This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Kuş bileşenleri ile tüm canlı yeniden düzenlenmiş virüsler biyogüvenlik düzeyi Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından kullanım için onaylanmıştır bir laboratuvarda -Gelişmiş uygulamaları 2 (BSL2) kullanılarak ele alınması gerekir. Reaktifler ve başlangıç ​​materyalinin hazırlanması 1. Not: Tüm reaktiflerin kaynağını elde etmek için malzemeler Tablo bakın. <ol><li> Fetuin kaplı plakalar <ol><li> 90 ml 10 mi 10x kaplama tampon karıştırarak kaplama tamponu hazırlayın H2O deiyonize </li><li> -20 ° C&#39;de 500 ul alikolar içinde 1x kaplama tamponu ve mağaza 25 mg / ml&#39;de fetuin bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> 1x kaplama tamponu içinde 1000 kat stok çözelti seyreltilerek kaplama hemen Plakalar, önceden fetuin (25 ug / ml) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> al içine fetuin çalışma çözeltisi 100 ul dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanınyüksek protein bağlama kapasitesine sahip 96 oyuklu bir plakanın l kuyu. </li><li> Daha sonra 10 kişilik gruplar halinde plakaları yığını ve folyo sarın bir plaka kapatıcı ile her plaka örtün. </li><li> bir deney yapmadan önce bir buzdolabına (2-8 ° C) en az 18 saat tabak yerleştirin. Not: Levhalar önceden kaplandı ve 2 aya kadar 2-8 ° C&#39;de kaplama çözeltisi ile depolanabilir. </li></ol></li><li> Dilüentler <ol><li> 94.2 ml karıştırın virüsü ve Numune seyreltileri (2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.5, 20 mM CaCl2,% 1 sığır serumu albümini (BSA) ve% 0.5 Tween 20) yapmak için seyreltici hazırlamak 1X MES, 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile pH 6.5, 3.3 ml% 30 BSA ve 0.5 ml Tween 20. </li><li> 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile 94.7 mi 1 x MES, pH 6.5 karışımı, PNA-HRPO (MES, 20 mM CaCl2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) seyreltici hazırlamak ve 3.3 ml% 30 BSA . </li></ol></li><li> Nöraminidaz (NA) Not: H6Nx virüsü reassyayınlanan yöntemler 5,10 aşağıdaki ortants (bu H6 alt tipi HA ve ilgi NA var), oluşturulur. onlar in-house mevcut değilse bir ortak çalışan inaktive reassortant virüsü şişeleri talep edin. inaktif virüs kullanırken, hazırlık inaktivasyonu süreci NA aktivitesi üzerinde önemli bir etkisi yoktu gösteri yoluyla ELLA kullanıma uygun olduğunu teyit etmektedir. <ol><li> Kültür, bir embriyo halindeki tavuk yumurtalarının 11 H6Nx Virüsün stok ve -80 ° C&#39;de susuz alantoik akışkan, 0.5 ml lik kısımlar halinde saklayın. </li><li> Her bir deney için yeni bir virüs kısım kullanın. dondurmak ve alikotları çözülme etmeyin. </li></ol></li><li> Serum numuneleri ve Kontroller <ol><li> Tüm serum Isı inaktive (test örnekleri, örneğin, ön ve son aşılama serumlar, hem de kontrol, örneğin, bilinen NI titeri ile, örnek) 45-60 dakika boyunca 56 ° C&#39;de bir su banyosu içinde. ısıl işlem öncesi veya sonrasında -20 -70 ° C &#39;de sera saklayın. samp Eğerles defalarca test edilmiş numune Tekrar tekrar dondurulup çözülmüş değildir, böylece dondurmadan önce birkaç alikotları yapmak gerekmektedir. </li><li> Burada inceliği yüksek olan en azından düşük titreye sahip bir başka tespit etmek (&gt; 5 mi), uygun bir miktarda mevcuttur, insan serumlarının NI titrelerini ölçmek için Ella&#39;yı kullanın. olarak 100 ul alikotları Mağaza ≤-20 ° C aynı örnek deney performansı izlemek için bir çok deneylerde bir kontrol olarak kullanılabilir, böylece. </li></ol></li><li> Yer fıstığı aglutinini (PNA) -Horseradish peroksidaz (HRPO) <ol><li> PNA-HRPO seyreltici (MES, CaCI2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) hazırlayın. </li><li> 1 ml seyreltici PNA-HRPO, 1 mg eriterek PNA-HRPO stok çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de 20-200 ul alikotları saklayın. </li><li> (Pozitif kontrol ile maksimal OD sonuçlanan miktarını belirlemek için bu reaktifin 2000 dilüsyonları (virüs sadece) ve bir arka plan: 500, 1: 750, 1: 1000 ve 1 yeni PNA-HRPO çok test 1 kullanmadan önce Resim virüsü) tşapka &lt;pozitif sinyal% 10. <ol><li> bölüm 2.1&#39;de anlatıldığı gibi dörtlü virüs dilüsyonları olun. </li><li> Bölüm 2.2&#39;de tarif edildiği gibi, bir fetuin-kaplı plakaya dilüsyonları aktarın ve 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> 16-18 saat sonra plaka yıkanır ve 1 ekleyin: plaka satır çoğaltmak için, PNA-HRPO 2.000 seyreltileri (100 ul / oyuk): 500, 1: 750, 1: 1,000 