Yazarlar grip ters genetik teknikler ve plazmid gelişimi için Adolfo Garcia Sastre ve Peter Palese laboratuvarlar geçmişteki ve şimdiki üyelerine teşekkür etmek istiyorum. AG-S laboratuarlar Araştırma Crip, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID tarafından finanse edilen Merkezi (HHSN266200700010C) ve NIAD hibe R01AI046954, U01AI070469 ve P01AI058113 tarafından kısmen finanse edilmektedir. LM-S laboratuvar Araştırma kısmen NIAID hibe RO1AI077719 tarafından finanse edilmektedir.

1. İnfluenza virüs kurtarma transfeksiyon İnfluenza A virüsü negatif iplikli RNA zarflı virüs Orthomyxoviridae ailesine aittir. Influenza A virüs genomunun en az 11 viral proteinler (Şekil 1) 4, kodlamak negatif polarite sekiz farklı RNA genleri oluşur. (8 grip A/PR/8/34 viral segmentleri içeren ambisense plazmid (pDZ) kullanarak en sık rastlanan laboratuvar suşu, grip A/PR/8/34, 5 kurtarma, bu raporda, durulacak Şekil 2). Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin kurtarılması için, biz her rekombinant virüs başına 3 bağımsız transfections tavsiye ederiz. Birden fazla rekombinant virüs kurtarma girişimi ise, kurtarılan virüslerin sayısı accordantly aşağıdaki adımları ölçekli. 6-iyi-plakalar için aşağıdaki transfeksiyon ve enfeksiyon protokolü ile kurulmuştur. Protokol şematik Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) karışımı: 250 ul OptiMEM medya ve LPF2000 başına transfeksiyon 6-8 ul hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) 5-10 dakika inkübe edin. Bu arada, plazmid transfeksiyon karışımı hazırlar. </li><li> Plazmid transfeksiyon karışımı: OptiMEM medya 50 ul plazmid transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Biz genellikle 1 mg kurtarma ortalama plazmid her influenza DNA kullanın. 50 ul OptiMEM medya içeren bir tüp, 1 pDZ plazmid ul (1 mcg / ml) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, K, ve NS ekleyin. </li><li> OptiMEM-LPF2000 DNA plazmid karışımı: grip DNA plazmid transfeksiyon karışımı (adım 1.2) içine adım 1.1 &#39;den 250 ul ekleyin. Bu karışımı 20-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bu arada, transfeksiyon için 293T ve MDCK hücre süspansiyonları hazırlayın. </li><li> 293T/MDCK ko-kültür hazırlanması: Başlamadan önce, 37 PBS 1X, DMEM% 10 FBS% 1 PS medya ve EDTA-tripsin karışımı getirmek ° C Hücrelerin yoğunluğu% 80-90 izdiham transfeksiyon günü olmalıdır. Genellikle, 293T ve MDCK hücreleri konfluent 100 mm çanak biri konfluent 100 mm çanak kurtarır 10-12 için kullanılan olabilir. Biz de her hücre 250 ul kullanmaya devam etmektedir. Her iki hücre hatları DMEM% 10 FBS% 1 PS 3 ml toplam yeniden süspanse olacaktır. <ul><li> Dikkatlice DMEM% 10 FBS% 1 PS 10 ml, 15 ml santrifüj tüpüne her hücre hattı tekrar süspansiyon haline getirin. MDCK hücreleri için 293T hücreleri ve bir tüp bir tüp var. </li><li> DMEM% 10 FBS% 1 PS 3 ml 293T hücrelerinin yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse zaman, bu hücrelerin tekrar süspansiyon MDCK hücreleri 3 ml sunmak. Bu ko-kültür için kullanılacak 293T ve MDCK hücrelerin karışımı verecektir. </li><li> De başına 293T/MDCK hücreleri (10-12 Haziran iyi kuyuları) 250 ul ekleyin. </li></ul></li><li> 20-30 