri immünolojik Genom Projesi&#39;nin web sitesinde bulunabilir. Tercih edilen yüzey belirteçleri ek olarak, kokteyl SIINFEKL bağlı lH-2K B&#39;ye karşı bir antikorun 1 ug ekleyin. Bu piyasada mevcut antikor DC&#39;lerin i görselleştirme sağlayacakSIINFEKL peptid MHC sınıf I yüzey bağlı olduğu N </li><li> Buz üzerinde 30 dakika boyunca yüzey antikorlar ile inkübe hücreleri. Işıktan plaka koruyun. 260 x g&#39;de santrifüjleyin plakalar 5 dakika boyunca PBS ile iki kez 2 ml ile yıkanır. Analiz için sitometri tüpleri akış hücreleri aktarın. </li></ol></li><li> Aşı-spesifik T hücresi çoğalmasının değerlendirilmesi <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen TCR-transgenik farelerden (OT-I fare) donör T hücrelerinin elde edilir (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) içinde üretilen tüm CD8 T hücreleri ve SIINFEKL peptiti için spesifik olan. Servikal dislokasyon izofluran anestezi fareler öldürülür. Karın boşluğunda bir kesi yaparak Hasat dalak. DMEM / dalak 2 ml dalak / s yerleştirin ve bağ ve yağ doku kaldırmak. </li><li> 2.1.2 ve 2.1.3 tarif edilen prosedür takip edilerek dalak tek hücre süspansiyonları oluşturmak. </li><li> Ayrıca T hücreleri üzerindeki tek bir hücre süspansiyonu zenginleştirmek için, manyetik boncuk ayırma protokolleri uygulamakpozitif veya negatif seleksiyon prosedürleri 12 kullanarak. Alıcı hücrelerinden donör ayırt donör T hücreleri CD45.2 12 ifade ederken, örneğin alıcı fareler lökosit işaretleyici CD45.1 ifade böylece konjenik fareler kullanın. </li><li> T hücreleri etiketlemek için, 5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir optimum hücre yoğunluğunda carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) 5 uM ihtiva eden 1 ml PBS içinde inkübe. Işığa maruz korunmaktadır, 37 ° C&#39;de 20 dakika süreyle inkübe hücreleri. İnkübasyondan sonra, 3 ml cenin sığır serumu (FBS) içinde, 5 dakika, ıskarta yüzer, ve tekrar süspansiyon hücreleri için 260 x g&#39;de santrifüj hücreleri CFSE etkisiz hale getirir. </li><li> PBS yeterli hacmi içinde, 10 dakika ve tekrar süspansiyon içinde 260 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri çözeltisinin 100 ul 2 x 10 6 hücre içerir, böylece. 2 x 10 6 hücre / retroorbital sinüs enjeksiyon yoluyla 13 fare ile alıcı konjenik fareler infüze. </li><li> Günler 3, 4 ve 5 Direk- de alıcı fareler Euthanizeservikal dislokasyon tarafından takip Izofluran anestezi kullanılarak aşılama. Lenf düğümleri hasat ve 2.1.2-2.1.5 belirtildiği üzere akış sitometrisi için tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. </li><li> Ihtiva eden bir antikor kokteyli 100 ul tek hücre süspansiyonları boyama ile donör hücrelerin belirlenmesi: anti-fare CD3, CD4 ve CD8 antikorları, 0.25 ug; Anti-fare CD45.1 ya CD45.2 antikoru (donör hücrelerin fenotipi bağlı olarak) 0.5 ug. CFSE 12 (Şekil 2B) seyreltme profilini belirlemek için, açık (FITC) akış sitometresi FL-1 bir kanal bırakın. </li></ol></li></ol> Gen-özgü aşı Yanıt incelemek için 3. Kimerik fareler Not: DTR tabanlı fare modelleri kullanılarak rekabetçi bir kemik iliği kimeralar üretilmesi aşılara bağışıklık yanıtı sırasında hücreye özel fonksiyonların ayırt edilmesini sağlar. Burada hangi kombinasyonu ile donör c DTR-ifade ek bir strateji göstermekknockout farelerde izni alınan hücrelerle arşın spesifik hücre bölümlerinde bağışıklık sırasında gen özel fonksiyonları incelemek için. Örnekte Langerin + CD103 + DCler Toll-benzeri reseptör 3 (TLR3) spesifik delesyonu ile fareleri üretmek. <ol><li> Kemik iliği donör hücrelerin hazırlanması <ol><li> Bir biyogüvenlik düzeyi II kabinin altında çalışmak. Münhasıran Otoklavlanmış araçları kullanarak kirlenmesini önlemek. </li><li> , Kemik iliği kimerik fareler üretmek alıcı olarak konjenik CD45.1 + C57BL / 6 dişi fareleri kullanabilir ve TLR3 tarafından kullanmak için - / -, Langerin- DTR / EGFP veya wt fareler bağışçılar olarak CD45.2 + dile getirdi. Konjenik donör ve alıcı fareler kullanılarak akış sitometrisi ile, verici ve alıcı hücrelerin farklılaşmasını sağlar ve melezleme değerlendirilmesini mümkün kılar. </li><li> Donör