ve 1 ile. </li><li> 2.3.9 adımları 2.3.4 anlatıldığı gibi tahlil tamamlayın. </li><li> &gt; 10 kez arka plan maksimum sinyal sonuçlandı seyreltme seçmek için verileri gözden geçirin. </li></ol></li><li> Kullanımdan hemen önce, 1.5.3 tanımlanan PNA-HRPO optimal dilüsyon hazırlanır. </li></ol></li><li> Yıkama tampon maddesi (0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4,% 0.05 Tween 20 (PBS-T)) büyük hacim hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Peroksidaz substratı (o-fenilendiamin dihidroklorür (OPD)) hazırlanması: Not: 3,3 alternatif peroksidaz alt tabakalar &#39;Kullanılabilir,, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB) <ol><li> Deney gününde 100 mi dH 2 O 1 kapsül çözülmesiyle fosfat sitrat tamponu hazırlayın. </li><li> Kullanımdan hemen önce, fosfat sitrat tamponu, 20 ml 1 OPD tablet (10 mg) içinde çözülür. </li></ol></li><li> Durdurma solüsyonu (1 NH 2 SO 4) hazırlayın: SO 4 973 ml dH 2 O. 27,2 ml stok% 98 H 2 eklemek Karıştırın ve daha sonra oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> NA Miktarının Belirlenmesi 2. ELLA kullanın için <ol><li> 96 oyuklu bir plaka içerisinde virüs seyreltmeleri hazırlanması <ol><li> sütun seyreltme plaka 1-11 içine 120 ul numune seyreltici (bölüm 1.2) koyun. </li><li> sütun 1 için ek 96 ul örnek seyreltici ekleyin. </li><li> Çözülme ve sonra bu virüsün 1:10 seyreltme verir sütunda 1. kuyuları çoğaltmak için 24 ul eklemeden önce virüs şişesini vorteks. </li><li> aktararak, örnek seyreltici içinde virüs seri 2 kat seyreltileri yapmakbirinden her iyi seyreltme için bir sonraki kullanarak temiz pipet uçları 120 ul. </li></ol></li><li> Bir Fetuin kaplı Plate virüs seyreltmeleri aktarın <ol><li> PBS-T (bölüm 1.6) ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve daha sonra herhangi bir aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine her plaka kurulayın. </li><li> fetuin kaplı plaka 11 sütun her bir kuyucuğa 1 Örnek seyreltici (bölüm 1.2.1) 50 ul ekle. </li><li> sütun 12 numune seyreltici 100 ul (Bu kuyular, negatif kontrol olarak) eklenir. </li><li> Aktarım sütun fetuin kaplı levhanın tekabül eden gözleri seyreltme plaka 1-11 seyreltilmiş virüs, 50 ul. </li><li> Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka daha sonra 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. </li><li> Geri kalan adımlar (16-18 saat sonra) yapılacaktır hangi zaman not alın. </li></ol></li><li> NA Tayini tamamlayın <ol><li> inkübasyon (16-18 saat) tamamlandığında, aktarmaktezgah plaka ve plaka mühürleyen çıkarın. </li><li> PBS-T (bölüm 1.7) ile plaka 6 kez yıkayın ve sonra ters ve emici kağıt havlu üzerinde pat tüm sıvı kuyulardan kaldırıldı sağlamak. </li><li> tüm oyuklara (1.5.3 belirlenen seyreltmede) 100 ul / oyuk PNA-HRPO solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin. </li><li> Kuluçka sonunda için az 15 dakika önce, Bölüm 1.7&#39;de tarif edildiği gibi, OPD solüsyon hazırlanır. </li><li> PNA-HRPO kaldırmak ve her kuyuya OPD substrat 100 ul eklemeden önce kuru leke test plakaları 3 kere yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> 100 ul / 1 N sülfürik asit ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> 0.1 saniye süreyle 490 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) ölçmek için, bir plaka okuyucu kullanarak. </li><li> Kaydedin ve tüm veri dosyalarını ihracat. </li></ol></li><li> Seroloji için kullanılır edilecek Virüs Seyreltme seçin <ol><li> OD 490 araziler bir grafik çizmek </sub&gt; Her virüs dilusyondaki değerleri. (Bu genellikle titrasyon eğrisinin başında bir plato karşılık gelen sinyal), minimum sinyal (arka plan kontrolü sağlamak plakanın 12. kolonunda hiçbir virüs içeren kuyu) maksimum sinyal tanımlamak için titrasyon eğrisini kontrol edin ve giriş seyreltme (eğrisinin, yani lineer bölge) ile orantılıdır OD neden virüs seyreltmeleri. </li><li> maksimum sinyal yaklaşık% 90 verir ve doğrusal aralıkta virüs seyreltme seçin. Seçilen seyreltme OD en azından arka plan sinyali daha fazla 10 kat olduğunu doğrulayın. Bu, özellikle virüs stokları kullanan tüm deneyleri için seçilen bir virüs seyreltme kullanın. Alternatif virüsün NA aktivitesini ölçmek ve ELLA 15-20 ~ μU NA faaliyet / ml kullanın: Not. </li></ol></li></ol> 3. Lektin Deneyi enzim-bağlanmış Not: Şekil 2 shoSeyreltme ve deney plakalarının setup ws. <ol><li> Numune seyreltileri yapmak <ol><li> buz üzerinde ısı ile inaktive örnekleri