SS Wellcome Trust Programı Grant tarafından Wellcome Trust Intermediate Klinik Bursu, CW tarafından finanse edilmektedir.

1.. Mikroslayd Hazırlık <ol><li> Ön Kaplama sıçan kuyruğu I tipi kolajen (220 ug / ml &#39;lik bir çalışma veren seyreltme 1:100 PBS içerisinde seyreltilmiş RTC) ile birlikte bir altı kanal mikroslayd. Bu da doğrudan bir kanal içine seyreltilmiş RTC çözeltisi 30 ul enjekte ve PBS ile üç kez, ardından 37 ° C&#39;de 2 saat için inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. </li></ol> 2. Lam içinde tohumlama Hücreleri <ol><li> Tripsin-EDTA (13, daha önce tarif edildiği gibi karaciğer dokusundan izole edilmiş) kültürlü insan karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin konfluent T75 şişesi (HSEC) ayrıştırmaları, tam ortam maddesi (insan endotel 3 x 10 6 hücre / ml &#39;de PBS içinde yıkama tekrar süspansiyon ve Bazal ortam 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve streptomisin 100ug/ml,% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu, vasküler endotelyal büyüme faktörü, 10 ng / ml ve hepatosit büyüme faktörü 10 ng / ml) ile takviye edilmiştir. Dire hücre süspansiyonu 30 ul enjektectly her kanal içine. </li><li> Hücreler 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 1 saat boyunca yapışmaya bırak Bir slayt raf üzerinde% 5 CO 2 atmosferinde C °. Hücreler komple ortam (Şekil 1) ile her bir kanalın her iki tarafındaki bağlantı noktalarını doldurmak uymak için izin verildikten sonra. </li></ol> 3. Hücreler Sitokin uyarılması <ol><li> 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde hücreler bırakın. Bir ters faz kontrast mikroskop kullanılarak hücre büyümesini değerlendirin. Önce yapışma deneyi için 24 saat, tümör nekroz faktörü alfa ve interferon gama ile desteklenmiş tam ortam, 10 ng / ml &#39;de her ikisi ile büyüme ortamı değiştirerek sitokin ile endotelyal monokatmanlarına uyarır. </li></ol> 4. Periferal Kan Lenfositlerinin izolasyonu <ol><li> Ilk olarak, 800 ile 25 dakika boyunca bir hücre ayırma ortamı üzerine santrifüj yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile tek-çekirdekli fraksiyonu saflaştırılması kandan periferal kan lenfositleri izolex g. Monosit yapışmasını sağlamak için 1 saat boyunca plastik hücreleri inkübe edin. </li><li> Plastik aspiratı bağlılığın ardından lenfosit süpernatant zenginleştirilmiş. Lenfositler yıkayın ve akış ortam içinde (tipik olarak 1 ila 6 x 10 hücre / ml (endotel bazal ortam ihtiva eden% 0.1 (v / v) inek serum albümini (BSA)) onları yeniden süspanse edin. </li></ol> 5. Inhibitörleri ile Endotelyumunun ya da lökositler Tedavi öncesi <ol><li> Endotel media/0.1 (% v / v) BSA işlevi bloke antikorlar veya küçük molekül inhibitörleri tavsiye edilen seyreltim dizileri hazırla. 30 dakika önce tahlil akmaya seçilen mikroslayd kanalda antikor / inhibitörü çözümü engelleme ile tam orta yerine. </li><li> Lenfositler üzerinde kemokin reseptörlerinin ön-muamele planlanmaktadır yerlerde, (v / v),% 0.1 BSA içeren RPMI çözelti içinde tekrar süspansiyon izole lökosit ve kemokin reseptörlerinin G-protein kenetli reseptör aktivitesini bloke etmek Pertussis Toksin, 200 ng / ml &#39;si ile inkübe edilir, alternatif olarak, belirli seyreltik fonksiyonTavsiye seyreltmede antikor ya da kemokin reseptörlerinin küçük molekül