dakika RT inkübasyon (adım 1.3) sonra, DMEM% 10 FBS% 1 PS 1 ml OptiMEM-LPF2000-influenza DNA plazmid karışımı ekleyin. </li><li> 250 ul 293T/MDCK hücrelerinin (adım 1.4) ile kuyuların içine 1.3 ml (1.5 adım) ekleyin. </li><li> 37 ° 6-iyi-plate yavaşça sallamak ve inkübatör (ON) gecede transfeksiyon inkübe izin ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Ertesi gün, yaklaşık 16-24 saat sonrası transfeksiyon, transfeksiyon medya ve 48 saat için 1 mcg / ml TPCK-tripsin içeren PS DMEM% 0.3 BA% 1 transfekte hücreler kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Değişen medya 48 saat sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine transfekte hücrelerden süpernatantı aktarın. </li><li> 1-2 dakika, 13.000 rpm mikrosantrifüj doku kültürü süpernatant Santrifüj. </li><li> 6-kuyu levhalar (bir gün önce kaplama) veya 10 günlük civciv adım 1.10 &#39;dan santrifüj doku kültürü süpernatantlar 200 ul embriyolu yumurta taze MDCK hücreleri enfekte. 2-3 gün boyunca 37 ° hücreleri ve / veya yumurta ° C&#39;de inkübe edin. <ol><li> Enfeksiyon: 10 günlük civciv embriyolu yumurta tavuk embriyolu yumurta bulaştırmak için tüm işlemler, steril koşullar altında yapılmaktadır. <ol><li> Hava kesesi arasındaki arayüz ve allantoik boşluğuna görmek için bir ışık candling kutusunu kullanarak 10 günlük yumurta Mum. Arayüz sınırında bir kalem işareti olun. </li><li> 5 ml şırınga iğne ile bir delik kabuğu olun. </li><li> 1 ml şırınga ile, her adım 1.10 &#39;dan doku kültürü süpernatantlar 200 ul yumurta bozar. </li><li> Bir pamuklu çubukla kullanarak erimiş balmumu ile kabuğu delik kapağı. </li><li> 2-3 gün, 37οC enfekte yumurta inkübe edin. </li></ol></li><li> Enfeksiyon: taze MDCK hücreleri geçit önceki gün öncesi, ortak kültürlerin 293T/MDCK doku kültürü süpernatantMDCK hücreleri ile pare 6-plaka yemekleri ertesi gün% 80-90 izdiham ulaşmak için. Genellikle, bir konfluent 100 mm doku kültürü plakası 6-8 kuyu ayrılabilir. Hücreleri yıkayın, iki kez PBS 1X trypsinize ve 6-iyi plakaları hazırlamak. Hücrelerin üniformalı bir dağılıma sahip olduğu için, yavaşça elle plakalar sallayın. Kültür hücreler, ON, 37 ° C inkübatör,% 5 CO 2. Enfeksiyon önce, bir tek tabaka onaylamak için hücrelerin mikroskop altında kontrol edin; ardından, enfeksiyon ile devam edin: <ul><li> 1 ml PBS 1X, iki kez, hücre yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle santrifüje doku kültürü süpernatantlar 200 ul bulaştırabilir. Hücreler kuru izin vermeyin. 6-iyi-plate her 10 dakikada Rock. </li><li> 1 saat sonra viral emilmesi, MDCK hücreleri enfeksiyon medyayı çıkartın ve DMEM 0.3% BA% 1, 1 mcg / ml TPCK-tripsin içeren PS 2 ml ekleyin. </li><li> 48-72 saat geçtikten sonra, sitopatik etki (CPE) MDCK enfekte olmuş hücreleri gözlenen transfeksiyon verimlilik ve virüs yükü bağlı. CPE başarılı bir kurtarma göstermektedir. Ancak, bir HA assay (2. bölüm) hala doku kültürü Süpernatantları virüsün varlığını tespit etmek için yapılan olmalıdır. </li></ul></li></ol></li><li> Hasat allantoik sıvı enfekte tavuk embriyolu yumurta: allantoik sıvı enfekte yumurta hasat Tüm işlemler steril koşullar altında yapılmaktadır. Allantoik sıvı yaklaşık 8-12 ml, her 10 günlük eski