kemik iliği hücreleri elde servikal dislokasyon tarafından takip izofluran anestezi ile donör fareler euthanize. Keskin makas ayak bilekleri civarında kesiler yerine birlikte m kiouse kas maruz kalmaktadır. </li><li> O bacak kasları görünür, böylece kullanılması künt forseps kalça doğru ayak bileği hafifçe fare deri ve kürk çekin. </li><li> Keskin bir makas ile kalça hizasında ve femur başının üstünde fare bacaklarını kesti. </li><li> Bir petri tabağına ve buz üzerinde bacakları yerleştirin. Hızlı çalışın ve kemikleri açığa çıkarmak için tüm kasları kaldırın. </li><li> Ayrı femur ve tibia. Mümkün olan bakterileri yok ve serum içermeyen DMEM 5 ml ihtiva eden bir petri kabı hemen yerleştirmek için 5 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisi içinde kemik yerleştirin. Kesme kemik DMEM içine kemik iliği keskin bir makas kullanarak ve floş biter. 5 ml şırıngaya takılı 26 G&#39;lik bir iğne sokarak kemik içine, bu nedenle DMEM hizada 1 ml yapmak için. Kemikler yıkamadan sonra beyaz (boş) bakmak emin olun. </li><li> DMEM, 10 ml donör farelerden gelen tüm kemik iliği hücreleri toplamak. 70 mikron hücre süzgecinden geçirerek hasat kemik iliği hücrelerinden tek hücre süspansiyonları oluşturun. </li><li> Clsoğutuculu santrifüj içinde 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 260 x g&#39;de santrifüj ile kemik iliği hücrelerinin kulak tek hücre süspansiyonları. 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücre peleti. 2.1.3 ve 2.1.4 de açıklandığı gibi rbcL çözümünü kullanarak kırmızı kan hücreleri İncelten. </li><li> Hemasitometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak, kemik iliği hücreleri sayın. Tripan mavisi 13 üzerinden ölü hücrelerin belirlenmesi ile hücre canlılığını değerlendirmek. En uygun olarak, en azından% 80 bir canlılığı tek hayvan verimi yaklaşık 3 x 10 7, beyaz kan hücreleri / fare. </li><li> - / - Veya ağırlıkça donör hücrelerin toplam kemik iliği kimeralar durumunda, TLR 3 hazırlar. 100 ul PBS içinde 2 x 10 6 hücre transplantasyonu için kullanılacağından uygun hücre konsantrasyonu 2 x 10 7 hücre / ml &#39;dir. Derhal kullanılmadığı takdirde,% 10 DMSO ile yavaş dondurma teknikleri ve FBS kullanılarak -80 ° C&#39;de donör hücreleri korur. Karışık kimerik model için, Langerin- DTR-donör hücreleri ve mix TLR3 - / - </sup&gt; 75:25 oranında donör hücreleri. Kontrol fareleri üretmek için kemik iliği hücreleri wt: 25 Langerin- DTR: 75 bir karışımını hazırlayın. </li></ol></li><li> Fare ışınlama ve nakli <ol><li> Bir Sezyum-137 kaynak irradiator yaş 8 hafta - 6 arası dişi farelerin ışın tedavisi. Farelere ayrı 550 rad 4 saat iki doz verin. Bölünmüş ışınlama akut karaciğer toksisitesini azaltır ve dolayısıyla ışınlama protokol gereği fare ölümcül azaltır. </li><li> Işık verilmesinden sonra, iki hafta içinde antibiyotik ile tedavi edilen fareler tutun. Baytril / kg 5 mg - 2.5 içme suyu ile antibiyotik verin. </li><li> 2 - İkinci ışınlama 4 saat sonra damar içine vericinin kemik iliği hücreleri ile nakil fareler. 2 x 10 6 hücre ihtiva eden 100 ul PBS maksimum hacmi kullanılarak retro-orbital sinüs enjeksiyonu 13 üzerinden ve izofluran anestezi altında donör hücrelerin enjeksiyonu gerçekleştirin. </li><li> Dört hafta naklinden sonra, 100 numunesinde bütünleşmesini değerlendirilmesien az iki renge okuyabilecek bir makine kullanılarak akış sitometrisi ile periferal kan ul. Ticari olarak temin edilebilir floresan etiketli CD45.1 ve 1/100 ve 1/200 arasındaki seyreltileri kullanılarak CD45.2 anti-fare antikorları kullanarak, verici ve radyo dirençli alıcı hücrelere ayırt etmek. Donör hücrelerin optimal melezleme periferal kandaki toplam hematopoietik hücrelerin en az% 80&#39;i olmalıdır. </li></ol></li><li> Aşılama ve hedeflenen tükenmesi <ol><li> Burun yoluyla rekombinant canlı zayıflatılmış grip aşısı ile aşılanmalıdır fareler. Fare aşılama için, hassas buharlaştırıcı kullanılarak oksijen içinde% 5 izofluran ile fareler uyutmak. Aşının 10 3 plak oluşturucu birim (pfu) ihtiva eden PBS 50 ul yönetmek için bir 200 ul bir pipet kullanın. </li><li> Nihai fare modeli oluşturmak için, burun içinden PBS 50 ul seyreltilmiş DT 50 ng fare tedavi. 