inhibitörlerini bloke. Akış daha sonra ortam içinde tekrar süspansiyon ve yıkama, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin lökositleri. </li></ol> 6. Akış Deneyi sistemi ayar <ol><li> 37 için bir termostatik kontrollü şeffaf odası Prewarm ° C. Odası hemen hemen hiçbir ölü hacmi ile hücreler ve ortam arasında geçiş sağlayan elektronik bir solenoid valf için silikon tüp ve elektronik kaynağının yerleştirilmesi için bağlantı noktaları olmalıdır. Odacık izin vermek için, bir ters mikroskop üzerine monte edilir faz kontrast mikroskopisi. Şekil 2 mikroskopa yerleştirildi akış deney odası ve mikroskop ve mikroslayd gösterir. </li><li> Steril damıtılmış, 10 ml su ile bir luer loc bulunan bir 50 ml&#39;lik bir cam şırınga önceden doldur ve şırınga noktasına 25 cm silikon bir boru uzunluğu ekleyin. Bir şırınga pompası yerleştirin. Göre olan şırınga pompasının çekme oranı Alter0,05 Pa (0.5 din / cm 2, Şekil 3) bir kesme gerilimi korumak için mikroslayd üreticinin talimatları. </li><li> , Iki adet 5 ml&#39;lik şırınga al pistonu atmak ve silikon tüp kullanılarak bir elektronik solenoid valfinin iki akış bağlantı noktaları için varil ekleyin. <ol><li> Çıkış akış vanasına silikon boru 12 cm takın. Vana, bir hücre barındırmayan yıkama tamponu (endotelyal media/0.1% (v / v) BSA) ve lenfosit süspansiyonu ile almaşma izin verir. </li><li> Her iki şırınga varil yıkama tamponu yerleştirmeden ve tampon bir varil vana ile ve dışarı akış silikon tüp içine akan sağlayarak elektronik selenoid vana yıkayın. </li><li> Diğer alternatif namluya ve tampon akan ve tüm kabarcıklar sistemden kaldırılır sağlamak için valf anahtarı kullanın. Varil birinden yıkama tamponu çıkarın ve lenfosit süspansiyon Şekil 4a ile değiştirin. </li></ol></li><li> Silikon Tubin geçbir mikro adaptörü ile seçilmiş bir mikroslayd kanalın bir bağlantı noktasına şırınga pompası g. Daha sonra bir mikro adaptör ile ters bağlantı için çıkış valfinden silikon boru bağlayın. Silikon tüp ve adaptörleri hava kabarcıkları sistemi (Şekil 4b) girmesini önlemek için bağlantıdan önce yıkama tamponu ile dolu olduğundan emin olun. </li><li> Bir kez akış sistemine bağlı, mikroskop sahnede mikroslayd yerleştirin ve hareketini önlemek için klipler veya bantla bağlamak. Uygun faz ayarı ile birlikte 10X objektif için mikroskop ayarlayın. Endotel tek tabaka görüntülenmiştir sağlamak ve odak oküler lens kullanarak. Emin olun görüntüleri görüntüler bir monitöre geçirilen ve kaydedilebilir sayede mikroskop bağlı bir kamera ile yakalanabilir. </li></ol> 7. Analiz için Yapışmasının Assay Tekniği ve kayıt akışı <ol><li> Withdrawa başlanarak 2 dakika boyunca yıkama tamponu ile endotel tabakası serpmekher kalıntı bağlanmamış bloke antikorunu çıkarın ve daha sonra 0,05 Pa sabit bir duvar kesme stresinde lökosit çözeltisi, 5 dakika bolus izin vermek için valfi geçmek için şırınga pompasının l </li><li> Lökosit bolus son 2 dakika boyunca, Mikroslayd uzunluğu boyunca 10 rastgele alanları kayıt. Bu endotel tabaka üzerinde lenfosit haddeleme / bağlanıyor çevrimdışı analiz sağlar. Sonraki geçmeden önce yaklaşık 10 saniye boyunca her alanı kaydetmek ve kayıtları iki kez hızlı bir şekilde aynı yuvarlanma hücreyi kayıt önlemek için akış yönüne karşı yapılan emin olun. </li><li> Kendi başlangıç ​​pozisyonuna vanayı dönerek yıkama tamponu 5 dk hap ile lökosit bolus izleyin. Bu bolus nihai, 2 dakika boyunca Mikroslayd uzunluğu boyunca en az 10 rastgele seçilen alanlar seçerek bir ikinci kayıt aşamasını gerçekleştirmek. Sonraki geçmeden önce yaklaşık 5 saniye boyunca her alanı kaydedebilir ve emin olun endotel tek tabaka ve yapışık leucocYtes net bir odak vardır. Bu yapışma Desenin çevrimdışı analiz sağlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan

Başarılı bir akış deneyi gerçekleştirmek için en önemli nokta, endotel hücreleri, sağlıklı ve konfluent tek tabaka önce akış yapışma deneyi için hazır olduğunu garanti etmektedir. Primer endotelyal hücreleri kültürüne zor ve kültür yöntemleri değişikliklere karşı duyarlı olabilir. Bu 1) akış gözlerinden yeterli ve üniform bir tek tabaka endotel hücreleri ile kaplı olması önemlidir; HSEC için sıçan kuyruğu tip I kolajen kullanımı, ancak bu diğer endotel nüfus için farklı olabilir, 2) kültür ortamı için, hücre tipi için uygun HSEC biz protokol bölümünde bizim tam orta tarif var. Diğer önemli bir adım kesme geriliminin fizyolojik seviyelerini yansıtacak şekilde uygun oranda şırınga pompası ayar içerir. Akış deneyi sırasında endotel tek tabaka zarar verebilir ya da endotel yüzeyinden bağışıklık hücreleri şerit olabilir, akış devresi içinde hava kabarcıklarını önlemek için gereklidir. Bu, en önlenebilirtüm silikon boru ve adaptörleri, tüm hava kabarcıkları çıkarılır ve ortam kullanımdan önce önceden ısıtılmış olduğu olduğu, bağlantıdan önce yıkama tamponu ile perfüze edilir ki suring. Bir sıvı / sıvı arayüz bağlantısı sırasında orada çok önemli olduğunu mikroslayd üzerinde limanlarına adaptörleri bağlarken herhangi bir hava varsa, o zaman bu şırınga çekilme sırasında endotel tek tabaka bozacak sistemi içinde bir hava boşluğu oluşturacak adım. Şırınga haznesinin lökosit solüsyon, hücreler bu şekilde, deney boyunca sabit bir hücre yoğunluğu sağlamak çökmeyen emin olmak için düzenli ajitasyon gerekmektedir. Kayıt adımları sırasında endotel tabakasının görüntü yeterince hassas odaklı ve çevrimdışı analiz izin vermek için açık olduğundan emin olmak için önemlidir ve bu akış deneyi (sonrası lökosit bolus) ikinci aşaması esnasında yeterli bir süre, yıkama tamponu boyunca bırakılır Kayıttan önce faz sağlamak için tekrar başlatılırTüm nonadherent lökositler kaldırılır. Benzer şekilde dar kılcal akış modelleri engelleyebilir hücrelerin kaybını önlemek için ve aynı zamanda, faz kontrast mikroskobu ile daha büyük bir yapışkan lökositlerden ayırmak için zor olabilir, uygun yoğunlukta bir tek tabaka endotel hücrelerin kullanımı gereklidir. İnsan karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri için uygun tohumlama yoğunluğuna tarif ama bu farklı popülasyonlarda endotel ve türler arasında değişebilir. Önemli bir ilerleme intravital mikroskobu ile hayvan modellerinde lökosit işe okuyan yapılmıştır. Akış yapışma deneyi yöntemin en önemli avantajı, lökosit işe primer insan endotel hücreleri ile ikili bir sistem içinde ele alınabilir olmasıdır. Dahası, bu etkileşimler makaslama stresin fizyolojik ilgili düzeyleri altında incelenebilir. Differenc olabilir gibi insan hücresel sistemler ile hayvanlarda Intravital çalışmaların bulguları doğrulamak için önemlidirtürleri arasında endotel