yerleştirin. Not: 8 sera, her plaka seyreltilebilir. </li><li> Bir plaka üzerinde 1:10 başlayan dilüsyonları kullanarak kurmak için, sütunlar 3-11 tüm kuyulara 120 ul örnek seyreltici ekleyin. </li><li> 2. sütun için, örnek seyreltici 216 ul her bir numune için 24 ul ekle. yukarı pipetleme ve 3 kez aşağı iyi numune karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın. </li><li> pipet uçları değiştirdikten sonra, aşağı yukarı pipetleme kuyu içeriğini karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın. </li><li> numunenin kadar adımı yineleyin 3.1.4 sütuna 11 devredilmiştir ve kalan 120 ul atılır. </li></ol></li><li> Fetuin kaplı Plate Örnekleri ve Virüs ekle <ol><li> Virüs, girdap bir şişe çözülme ve 2. adımda seçilen seyreltme de seyreltici (bölüm 1.2) virüs tekrar süspansiyon.4.2. Her bir deney plakası için virüsün en az 5 ml hazırlayın. Plakalar yıkanır ve serum numuneleri plakaya ilave edilinceye kadar buz üzerinde seyreltilmiş virüs tutun. </li><li> Deney için gerekli olan fetuin kaplı plakaların sayısına dair karar (genellikle plaka başına 4 sera uygulanır). PBS-T ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve sonra her plaka ters ve aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine leke. </li><li> sütun 2-11 yinelenen kuyulara seyreltme plaka her serum kontrolü veya dilusyonun 50 ul aktarmak için çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Negatif kontrol (sütun 12) dışında tüm oyuklara seyreltilmiş virüs, 50 ul ekle. </li><li> sütun 1 çukurlara örnek seyreltici 50 ul ilave edin ve kolon 12 örnek seyreltici 100 ul ilave edin. </li><li> Bir plaka kapatıcı ile kuyu Kapak ve yavaşça plaka kenarlarına dokunarak ya da 10 sn orta hızda bir plaka karıştırıcısı üzerinde koyarak karıştırın. </li><li> Bir humidif plaka koyun16-18 saat boyunca 37 ° C&#39;de ied inkübatör. </li></ol></li><li> PNA-HRPO ekleyin ve bölüm 2.3&#39;de anlatıldığı gibi tahlil tamamlamak </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Analiz Sonuçlarının Geçerlilik belirleyin <ol><li> Arka plan değerleri (hiçbir virüs) pozitif kontrol (virüs ve hiçbir serumu)% 10&#39;dan daha az olduğundan emin olun. </li><li> aynı koşullar kullanılarak farklı deneylerde kontrol serumları çalıştırmak titreleri medyan titreye 2 kat içinde olduğundan emin olun. </li><li> kontrol kuyuları bu OD ölçümleri (≤20% farklı) tutarlı ve yinelenen örnek kuyuların o OD ölçümleri (≤10% farklı) tutarlı onaylayın. </li><li> Geçersiz sonuçların kök nedenini belirlemek ve 4.1.1, 4.1.2 veya 4.1.3 listelenen kriterler, yerine getirilmediği takdirde tahlil tekrarlayın. Gidermek için çalışırken Tablo 1&#39;de sunulan faktörleri göz önünde bulundurun. </li></ol></li><li> % 50 uç nokta titerinin atama <ol><li> Her bir deney plakası, su içintüm okumalardan ortalama arka plan (oyuklara ilave hiçbir antijen) btract. </li><li> Formülü kullanarak her serum seyreltme de yüzde inhibisyon hesaplayın: 100 x (OD virüs yalnızca kontrol - OD test örneği) / OD virüsü sadece kontrol. </li><li> Maksimum sinyalin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır yüksek dilüsyon tanımlar. </li><li> % 50 uç-nokta titeri olarak seyreltisinin tersi bildirin. Not:% 50 inhibisyon herhangi seyreltme elde değil ise, titre, test edilen ilk seyreltme daha az, örneğin, &lt;10 01:10 test ilk seyreltme olduğunu. </li></ol></li><li> % 50 engelleyici konsantrasyonunun hesaplanması (IC50) <ol><li> Regresyon analizi gerçekleştiren bir program sonuçlarını aktarmak sonra tüm okumalardan ortalama arka plan çıkarma ve aşağıdaki gibidir: IC 50 titresi belirlemek için dört parametre lojistik regresyon kullanın. </li><li> Maksimum seti ile, doğrusal olmayan regresyon kullanınvirüs, sadece kontrolü ve minimum tam% 50 inhibisyon ile karşılık gelen seyreltmenin tespit etmek için, sıfıra ayarlanır. </li><li> IC50 titresi olarak seyreltisinin tersi bildirin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+of+antiserum+specific+for+an+influenza+virus+neuraminidase.">Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase.</a> J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).</li><li>Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibody+to+neuraminidase+on+the+maturation+and+hemagglutinating+activity+of+an+influenza+A2+virus.">Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus.</a> J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).