enfekte yumurta hasat edilebilir. Allantoik sıvı hasat önce az 2 saat, 4 tavuk yumurtası (veya ON) inkübe ° C tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını. <ul><li> Steril koşullar kurmak için% 70 etanol ile yumurta kabuklarını yıkayın. </li><li> Bir kaşık ile dokunarak hava boşluğuna üzerine, dikkatlice, yumurta açın. Forseps yardımı ile kırık kabuğu çıkarın. </li><li> 1 ml iğne ile yumurta sarısı kırılma olmadan allantoik membranından çıkarın. </li><li> Allantoik sıvı içine 10 ml lik bir pipet rehber olarak bir spatula ile tavuk embriyo sabitleyin. Yumurta sarısı, herhangi bir kırılma ya da toplama olmayan bir buz kovası buz 15 ml santrifüj tüpü içine mümkün olduğu kadar çok allantoik sıvı olarak toplayın. Her yumurta için 15 ml santrifüj tüpüne kullanın. </li><li> 4 5 dakika santrifüj ° C ve 15 ml taze bir santrifüj tüplerine allantoik sıvı (pelet kırmızı kan hücreleri almadan) aktarın. </li><li> 4 santrifüje allantoik sıvı içeren tüpler Mağaza ° C kadar onlar kurtarıldı virüsün varlığı için bir hemaglütinasyon (HA) testi ile kontrol edilir. </li></ul></li></ol> 2. HA tahlil rekombinant influenza virüslerinin kurtarma onaylamak için Hemaglütinasyon deneyi (HA), rutin doku kültürü süpernatantlar MDCK ve / veya hasat yumurta allantoik sıvı kurtarıldı virüsün varlığını tespit etmek için kullanılır. Alternatif olarak, immünofloresan testleri (IFA) de yapılabilir. Bir test kurtarıldı virüsün varlığını tanımlayan sonra, virüs, plak saflaştırılmış ve virüsün genetik kompozisyonu, RT-PCR ve sıralama ile teyit edilecek olmalıdır. Makroskopik tavuk HA (ya da başka bir kaynaktan), kırmızı kan hücreleri (RBC) kullanarak MDCK doku kültürü süpernatantlar ve / veya enfekte yumurta allantoik sıvı virüsün varlığı tespit edilebilir. Virüs yokluğunda kuyunun altındaki kırmızı bir pelet (Şekil 4) oluşumunu sağlar virüsün varlığı, eritrosit hemaglütinasyon neden olur. İnfluenza virüsünün durumda, yaklaşık 10 3 -10 4 plak oluşturan birim (PFU) HA testi pozitif bir sinyal vermek için gerekli olduğu düşünülüyor; bu nedenle, onaylamak için bir IFA HA testi ile paralel olarak yapılabilir. gerçek negatif sonuç. Daha az 103-104 virüsler Bu tekniği ile tespit edilebilir, çünkü birincil anti-influenza antikorları IFA HA testinin daha duyarlı. , IFA pozitif HA-negatif süpernatantlar veya allantoik sıvıları daha mümkündür. Bu durumda, virüs MDCK hücreleri veya yumurta, tekrar Pasajlanması tarafından amplifiye edilmelidir. Alantoyik sıvı ve / veya ikinci pasaj doku kültürü süpernatantlar artık açıkça HA testi pozitif olmalıdır. 96-V-alt kuyucuğu HA testleri yapılmaktadır. Negatif (örneğin, PBS 1X) ve pozitif (doku kültürü süpernatantlar ve / veya bir grip virüsü enfeksiyonu allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman bunu doğrulamak için herhangi bir HA tayininde dahil edilmelidir. <ul><li> 1X PBS ul 50 V-bottom her iyi 96 plaka içine koyun. </li><li> 50 ul ekleMDCK ilk sıra enfekte yumurta ve doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvı aşağıdaki kuyuları için 2 kat seri dilüsyonları olun. Son kuyudan ekstra 50 ul atın. </li><li> % 0.5 &#39;her bir kuyunun% -1.0 tavuk, kırmızı kan hücreleri (1X PBS içinde hazırlanan) 50 ul ekleyin. </li><li> V-alt 96-iyi plaka (kırmızı bir nokta, bir negatif kontrol PBS örnek altında görünür oluncaya kadar) 30-45 dakika buz üzerinde inkübe edin. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi sonuçları okuyun ve interpretate. </li></ul> 3. Doku kültürü süpernatantlar geçmesi HA testi negatif bir sonuç, doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvı virüs mevcut düşük seviyelerde düşük transfeksiyon verimlilik bir sonucu olabilir. Bu örneklerin, taze MDCK ve / veya embriyolu yumurta Passage Enfeksiyonlar, daha önce bölümünde 1.11.2 açıklandığı gibi yapılır (Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi) virüs amplifikasyon sağlayacaktır. 4. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı grip virüsü kurtarma olumlu bir HA assay (Şekil 4) varlığı ile teyit edilecektir. Ayrıca, doku kültürü süpernatantlar ya da yumurtadan allantoik sıvı ile enfekte hücrelerde CPE varlığı olumlu bir viral kurtarma önerecektir. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. İnfluenza Virüs yapısı: Grip virüsü iki viral glikoproteinler (HA, NA) ve çift katlı lipid içeren bir çevrilidir ayrıca, iyon kanalı protein, M2. HA, viral eki protein, sialik bağlanarak asit içeren reseptörleri sorumludur. NA, ev sahibi hücrelerin viral serbest bırakılması için sorumludur. Çift katlı lipid altında, virion montaj ve tomurcuklanma ve viral ribonucleocapsids nükleer ihracat için gerekli nükleer ihracat proteini (NEP), önemli bir rol oynar iç yüzeyi zarf matriks protein 1, M1, oluşan bir protein tabakası. Çekirdek virüs, viral nükleoprotein, NP encapsidated 8 tek iplikli negatif RNA viral genler oluşan bir ribonükleoprotein (RNP) kompleks yapılır. RNP kompleksi ile ilişkili viral RNA bağımlı RNA polimeraz altbirimden PA, PB1 ve PB2. Tarafından kodlanan RNA segmentlerinde sırasıyla NS ve PB1, yapısal olmayan proteinleri NS1 ve PB1-F2, virion yapısının bir parçası değildir. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. İnfluenza virüs kurtarma plazmid: ambisense plazmid pDZ klonlanmış sekiz influenza virüsünün genleri gösterilir. plazmid pCAGGs 7 protein ekspresyonu türetilen plazmid pDZ 6, bir insan RNA polimeraz I organizatörü ve negatif anlamda genomik RNA kodlayan bir fare terminatör dizisi ile iki yönlü bir plazmid vektörü, ters yönde birleştirmek polimeraz, polimeraz II. transkripsiyon kaset (tavuk β-aktin organizatörü ve Polya) aynı viral gen viral proteinleri kodlar. Her viral segmentinden cDNAs SAPI kısıtlama endonükleaz site ve her segmentin (viral genlerin sonunda kara kutu) noncoding bölgeleri içeren ileri ve geri primerler ile RT-PCR ile üretilir. PCR ürünü Sap-I ile sindirilir pDZ klonlanmış. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Sekiz plazmid tabanlı influenza kurtarma sistemi: 8 influenza virüs genleri içeren pDZ plazmid ko-kültür (1. gün) 293T-MDCK hücreleri, süspansiyon, co-transfekte vardır. Yirmi dört saat FBS olmadan post-transfeksiyon, medya ama TPCK / tripsin içeren (2 gün) değiştirilmiştir. Kırk sekiz saat medya değiştirdikten sonra, doku kültürü süpernatant hasat ve MDCK veya 10 günlük embriyolu tavuk yumurtası (4 gün) bulaştırmak için kullanılır. 