özellikleri es. Akış testinin sınırlamalar biri lökosit işe endotel tek tabakalı bir tek hücreli ortamda okudu ediliyor olmasıdır. Lökositler endotelyumda yapıştırılır ve transmigrated kez ek olarak izole edildi ve sonraki işlemler maruz için yeterli sayıda mevcut olmayabilir. Bu kısıtlamalara rağmen, akış yapışma deneyi hakim olmuştur kez lökosit yapışma kaskad daha analizini gerçekleştirmek için geliştirilmiş ve bir çok hücreli ortamı özetlemek için adapte edilebilir. Tek alanları ve izleme yazılımı kullanımı Uzun süreli kayıt lökositlerin sürünerek davranışını analiz etmek için kullanılabilir. Bundan başka, akış tahlilin tamamlanmasından sonra Lam daha ayrıntılı olarak yapışma ve transmigrasyonun çalışma için tarama lazer konfokal mikroskopi ile immünofloresan etiketleme kullanarak sorguya olabilir. Ayrıca, daha önceden geliştirmek varakan lökositler hepatositlerin varlığı ile şartlandırılmış karaciğer endotel etkileşebilen bir in vitro modeli ed. Bu deney aynı zamanda lökositlerin subpopülasyonunun incelemek için geliştirilmiş olabilir: grubumuz gibi düzenleyici T hücreleri, B hücreleri ve karaciğer infiltre lökositler gibi alt grupları ile çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar akış yapışma deneyi, insan sistemlerinde genel ve organ spesifik lökosit işe incelemek için güçlü bir araç olduğunu kanıtlar vardır.

Bu şimdi de genel lökosit işe aşamalı yapışma kaskad 1 paradigma izler kurulmuştur. Bu durum, kap duvarını kaplayan endotel hücreler tarafından kan akışını lökositlerin yakalama içerir. İlk olarak, lökosit reseptörleri ya da imünoglobülin üst ailesinin üyelerini selektin aracılık ettiği bir haddeleme aşamasından geçen. Bu G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) endotel glikokaliks sunulan kemokinler ile aktive edilecek olan lökosit yüzeyinde ifade sağlar. Bu lökosit yüzey üzerinde bir &#39;yüksek afinite&#39; durumuna integrin onay değişime yol açar ve tutuklama ve endotele firma yapışma. Firma yapışma sonra kabın üzerine lökosit şekli değişikliği ve taranmasına izlemektedir. Son adım paraselüler veya hücre üzerinden yolları ile de meydana gelebilir endotel mono-katman, bir göç yoluyla. Aşamalı yapışma kaskad tarif ederkens vücut içinde lökosit işe genel mekanizma organa özgü farklılıklar vardır. Karaciğerde lökosit işe çoğunluğu genel olarak işe sonrası kılcal venüllerin 2 içinde ortaya çıkar diğer organlarda aksine hepatik sinüzoidlerdeki içinde gerçekleşir. Hepatik sinüzoidlerle düşük kesme ortam vardır ve lökosit bağımsız 2 Selektin olduğunu yapışma sıkılaştırmak için önce kısa bir birleştirme adımı tabi. Bu kanallar süreksiz ve Fenestrae, çapı açık gözenekler 100-200 nm içeren hepatik sinüzoidal endotel kaplı ve bir bazal membran 3 yoksundur. Insan hepatik sinüzoidal endotelyumda lökosit işe aracılık moleküler mekanizmaların tanıtılması organ enflamatuvar karaciğer hastalıkları için spesifik tedavi hedefleri belirlemek olabilir. Akış yapışma deneyleri lökosit işe okuyan temel araçlardır. Onlar izin lökosit Recru yeniden inşasıiyi tanımlanmış kuvvetler altında yapışma analiz etmek için kesme geriliminin varlığında itment. Analiz için en sık kullanımı, kültürlü endotelyal ya da saflaştırılmış tek tabakaları alt-tabakalar için, çalışma lökosit yapışma sağlamaktır. Ticari olarak temin