</li><li>Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+specific+immunity+to+viral+neuraminidase+on+influenza+virus+infection+of+mice.">Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice.</a> J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).</li><li>Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+anti-neuraminidase+antibody+with+resistance+to+influenza+in+man.">Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man.</a> N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).</li><li>Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+assay+for+influenza+neuraminidase-inhibiting+antibodies+utilizing+reverse+genetics-derived+antigens.">A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens.</a> Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).</li><li>Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+anti-influenza+neuraminidase+antibody+using+a+peroxidase-linked+lectin+and+microtitre+plates+coated+with+natural+substrates.">Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates.</a> J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).</li><li>Couzens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+enzyme-linked+lectin+assay+to+measure+influenza+A+virus+neuraminidase+inhibition+antibody+titers+in+human+sera.">An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera.</a> J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).</li><li>Eichelberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparability+of+neuraminidase+inhibition+antibody+titers+measured+by+enzyme-linked+lectin+assay+(ELLA)+for+the+analysis+of+influenza+vaccine+immunogenicity.">Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity.</a> Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).</li><li>Westgeest, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+enzyme-linked+lectin+assay+suitable+for+rapid+antigenic+characterization+of+the+neuraminidase+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses.">Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses.</a> J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).</li><li>Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transfection+system+for+generation+of+influenza+A+virus+from+eight+plasmids.">A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).</li><li>Cate, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+dosage+influenza+vaccine+induced+significantly+more+neuraminidase+antibody+than+standard+vaccine+among+elderly+subjects.">A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects.</a> Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).</li><li>Couch, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+correlates+and+predictors+of+immunity+to+naturally+occurring+influenza+in+humans+and+the+importance+of+antibody+to+the+neuraminidase.">Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase.</a> J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).</li><li>Fritz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase-Inhibiting+Antibody+Response+to+H5N1+Virus+Vaccination+in+Chronically+Ill+and+Immunocompromised+Patients.">Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients.</a> Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).</li><li>Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+viruslike+particle+influenza+A+(H7N9)+vaccine.">A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine.</a> N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).</li><li>Monto, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+Influenza+Virus+Neuraminidase:+An+Independent+Correlate+of+Protection.">Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection.</a> J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).</li><li>Fritz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vero+cell-derived+whole-virus+H5N1+vaccine+effectively+induces+neuraminidase-inhibiting+antibodies.">A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies.</a> J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