48-72 saat sonrası amplifikasyon, yumurtadan MDCK enfekte hücreleri veya allantoik sıvı doku kültürü süpernatantlar HA (Günde 6) hasat ve virüsün varlığı için test edilir. Herhangi bir virüs tespit edilirse, aynı süpernatantlar ve / veya allantoik sıvıları taze MDCK hücreleri ve / veya embriyolu yumurta içine yeniden geçişli olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Hemaglutinin assay (HA): virüs parçacığın eritrosit Hemaglutinasyon makroskopik olarak görünür ve doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvıları viral parçacıkların algılamak için temelidir. HA testi, viral enfeksiyon olan parçacıklar ve bozulmuş ve hücreleri enfekte etmek artık mümkün parçacıklar arasında ayrım olmamasına rağmen, tahlil örneklerinde virüsün varlığının iyi bir gösterge. A) (alt) biyolojik örnekler virüs varlığı yokluğu (üst) alt plaka ya da onların yokluğunda veya eritrosit varlığı ile belirlenir.ectively. B) saptanabilir virüs seviyeleri (üst) ya da virüs varlığı (altta) ile HA testte bir temsilci sonucu gösterilmiştir.

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Mount Sinai Tıp Fakültesi, rekombinant influenza virüslerinin alanda fikri mülkiyet hakları, ve AG-S, bu fikri mülkiyet bir mucit.

Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin Kurtarma sonra protokol rutin laboratuarda gerçekleştirilen basit ve kolay bir süreç, ama başında, birden fazla şeyler ters gidebilir. Virüs oluşturmak için iyi bir plazmid hazırlanması zorunludur. (293T ve MDCK) hücre hatları doğru bakım başarılı bir viral kurtarılması için çok önemlidir. Geleneksel olarak, genetik bir etiket sessiz mutagenez, bir grip plazmid gen kodlama içine eklenir. Bu sessiz mutasyon (lar) ve örneğin, yaratılış giriş, b...

Hücre dizileri 293T (katalog numarası CRL-11268) ve MDCK (katalog numarası CCL-34) hücre hatları DMEM% 10 FBS,% 1 PS% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör tutulur. Hücreler American Type Culture Collection (ATCC 10801 Üniversitesi Bulvarı, Manassas, VA 20.110-2209 ABD) bulunan bir biçimidir. Embriyolu tavuk yumurtası Charles River Laboratuvarları, Özel Patojen Ücreti Kuş Kaynağı (SPAFAS) Kuş Ürünler ve Hizmetler embriyolu 10 günlük civciv yumurta elde edilebilir. Franklin Commons, 106 Route 32, Kuzey Franklin, CT 06.254 ABD. Yumurtalar 37 ° C önceki ve viral enfeksiyondan sonra inkübe edilir. Viral enfeksiyon önce ve sonra, yumurta, embriyo canlılığını belirlemek için candled vardır. Bu viral enfeksiyon öncesi ve sonrasında ölü yumurta bakmak için çok önemlidir. Önce ölü bir yumurta bulaşmış kan damarlarının olmaması yanı sıra embriyo hareketlilik olmaması tespit edilebilir. Candled, canlı embriyolarının hareket eder. Viral enfeksiyondan sonra ölü bir yumurta (muhtemelen influenza virüs enfeksiyonu ile ilgili) kolayca allantoik sıvı hacmi küçük ve kanlı görüldüğü gibi yumurtanın kötü görünüşü fark olacaktır. Etkilenmiş-yumurta çift otoklav torbaları atılır ve standart prosedürler takip otoklavlanırlar. Tavuk kırmızı kan hücreleri (eritrosit) Tavuk RBC Truslow Çiftlikleri, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620 satın alınabilir. 4 ° C saklayınız HA deneyleri için tavuk RBC 5 ml, 45 ml, 50 ml santrifüj tüpüne PBS 1X yıkayın. 