edilebilen akış gözlerinden iki yassı yüzey arasında laminar akış koşulları altında hücreleri perfüze edilmesi ve daha sonra mikroskop 4 yapışmasının dinamik işlemini görselleştirmek için kullanılır. Önceki gruplar belli yapışkan etkileşimler sadece akış altında yer aldığını göstermiştir ve statik deneylerinde 5,6 okudu edilemez. Biz karaciğer sinüzoidlerde recapitulate ve düşük kesme stres koşulları altında lökosit işe çalışmak için bu tekniği kullandık. Primer insan HSEC Lam ve lökositlerden kültürlenir daha sonra karaciğer sinüzoidlerdeki içindeki kayma gerilmesi üretmek için hesaplanan akış oranında bu tek tabaka üzerinden perfüze edilebilir. Kesme gerilimi OPP yüzeyine paralel veya teğet uygulanan bir strestirdik normal stres osed. Bir sınır boyunca hareket herhangi bir sıvı olduğunu sınırında bir makaslama stres yaratacaktır. Kesme gerilmesi lenfosit göçü 7 önemli bir bileşeni olduğu gösterilmiştir. Bu koşullar altında yapışma kaskadının her adım faz kontrast mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bu yöntem, geleneksel bir yapışma moleküllerinin 8&#39;in çalışma, kemokinlerin ve kemokin reseptörlerinin rolü, 9-11, ve bu damar yapışma proteini-1 (VAP-1 gibi atipik yapışma molekülleri de dahil olmak üzere karaciğer içinde lökositlerin işe önemli bilgiler sağlamıştır ) 8,12 ve ortak lenfatik ve vasküler endotelyal reseptörü-1 (ZEKİ-1) 13. Bu tahlil, bizim grubun yayınlarının birkaç söz edilmiş olmasına rağmen, onun açıklama kısa oldu ve biz gidermede yardımcı ve teknik hataları önlemek için adım kılavuz detaylı bir adım sağlamak için bu fırsatı almış zaman denemesitahlil ing. Ayrıca, son zamanlarda kayma gerilmesi doğru değişiklikler sağlar mikroslayd odaları kaynak değişti. Bu endotel ve diğer bağışıklık hücreleri için tahlil uygulanabilirliğini genişletmektedir inanıyoruz. Aşağıdaki yöntem, insan karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve çevresel kan lenfositleri ile bir akış göre yapışma deneyi gerçekleştirilmesi için hazırlanmasını ve teknik anlatılmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

İnsan karaciğer doku içine lökosit infiltrasyonu tüm yetişkin inflamatuar karaciğer hastalıklarında yaygın bir süreçtir. Kronik sızma siroza fibrozis ve ilerleme gelişimini sürebilirim. Karaciğer lökosit işe aracılık moleküler mekanizmaların anlaşılması karaciğer hastalığı için önemli terapötik hedefler belirlemek olabilir. Lökositlerin toplanması sırasında önemli etkileşim kesme stresi koşulları altında endotel olan inflamatuar hücrelerin olmasıdır. Karaciğer İşe karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (HSEC) ile kaplı olan hepatik sinüzoidler düşük kesme kanallar içinde gerçekleşir. Hepatik sinusoidler içindeki koşullar spesifik akış oranlarında insan HSEC tekkatmanlar ile kaplı kanallardan lökositler delinmesiyle değinmeyecek edilebilir. Bu koşullarda, endotelyal lökosit üzerinde bir tarama adımı ve sonraki göçü ardından aktivasyon ve sağlam yapışma ve ardından kısa bir birleştirme adımı, geçmesikatmanı. Faz kontrast mikroskobu kullanarak, bu &#39;yapışma çağlayan&#39; her adımı görsel ve çevrimdışı analiz takip kaydedilebilir. Endotelyal hücreleri ya da lökositler, bu işlem sırasında özel moleküllerin rolü belirlemek için inhibitörleri ile muamele edilmiş olabilir.