enzim bağlı lektin deney serumunda NI antikor titreleri ölçmek için pratik bir yöntem. ELLA 1990 tarafından Lambre ve diğ., Tanımlanmış olsa da, standart serolojik test olarak kabul edilmesi klinik örneklerde 12-16 NI antikor titreleri ölçmek için tahlil yapmak sayıda laboratuarlar, daha yakın zamanda olmuştur. Bazı değişiklikler ölçülür NI titerleri için büyük bir etkisi olmadan protokol safhaları yapılabilir. Örneğin, PBS seyreltici olarak kullanılabilir, ancak önerilen tampon maddesi içinde, virüs titrasyon eğrileri (MES, pH 6.5) ve karşılaştırmak için çok yararlıdır, PBS bir karar verilmeden önce, bazı NA alt türleri önemli ölçüde enzim aktivitesi azalmış gibi pH değeri&gt; 7.0. Optimal pH kullanılmadığında, virüsün maksimum sinyal tahlilinde antijen (yani, virüs) aşırı bir miktarının kullanımı ile sonuçlanan, daha az olduğu; Bu koşullar altında, deney düşük bir duyarlılık gösterebilir. bazı hayırmuamele edilmemiş sera Ella test edilir, n-spesifik inhibisyonu gözlenir. Bu termal olarak β-önleyicileri varlığını gösteren, ısı (45 dakika boyunca 56 ° C) ile ayrıldı. Diğer spesifik olmayan önleyicileri (α ve γ-sınıfı) grip HA özellikle H3N2 virüsü hemaglütinasyon ve enfektivitesini ile ilgili olarak, tarif edilmiştir. H3N2 virüs NA kaynağı olarak kullanılmaktadır Gerçekte, spesifik olmayan inhibisyonunun Ella görülmektedir; Bu inhibisyon sıyalıdaz 9, küçük bir miktarı ile, serum numunelerinin işlenmesi suretiyle uzaklaştırılır. Diğer serolojik deneylerde olduğu gibi, negatif ve pozitif kontroller deney performansını değerlendirmek için bir araç sağlamak için her bir deneyde dahil edilmelidir. Tahlil kabul kriterlerini yerine getirmediğini zaman neden tespit edilmelidir. Tablo 1 sorunları gidermek için ele alınabilecek deneyde potansiyel adımların bir listesini sağlar. Ella protokol provBu raporda aryans NA kaynağı olarak, bir kuş gribi virüsünün HA köken ihtiva reassortant virüsleri kullanır. Bu bir izin düşük patojenik kuş virüslerinin ile çalışmak için gerekli olduğundan tahlil yapmadan bir sınırlama sunar. Onlar inaktive edildikten sonra H6Nx reassortant virüsler laboratuarlar arasında paylaşılabilir. Bu nedenle reassortant virüsü üreten laboratuvar inaktivasyonu tam olduğunu göstermiştir kez tahlil işbirlikleri yoluyla yapılabilir ve hazırlık onun NA aktivitesini korumuştur. H6Nx reassortant virüs kullanılarak kısıtlama NA bulaşıcı olmayan kaynaklar kullanılarak aşılabilir. Diğer virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) 15 kullanılmış Örneğin, Bazı laboratuarlar, yeniden birleştirici NA 17 arıtılmış kullanılmıştır. Ancak, rekombinant NA ne VLP&#39;ler ne hazır ve bu nedenle bir antijenik-uyumsuz kuş HA ile grip virüsleri kullanmaya devam. GelenekselNI, antikor titrelerini ölçecek bir yöntem çeşitli nedenlerden dolayı pratik değildir; En endişe renk reaksiyonu üretmek için gerekli olan zararlı kimyasallar bulunmaktadır. Buna ek olarak, numunenin büyük hacimleri gerekli ve tahlil gerçekleştirmek için hantal vardır. Bunun aksine, ELLA kolay uygulanabilir ve örneklerin arasında makul sayıda titrasyonunu sağlayan bir biçimde yer almaktadır. Ella değişkenlik göstermek olduğunu tahlil verimleri tekrarlanabilir sonuçlar 7,8 incelenen çalışmalardan elde edilen veriler. Ella dolayısıyla mümkün NI antikor titreleri rutin ölçümünü yaptı, ve o serolojik çalışmalar yürüten laboratuarlar tarafından daha sık kullanılan olacağı tahmin edilmektedir. Ella yaparken dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, UA aktivitesinin spesifik olmayan önleyicileri çıkarılmalıdır. Bu inhibitörler genellikle, ısıya ve 45 dakika boyunca 56 ° C&#39;de ısı işlemi ile yok edilir. Isıl işlem dışı speci temizlemek için yeterlidirH6 reassortant virüs NA kaynağı olarak kullanıldığı zaman H3N2 virüsleri Ella kullanıldığında FIC örneklerinden inhibitörleri, ancak, hemaglutinin bağlanan serum faktörler de ELLA müdahale ve sıyalıdaz küçük bir miktarı ile muamele ile çıkarılmalıdır tedavi 9 ısıtmak için önce. Bu tahlilin duyarlılığı azaltır İkinci olarak, antijen, örneğin, yeniden düzenlenmiş H6Nx virüs aşırı miktarda, kullanılmamalıdır. Virüsün dikkatli titrasyon nedenle önemli bir adımdır; Her bir deneyde kullanılan antijen miktarı de arka plan üzerinde olan bir sinyal sağlaması gerekir, ve titrasyon eğrisinin, yani lineer aralığında olmalıdır sinyali (optik yoğunluk) virüsü seyreltme ile orantılı olması gerekir. Rutin seroloji ek olarak, Ella mevsimsel grip virüslerinin UA arasındaki antijenik farklılıkları değerlendirmek için kullanılabilir. içerme a virüs suşları seçerken bu bilgiler çok yararlı olabilirs aşı adayları ve NA antijenik sürüklenme sonucu bağışıklık baskıların daha büyük bir anlayış kolaylaştıracaktır. Buna ek olarak, domuz ya da kuş gribi virüslerinden UA antijenik analizi ortaya çıkan suşlarının pandemik potansiyeli belirlenmesinde kritik bilgiler verebilir.