3.3.1 anlatıldığı gibi anestezi farelerin burun delikleri doğrudan damla damla DT yönetin. Sağlıgı migün 2 sonrası aşılama (Şekil 3B) kadar aşılama gün önce -2 tedaviye başlayan günlük dozlarda ce. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understand+memory,+design+better+vaccines.">Understand memory, design better vaccines.</a> Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).</li><li>Gaucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+vaccine+induces+integrated+multilineage+and+polyfunctional+immune+responses.">Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses.</a> J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).</li><li>Querec, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+approach+predicts+immunogenicity+of+the+yellow+fever+vaccine+in+humans.">Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans.</a> Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Mart&#237;nez-Sobrido, L., Garc&#237;a-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+influenza+virus+from+plasmid+DNA.">Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA.</a> J Vis Exp. 3, (2010).</li><li>Haniffa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tissues+Contain+CD141hi+Cross-Presenting+Dendritic+Cells+with+Functional+Homology+to+Mouse+CD103++Nonlymphoid+Dendritic+Cells.">Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells.</a> Immunity. 37, 60-73 (2012).</li><li>Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+functional+specialization+of+dendritic+cells+in+human+and+mouse.">Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse.</a> Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8++T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens.">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17, 211-220 (2011).</li><li>Lahl, K., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+FoxP3++Tregs+using+the+DEREG+mouse+model.">In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model.</a> Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).</li><li>Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+macrophages+reveals+distinct,+opposing+roles+during+liver+injury+and+repair.">Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).</li><li>Meredith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+zinc+finger+transcription+factor+zDC.">Expression of the zinc finger transcription factor zDC.</a> J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).</li><li>Gir&#243;n, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+Polyinosinic-Polycytidylic+Acid+Improves+Protection+Elicited+by+Replicating+Influenza+Vaccines+via+Enhanced+Dendritic+Cell+Function+and+T+Cell+Immunity.">Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity.</a> J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+animal+cells:+a+manual+of+basic+technique.">Culture of animal cells: a manual of basic technique.</a> bib.usb.ve. , (1983).</li><li>Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+immunity+and+vaccination+strategies.+Comparison+of+the+immune+response+to+inactivated+and+live,+attenuated+influenza+vaccines.">Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines.</a> Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).</li><li>Gowdy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+CD8(+)+T+cell+immunity+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+leads+to+persistent+and+severe+respiratory+viral+infection.">Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection.</a> Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada, aşıyla indüklenen bağışıklık fizyolojik ve moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir kadar karşıt genetik ve kimerik fare modelleri açıklanmaktadır. Grip ters genetik birçok laboratuvarda kurulan ve grip patogenezi, çoğaltma ve iletim 17 anlamada bir baş rol oynamıştır. Bizim protokolde önemli bir nokta, yabancı epitopları ifade soğuk uyarlanmış influenza aşılarının kurtarma olduğunu. Nöraminidaz sap içinde kısa cDNA&#39;ları sokulması st...