Bu deney, çok aşamalı akış yapışma kaskad görselleştirmek ve molekül inhibitörleri ile kişilerce kontrol deneylerinin sonuçları karşılaştırarak temel moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yeteneğine sahiptir. Çeşitli vasküler yatak belirli endotel hücrelerini içeren ve kayma gerilme durumlarını değiştirerek değinmeyecek edilebilir. Yapışma kaskadının her adım protokolde belirtilen kayıt yöntemi izlenerek çevrimdışı analiz edilebilir. Yapışma kaskadının ilk adım toplam yapışık hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir lökositlerin yuvarlanma olan. Çevrimdışı analiz yapışık hücre sayısı, lökosit bolus süresince kaydedilen her alanda numaralandırılmış sağlar. Görüntünün Çalma sıkıca yapışık ve endotel tabaka boyunca bir dönme hareketi geçirmekte olanlardır hücrelerin karşılaştırma sağlar. Yuvarlanma hareketi Bu teknik kullanılarak görüntülendi olabilir, her bir alan en az 10 saniye boyunca kaydedilir. Yuvarlanan hücreler akan göre endotel yüzeyi üzerindeki düşük hız ile tanımlanır. Bu davranış, ayrılma olmadan en az 5 saniye boyunca gösterilmelidir. Hepatik sinusoidler içinde yapışma çağlayanı düşük kesme ortamda gerçekleşir ve in vivo çalışmalar, sadece kısa bir bağlama adım minimal haddeleme doğruladı. Biz akış deneyi yapışık lökositlerin% 10 dan az ısrarla bu tahlillerde üzerinde HSEC uyarılmış rulo göstererek hepatik sinüzoidler ortamını yansıtan doğruladı. Yapışma kaskadının bir sonraki adım sağlam bir yapışmanın sağlanmasıdır. Toplam yapışma yıkama tamponu bolus (adım 7.3) sırasında kayıt ikinci aşamasından hesaplanabilir. Çevrimdışı analiz sıkıca yapışan hücrelerin toplam sayısı (Şekil 5) Her alan sayılmıştır sağlar. Sıkıca yapışan hücreler, sabit ya da yavaş tarama davranışı ile shapechanged olan hücreler olarak tanımlanmaktadır.Alan başına ortalama hücre sayısı daha sonra hesaplanabilir. Bu rakam, daha sonra ölçüde ifade etmek için, lenfositler (tipik olarak 1 x 10 6 hücre / ml) konsantrasyonu ve akış hızını (gratikül veya eşdeğeri kullanılarak belirlenir) görüş alanındaki toplam yüzey alanı ile bağlantılı olarak da kullanılabilir yapışık hücre / mm olarak lenfosit yapışma 2/10 6 hücre perfüze edildi. Yapışma desen incelenmesi yapışma kaskad, şekil değişikliği de dahil olmak üzere tarama ve transendotelyal göç son iki adım analizini içerir. HSEC tek tabaka üst yüzeyine yapışık Lökositler faz parlak tek tabaka boyunca göç etmiş olanlar iken faz koyu (Şekil 6) gibi görünür. Hücreler daha sonra, &#39;statik&#39; yapışmasını (yer değiştirmemiş / yuvarlak) sergileyen olarak sınıflandırılan &#39;şekil değiştirdi&#39; morfoloji veya &#39;göç&#39; ve bireysel kategoriler daha sonra bir yüzdesi olarak ifade edilir edilebilirtoplam nüfus yapıştırıcı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Şekil 1. Akış odası içinde bulunan primer insan karaciğer sinusoidal endotelyal hücre tabakalı. Ortam önceki akış yapışma deneyinde konfluent tek tabaka endotel. B) faz kontrast görüntü başlamasından endotel hücrelerinin tek tabakasını ihtiva eden dolu A) Lam, endotel hücreleri (insan hepatik endotel hücreleri için bu konuda olmalıdır kaplanmış olan mikroslayd tohumlanmış