Nöraminidaz (NA) grip virüslerinin yüzeyinde eksprese edilen bir glikoproteindir. Bu enzim aktivitesi, enfekte olmuş hücreleri 1,2 yeni oluşan virüs partikülü için gereklidir. Aktivitesi Na önleyen antikorlar, hayvan modellerinde 3 virüs titrelerini ve hastalık belirtilerini azaltır ve insanlarda 4 hastalığa karşı direnç ile ilişkilidir. Geleneksel tahlil rutin seroloji için pratik değildir NI antikor titreleri ölçmek için, çünkü NA inhibisyonu (NI) titreleri aşağıdaki aşılama artış, bu nedenle ancak çok geçmiş grip immünojenite çalışmaları bu son nokta içermiyordu, aşının etkinliğinin bir göstergesi hizmet edebilir. NI titrelerini ölçmek için geleneksel bir yöntemdir yok 1 ile gliko yarılır sialik asit miktarının miktarının dayanır. genellikle thiobarbituric asit (TBA) yöntemi olarak adlandırılan bu yöntem, sialik ac dönüştürmek için tehlikeli kimyasallar kullanmaktadırspektrometresi ile tayin edilebilir bir kromofor id. Deney ayrı cam borular kullanılmaktadır, çünkü, örneklerin çok sayıda test deneyi hantal yapmak için uygun değildir. 96 gözenekli plakalara tahlilin minyatürleştirme, ancak bu deney de zehirli kimyasal kullanımı gerektirir ve bu nedenle ideal değildir, daha pratik bir biçimde 5 elde edilir. NI, antikor titrelerini ölçecek alternatif bir deney Lambre ve ark., 6 tarafından geliştirilmiştir. Bu deney, sialik asit Na tarafından serbest bırakıldığında açıkta kalır glikoproteinler, galaktoz sondan bir önceki şeker miktarı ölçülerek enzim aktivitesini ifade etmektedir. yer fıstığı aglutinini (PNA) galaktoz spesifik olarak bağlanan bu yana, bir PNA-yaban turpu peroksidaz (HRPO) konjügat kolorimetrik okunmasını elde etmek için kullanılabilir. ölçülen optik yoğunluğu numunede NA aktivitesi orantılıdır. NI titerleri yüksek dilüsyon saptanmasıyla ölçülürUA aktivitesinin en az% 50 inhibe eden serum. Bu enzim-bağlanmış lektin deneyi (ELLA) NA için alt-tabaka olarak, fetuin, yüksek glikosile serum proteini ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda yapılır. NI titreleri ölçen tahliller için önemli bir, NA kaynağıdır. Aşılanmış veya enfekte bireylerden elde edilen serumlar NA&#39;ya hemaglutinin (HA) için antikorlar gibi antikorlar içeriyor olmasıdır. HA bağlanan antikorlar NA aktivitesine müdahale edebilir ve bu nedenle, testte kullanılan gereken bir antijenik uyuşmayan HA ihtiva eden HA-özel antikorlarla spesifik olmayan inhibisyonu, arıtılmış, Na ya da bütün virüs önlemek için. Bu virüsler, klasik reassortment veya ters genetik ile üretilebilir; Amaç çalışılmaktadır virüsün hedef suşu ile ilgili olmayan bir alt tip HA içeren bir virüs kurtarmak için, ve NA. Bu makalede açıklanan tahlil dev tarafından oluşturulan influenza A virüsleri istihdaminfluenza A virüsleri, alt tipleri H1N1 ve H3N2 5&#39;ten alt tip H6 ve HA ve hedeflenen NA içeren genetik ERSE. ELLA tarafından oluşturulan Sonuçlar ve minyatür TBA deneyleri bu yöntemlerin benzer alt tip özgüllük ve duyarlılık 7 ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. ELLA tehlikeli kimyasalların kullanılmasını gerektirir ve bu nedenle NI titrelerini ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir etmez. Sadece birkaç adımda (Şekil 1), gerçekleştirilmesi kolaydır: Örnekler seyreltilir ve eklenen bir fetuin-kaplı plakaya virüsü (NA kaynağı) aktarılır. Plaka O / N inkübe ve PNA-HRPO eklemeden önce yıkanır. 2 saat inkübasyondan sonra, plaka yıkanmış ve peroksidaz substratı ilave edilir; Renk reaksiyonu durdurulur ve son olarak optik yoğunluk ölçülür NA aktivitesinin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır örnek inceltilmesi ile karşılıklı% 50 uç-nokta titeri olarak rapor edilir. Içi laboratuvar çalışması reproducibili değerlendirmek içinELLA Ty plaka-plaka değişkenliği az ve operatör için işleticinin tekrarlanabilirlik titresi 7 en fazla 2 misli farklar ile sonuçlandığını göstermiştir. Ella değişkenlik Bir sonraki arası laboratuar çalışması farklı laboratuarlarda yapılan ve bir standardın bu içerme ayrıca sonuçlarında 8 değişkenliği azaltabilir zaman tahlil iyi tekrarlanabilirlik sahip olduğunu göstermiştir. ELLA klinik öncesi ve klinik çalışmalara influenza aşısı 7 serum panelleri NI antikor titreleri ölçmek için uygun olan ve aynı zamanda influenza virüsleri 9 NBS arasında antijenik farklılıkları değerlendirmek için de kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">KPL</td>
			<td style="width:113px;">50-84-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;fetuin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3385</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5X MES, pH 6.5&#160;</td>
			<td>KD-Medical</td>