hastalığın yokluğunda immünolojik bellek üretimi etkili bir aşı 1 fizyolojik temelidir. Son zamanlarda, sistem biyolojisi-bazlı yaklaşımlar, sarı humma aşı olarak başarılı bir şekilde aşılar, sırayla, kurşun antijen aktivasyonunu multilineage doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin ve dendritik hücreler (DC), birkaç alt takımından aktivasyon kuvvetli bir uyarımının neden olduğunu ortaya koymuştur Belirli T hücreleri 2,3. DH&#39;ler, antijene özel T hücrelerinin naif 4 aktive etme kabiliyetine sahip, sadece bağışık hücre popülasyonu olduğu için, aşılama sırasında fonksiyonunun çalışması aşılara bağışıklık tepkilerini anlamak ve zorlu patojenlere karşı gelecek stratejilerini tasarımı için çok önemlidir. Aşılara bağışıklık tepkilerinin sırasında farklı DCler alt kümelerinin izleme sağlayan bir sistem sağlamaktır, bu nedenle lenfoid dokulara DC göç doğru bir kinetik oluşturulması için arzu edilebilir, ve olurAşı özgü adaptif bağışıklık başlatılmasından sorumlu fizyolojik mekanizmaların içgörü. Genetik temelli Ters yaklaşımlar, olasılık modifiye oluşturmak için bu amaçla deneysel kullanılabilecek canlı zayıflatılmış aşılar sunuyoruz. İnfluenza araştırma uygulanması için, plazmid bazlı ters genetik yaygın LAIVs de dahil olmak üzere rekombinant influenza suşları oluşturmak için kullanılmıştır. Standart protokolleri (rekombinant influenza virüsleri gibi Madin-Darby köpek böbrek gibi hoşgörülü sistemde yükseltilmesi yanı sıra sekiz grip viral segmentleri içeren ambisens plazmid ile son derece transfectable hücre hatları (pozitif ve negatif anlamda RNA hem üreten) multi-transfeksiyonunu gerektiren kurtarmak için MDCK) hücreleri ve / veya tavuk embriyo haline getirilmiş yumurtalar 5. Bununla birlikte, aşı, bağışıklık mekanizmaları incelemek amacıyla moleküler araçlar üretmek için ters genetik uygulama keşfedilmemiştir. nesilDC&#39;lerle dahil bağışıklık hücre alt, spesifik tükenmesi izin yeni fare modellerinin, aşı tetiklenen koruma altında yatan temel bağışıklık mekanizmaları anlamak için yeni olanaklar açtı. farelerde ve insanlarda DC alt fonksiyonları arasında karşılaştırması büyük ölçüde, fare ve insan DH&#39;leri güçlü, homolog işlevsel bu bulgular 6,7 olan fare modellerinin geliştirilmesi kararlı halde DC&#39;lerin belirli bir tükenmesi izin düşündürmektedir ortaya koymuştur ve iltihaplı koşullar sırasında, insanlarda DC tepkilerinin fizyolojisini anlamak için hizmet edebilir. Son yıllarda, fare modelleri bir kaç İlgi 8,9 arasında bir genin promotör bölgesinin kontrolü altında simian difteri toksini (DT) reseptörü (DTR) eksprese eden transgenler taşıyan üretilmiştir. Fare dokuları doğal DTR ifade olmadığından, bu modeller DT ile fare inokülasyon üzerine ilgi hedeflenen genini taşıyan hücre alt koşullu tükenmesi izin verir. Böylece, abilifizyolojik işlemler sırasında in vivo özel DCler ve diğer lökosit tüketmek ty, büyük DTR-tabanlı ro gelişmesi ile geliştirilmiştir. Bu transgenik fare modelleri, immün sistemin ontogenezini anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır ancak bununla birlikte, aşı gelişimi için uygulama pek test edilmiştir. Burada, grip ters genetik ve DTR-temelli rekabet kemik iliği kimeralar birleştirerek, biz in vivo aşılara bağışıklık yanıtları sırasında aşı bağışıklık yanı sıra bireysel gen fonksiyonu kinetiğini incelemek için bir yöntem öneriyoruz. zorlu bulaşıcı hastalıklara karşı yeni aşıların klinik öncesi değerlendirilmesi için bu teknolojinin uygulama aşı tasarımı rasyonalize etmek ve in vivo aşı adayları test etmeye yardımcı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti MEM</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>p11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonated eggs</td>
			<td>Valo biomedia Gmbh</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Nylon Filters</td>
			<td>Greiner-Biorad</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0453-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0081-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&#949; (145-2611)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0041-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Molecular probes&#160;</td>
			<td>O23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria Toxin (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-TPCK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo cell analysis software 9.5</td>
			<td>Flowjo inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automatic Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal administration of recombinant influenza vaccines in chimeric mouse models to study mucosal immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

Rekombinant canlı-zayıflatılmış influenza aşılarının üretilmesi iki yönlü promoterlerin 5 kontrolü altında grip virüsü sekiz segmentleri kodlayan plasmidlerin transfeksiyonu ile elde edilebilir. Soğuk adapte influenza aşısı genellikle soğuğa uyarlanmış suşu olarak hem de tercih edilen influenza suşunun HA ve NA (örneğin, H1N1) (Şekil 1A) altı segmentleri içerir. Soğuk adaptasyon prensibi 33 ° C, farelerde ve insanlarda 14 üst solunum yolla...

Watch this Scientific Journal Video about Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity at JoVE.com

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

intranasal-administration-recombinant-influenza-vaccines-chimeric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Görüntüleme.  Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology. There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Video: Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

Aşılar Fare yanıtlar içinde Nazofaringeal ilişkili lenforetiküler Doku (NALT) Rolü incelenmesi

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...