olmalıdır sıçan kuyruğu kollajen tip 1) ve endotel hücreleri kültür ve kaynaşma sağlıklı olması esastır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. Deney odası akış. Bir akış deney odası set-burada görülebilir, bir ters mikroskop üzerine monte edilmiş şeffaf bir odadan oluşur. Bir ısıtıcı odasına yerleştirilir ve termostatik olarak 37 ° C&#39;lik bir sıcaklığı muhafaza etmek üzere kontrol edilmelidir Dışında bulunan bir şırınga pompası için oda içinde bir mikro silikon boru bağlamak için bağlantı noktaları mevcut olmalıdır. Mikroslayd mikroskop sahnede doğrudan yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Şekil 3,. Pompa şırınga. Bir şırınga pompa bağlamakakış haznesine silikon boru yoluyla ed. Pompa deney için gerekli istenen kayma strese bağlı olarak belirli bir geri çekilme oranı ayarlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Şekil 4. Valf temizlendi ve iki varil vanasından silikon tüp, kurmak kez odasını akmaya vana bağlayarak. A) elektronik selenoid valf) neredeyse hiç ölü boşluk. B hücreleri ya da medya birini içeren iki şırınga varil arasında geçiş sağlar akış odasına bağlanır. Bu, akış odasının bağlantı noktasına silikon boru Adaptörü bağlanırken bir sıvı / sıvı arayüzü vardır önemlidir. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Şekil 5,. Total lökosit yapışma ölçümü. Yıkama tamponu bolus aşama (protokolde tarif edildiği gibi) son iki dakika boyunca, on rasgele alanların minimum kaydedilmelidir. Bu off-line analiz edilebilir ve sağlam bir şekilde yapışan hücrelerin toplam sayısı her alanda sayılabilir. Lökositlerin toplam yapışma kontrol odaları ve bloke edici antikor ile önceden tedavi olanlar arasında mukayese edilebilir, burada biz bir kontrol slayt temsili bir alan ve hücre içi adezyon molekülü-1 (ICAM-1) engelleme antikor ile hazırlanmış bir slayt göstereceğim. Oklar temsilcisi olarak, yapışkan lökositleri vurgulamak için eklenmiştirKontrol slayt alanını çabaya verilen belirlenen 25 lökositlerin toplam vardır ve ICAM-1 blok slayt belirlenen 13 lökositlerin toplam vardır. = 100 mikron Ölçek bar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Şekil 6,. Kaydedilen alanların faz kontrast mikroskopisi ile tekli katmanlar üzerinde endotelyal lökosit adezyon Desenin analizi. Çevrimiçi analizi aynı zamanda lökosit yapışmasının yönünü ve hızını incelemek için kullanılabilir. Yapışma kaskadının belirli adımlar görsel ve faz kontrastlı görüntüleme kullanılarak belirlenebilir. Aktive sıkıca yapışık olmayan ama faz parlak hücreler &#39;yuvarlak&#39; yapışma, activate olan hücreler olarak adlandırılan olabilird ve faz parlak &#39;değişmiş şekli&#39; olarak adlandırılan olabilir ve faz karanlık hücreler transendotelyal göç geçirmiş ve &#39;göç&#39; olarak adlandırılan olabilir hücrelerdir. Görüntü yapışma her desen örneklerini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

a-flow-adhesion-assay-to-study-leucocyte-recruitment-to-human-hepatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Görüntüleme.  University of Birmingham.  Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir. 

Video: A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...