			<td>PBS-0134</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8327</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin PNA-HRPO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;L7759</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS-T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3563-10PAK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">o-Phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8287</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-citrate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4922</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258105</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well&#160; Maxisorp plates</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>439454</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well round bottom well plates</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>267245</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate sealers</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>14-245-192B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chicken eggs</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multichannel pipette</td>
			<td>Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf</td>
			<td>8 or 12 channel manual pipettem 50-250 &#181;l volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips</td>
			<td>Depends on pipettor brand</td>
			<td>Depends on pipettor brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader, with 490 nm filter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Victor V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">water bath set to 37 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">water bath set to 56 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigerator set to 4 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator set to 37 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

nöraminidaz antikorları (NA), grip virüsü bulunan en bol yüzey proteini, gribe karşı koruma doğru katkıda bulunur. Geleneksel yöntemler NA inhibe ölçmek için (NI) antikor titreleri rutin seroloji için pratik değildir. Bu protokol, enzim-bağlantılı lektin tahlili (ELLA), büyük bir glikoprotein alt-tabaka, fetuin ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda gerçekleştirilir NI titrelerini ölçmek için pratik bir alternatif metodu tarif eder. NA böler terminal siyalik fetuin gelen asitler, sondan bir önceki şeker açığa, galaktoz. Yer fıstığı aglutinini (PNA) bir kromojenik peroksidaz substrat ilave edildikten sonra, bir PNA-at turbu peroksidaz eşleniği kullanılarak belirlenebilir galaktoz özgünlük ve desialylation dolayısıyla ölçüde bir lektindir. ölçülen optik yoğunluğu NA aktivitesi ile orantılıdır. NI antikor titrelerini ölçmek için, seranın seri haldeki seyreltileri 37 ° CO inkübe edilir / sabit bir miktar O ile fetuin kaplı plakalar üzerine Kf NA. UA aktivitesinin ≥50% inhibisyonu ile sonuçlanır en yüksek serum seyreltisi karşılığı NI antikor titresi olarak belirlenmiştir. Ella influenza enfeksiyonu veya aşılamadan sonra insan antikor yanıtlarının rutin değerlendirilmesi için pratik bir format sağlar.

Bu makalede yer alan deney 2 96 çukurlu levha düzenini göstermektedir. Şekil 1 &#39;de şematik olarak gösterilen ve serum numunelerinin seri seyreltmeleri fetuin kaplı plakaya transfer etmeden önce bir seyreltme plakası hazırlanır olduğunu belirtir. deneyinin kritik bir parametre deneyinde kullanılan nöraminidaz miktarıdır; Bu reassortant virüsünün titrasyonu ile belirlenir. H6N1 ve H6N2 virüs titrasyon örnekleri arasında. Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir H6N1 1:10, 1:20 ve 1:40 seyreltileri ile optik yoğunluk şartları maksimum okuma elde edildiği gibi olduğu gösteren, benzer. Bir 1:80 seyreltmede, Okuması maksimumunun yaklaşık% 90 olmuştur ve bu nedenle, bu virüs dilüsyon takip eden deneylerde kullanıldı. Serum titrasyonları örnekleri, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Şekil bir insan serum numunesinin ti gösterirH6N1 ve H6N2 virüslere karşı trated. Her bir veri noktası serum seri seyreltmeleri ile elde edilmiştir NA aktivitesinin yüzde inhibisyonu göstermektedir; H6N1 deneyde ilk serum seyreltisi 1:80 idi; ≥50% inhibisyon ile sonuçlanır en yüksek dilüsyon NC NA / 99 (N1) karşı NI antikor titresi bu örnekte gösterilen serum titresi 640 olduğu H6N2 deneyde serum birinci seyreltme 5. oldu ve WI NA / 05 (N2) karşı 160. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> . Şekil 1. ELLA protokolünün şematik bir antijen (virüs) seyreltme (A) belirlenmesi tahlilinde (protokol aşama 2) &#39;de kullanılacak: virüs seyreltmeleri ile ölçülen bir fetuin kaplı plaka ve NA aktivitesi eklenir protokolün adım 2.3 de tarif edildiği gibi PNA-HRPO bağlanması ile terminal galaktoz artıklarını miktarının; (B </stron<html> Serum NI antikor titreleri (protokol adım 3) g&gt;) belirlenmesi. Örnekler seyreltilir ve daha sonra virüs ilave bir fetuin-kaplı plakaya aktarılır. Plaka O / N PNA-HRPO ekleyerek ve bir renk reaksiyonu oluşturmak için gerekli adımları tamamlamadan önce inkübe edilir. Son olarak, renk reaksiyon durdurulur ve optik yoğunluk ölçülür. NA aktivitesinin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanır dilusyonun karşılıklı% 50 uç nokta titresi olarak bildirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> Şekil 2 diyagram ELLA plakası ayarlamak gösterir. Serum örneklerinin seri seyreltmeleri bir seyreltme plakası olarak yapılmış ve daha sonra bir fetuin-kaplı plakaya aktarılır.<html> 3fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> H6N1 ve H6N2 virüsü titrasyonları Şekil 3. Örnek. H6N1 BR / 07 seri seyreltileri (A NA / Brisbane / / 2007 (H1N1) 59 mavi sembollerle gösterilmiştir) ile H6N2 UR / 07 (NA A / Uruguay / 716 / kırmızı sembollerin gösterilen 2007 (H3N2)) 18 fetuin kaplı plakalarda sıcak ve tarif edildiği gibi belirlenmiştir PNA-HRPO ile reaktivite için kuluçkalanmıştır. Ortalama 2 kuyu OD 490nm virüsü seyreltinin tersine karşılık karşısına yerleştirilmiştir. ELLA kullanım için seçilen H6N1 seyreltme 1:80 ve bu dilüsyonlar maksimum optik yoğunluk yaklaşık% 90 ile sonuçlanmıştır ve lineer aralığında olduğu için seçilen H6N2 seyreltme 1:40 idi.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> N1 NA (kırmızı semboller) ve N2 karşı serum (mavi semboller) alt tipleri Şekil 4. Titrasyon. NA engelleme titreleri reassortant virüslere karşı ölçüldü H6N1 NC / 99 (içerdiği A NA / Yeni Kaledonya / / 1999 20 (H1N1) ) ve H6N2 WI / 05 (içerdiği A NA / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). serum seri seyreltmeleri için yüzde enzim inhibisyon% 50 inhibisyon gösteren kesikli yatay çizgi ile gösterilmiştir. A UA karşı NA inhibisyon titreleri / Yeni Kaledonya / / 1999 20 (H1N1) (NC / 99) ve A / Wisconsin / 67/2005 2 9.3 (640) ve 2 7.3 idi (WI / 05) (H3N2) ( 160), sırasıyla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">daha büyük bir ettik görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın rsion. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası neden (ler) </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td> Zayıf sinyal veya virüs titrasyon ulaşılan hiçbir yayla </td><td> i) düşük NA enzim aktivitesi ii) virüs stok optimum koşullarda saklanmayan </td><td> i) seyreltici NA aktivite için en uygun olan pH değerine sahip olduğunu teyit; pH değeri en uygunudur ise, yeni bir virüs stoku hazırlamak veya virüs konsantre ii) regrow ve kısım stok; -80 ° C depolamadan önce kuru buz üzerinde ek-freeze küçük şişeler </td></tr><tr><td> pozitif hücre kontrol kuyuları Zayıf ya da hiç renk </td><td> i) Virüs seyreltme yanlış atanmış Dondurulmuş virüsü alikotları ii) Flakon-to-vial değişkenliği iii) PNA- HRPO denatüre ya da çok fazla seyreltildi iv) OPD yanlış hazırlanan </td><td> ben); Tekrarlama virüs titrasyonu ii) değişkenlik olmadığından emin olmak için aynı partiden birkaç şişeleri titre edilir. önemli değişkenlik varsa, taze alikotları hazırlamak iii) PNA- HRPO retitrate optimum virüsü hazırlanan çözeltisi iv) OPD taze hazırlanması tekrarlayın </td></tr><tr><td> Pozitif kontrol serumları ile zayıf veya hiç engelleme </td><td> Deneyde kullanılan I) &#39;in çok fazla virüs ii) Serum kötüleşti </td><td> i) tekrar virüs titrasyon ii) yeni antiserumlar Kontrol saklama koşulları elde </td></tr><tr><td> Negatif kontrol serumları ile Engellenmesi </td><td> Serum i) yetersiz ısı işlemi Deneyde kullanılan ii) çok az virüsü </td><td> i) serum ısı inaktivasyonu tekrar ii) tekrarlayın virüs titrasyonu </td></tr><tr><td> yüksek arka plan </td><td> plakaların i) Olası bulaşma ii) PNA- HRPO konsantrasyonu çok çok yüksek / düşük </td><td> i) yeni kaplanmış plakalar kullanılarak tekrar ii) kullanmak için doğru seyreltme belirlemek için PNA-HRPO titre </td></tr><tr><td> Virüs titrasyonu düşük sulandırmalarda NA aktivitesinin belirgin inhibisyon göstermektedir </td><td> i) alantoik akışkan NA için alt-tabaka içerebilir </td><td> Bir sakroz yastığı yoluyla topak haline edilmiştir ii) Kullanım virüsü </td></tr></tbody></table> Performans kriterlerine uymayan tahlillerin Tablo 1. Kök neden analizi. Bu tablo, Ella gerçekleştirirken oluşabilecek sorunlar için olası nedenleri ve çözümler sunmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay at JoVE.com

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

measuring-influenza-neuraminidase-inhibition-antibody-titers-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Görüntüleme.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Video: Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...