1000 rpms, RT az 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatle atın ve PBS 1X pelet RBC 1:1000 dilüsyon (0.5-1.0% RBC final konsantrasyon) kullanabilirsiniz. Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları , Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları, 4 ° C, kısa bir süre için saklanabilir. Virüs kurtarma onayladıktan sonra, hücre süpernatantlar virüs veya allantoik sıvı -80 ° C&#39;de saklanır. Plazmidler Plazmid plazmid maxi kiti aşağıdaki üretici öneriler kullanılarak hazırlanmıştır. Tüm plazmid GKD 2 O 1 mcg / ml konsantrasyonlarda kısım ve -20 ° C&#39;de saklanan Kısa süreli depolama için, 4 tutmak plazmid olabilir ° C Plazmid saflaştırılmış DNA konsantrasyonu, saflığı 260:280 nm oranı kullanılarak tahmin, 260 nm&#39;de spektrofotometre tarafından belirlenir. 1,8-2,0 260:280 nm oranları ile hazırlıklar virüs kurtarma amaçlı tahsis kabul edilir. Ayrıca, plazmid konsantrasyonu ve saflık agaroz jel kromatografisi ile teyit edilmelidir. Ambisense pDZ plazmid (6), sekiz grip A/PR/8/34 viral genler (7) içeren Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Virüsler Grip A/PR/8/34 kurtarmak için açıklanan protokol biyogüvenlik düzeyi (BSL) 2 koşulları altında yapılabilir. Doku kültürü süpernatantlar ve embriyolu yumurta da dahil olmak üzere kontamine malzeme, atmadan önce sterilize edilmelidir. Diğer grip virüsü Kurtarma yüksek BSL koşulları ve bu nedenle, özel koşullar / güvenlik ölçümleri takip gerekecektir gerekebilir. Doku kültürü medya ve çözümler DMEM% 10 FBS% 1 PS: 445 ml Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM), fetal sığır serumu (FBS) 50 ml ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin (PS). 4 ° C saklayınız Bu ortam transfections 293T ve MDCK hücreleri gibi korumak için kullanılır. DMEM% 0.3 BA% 1 Not: DMEM 495,7 ml, 4.3 ml% 35 Bovine Albumin (BA). 4 ° C saklayınız Kullanmadan önce, son bir 1 mg / ml konsantrasyonu TPCK tedavi tripsin ekleyin. Enfeksiyon medya. 80 g NaCl, 2 g KCl, Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4 11,5 g: 10X fosfat tamponlu salin (PBS). 1 litre kadar GKD 2 O ekleyin. PH 7.3 &#39;e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. 1X PBS: GKD 2 O. ile seyreltin 10X PBS 01:10 Oda sıcaklığında ve mağaza otoklav ile sterilize edin.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Grip araştırma grupları bir takım çabalar, influenza A virüsünün ters genetik geliştirme ve iyileştirme kilit edilmiştir. 1999 yılında kurulmuş.<sup&gt; 1,2</supSpesifik sorular, genetik mühendisliği, enfeksiyon, rekombinant influenza virüsleri ile cevap çünkü rekombinant virüsler üretmek için plazmid tabanlı ters genetik teknikleri influenza araştırma alanında devrim yarattı. Bu tür çalışmalar, virüs replikasyonu, virüs proteinleri işlevi, viral replikasyon ve / veya patogenezinde viral proteinlerin belirli mutasyonlar katkısı ve ayrıca, viral vektörlerin, yabancı proteinler ifade rekombinant influenza virüslerinin kullanarak<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.2K Görüntüleme.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Video: Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...