Bu çalışma NIH hibe EY019312 ve EY021126 (VJK), Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı ve Görsel Bilimler EY002687 tarafından desteklenen ve Araştırma tarafından Körlük Önlemek için.

Tüm deneysel protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Washington Üniversitesi&#39;nde kurumsal Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Perfüzyon ve Numune Tutucu Kurma <ol><li> Deney gününde taze retina perfüzyonu için çözelti hazırlayın. Distile ve deiyonize su kullanın. Aşağıdaki üç çözümlerden birini kullanın. <ol><li> , Medya ve NaHCO 3 1.9 g &#39;Ames 1 şişe (1 L) çözeltisi&#39; Ames bikarbonat içeren hazırlanması </li><li> (MM olarak) Locke çözeltisi hazırlayın: 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl2, 1.2 CaCl2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO 3, 3.0 Na süksinat, 0.5 Na glutamat, 0.02 EDTA ve 10.0 glikoz,% 0.1 MEM vitamin ve amino asitler </li><li> (MM olarak) Hazırlama HEPES-tamponlu Ringer solüsyonu: 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl2, 1.0 CaCl2, 10.0 glikoz, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH1 M NaOH 5,8 mi ~ ile 7.5&#39;e ayarlandı, 0.72 g / L kültür ortamı Leibovitz L-15 ekleyin. Herhangi bir perfüzyon medya ile fotoreseptör yanıtı izole etmek için 100 mcM BaCl 2 - 50 mcM DL-AP4 ve 50 - 20 kullanın. </li></ol></li><li> (MM olarak) elektrot 28 için çözelti hazırlayın: 140.0 NaCl, 3.6 KCl, CaCl2, 3 HEPES, 0.01 EDTA 2.4 MgCl2, 1.2 ve 7.4 pH ayarlamak - NaOH ile 7.5 olarak değiştirilmişti. Elektrot çözeltisi bir kaç ay için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li><li> Hazırlayın ve numune tutucu test edin. <ol><li> Numune sahibinin taban kısmının kubbelerin üstünde siyah / gri filtre kağıdı Tutkal (Şekil 1A bakınız). Kubbelerin düz üstleri kenarlarda dikkatlice iki bileşenli 5 dk epoksi tutkal sürün. Gerekirse, diseksiyon mikroskobu altında bunu. </li><li> Tutkal neredeyse kuru (yaklaşık 4 dakika) kadar bekleyin ve düz öğesini kullanarak kubbe üzerinde filtre kağıdı bastırın. Tutkal filtre kağıdı deneyden önce en az bir gün.Filtre kağıdı, birden çok kez kullanılabilir ancak kayıtların bir ay sonra değiştirilmelidir. Yedek kağıt yüklemeden önce herhangi bir yapışkan kalıntısı dikkatlice kubbeleri temizlemek için% 70 etanol kullanın. </li><li> Elektrot çözelti hava kabarcıklarını önlemek ve elektrot kanallarına dişli adaptör ile kapalı pelet elektrotlar (Şekil 1A ve B) vida çalışıyor elektrot kanalları doldurun. Dört vida ile numune tutucu üst ve alt parçaları bağlayın ve elektrot çözeltisi ile perfüzyon çizgileri doldurmak. </li><li> Multimetre (Şekil 1B) kullanarak her bir elektrot çiftinin uçları arasındaki direnci ve voltajı ölçün. Direnç 100 Ωk ve 10 mV altında geriliminin kanalları kabarcık-ücretsiz ve elektrotlar iyi şartlarda iseniz altında olmalıdır. </li></ol></li><li> Cam şişe perfüzyon medya 700 ml - 400 dökün. Başka bir 300 mi retina ve s diseksiyon kullanılacak AyrıBir buzdolabına yırttı. Eşanjör bloğunda perfüzyon tüp ayarlayın ve ısıtıcı plaka üzerinde ısıtılmış blok yerleştirin (Şekil 1D bakınız). </li><li> (Şekil 1D bakınız) (Ames &#39;ya da Locke kullanılması durumunda) bağlantıları 2 / O 2 gazı CO olan bir kapakla şişe ve perfüzyon tüp için sarmalar. 37 o C medya ile şişeyi Onceden ve ısıtma plakası veya 37 ayarlanmış su banyosunda hafif stimülasyon birimi üzerine yerleştirin - 39 o C 17. <ol><li> Prime yerçekimi ile çalışan akmayı başlatmak için perfüzyon ortamı ile doldurularak perfüzyon hattı. <ol><li> LKC sisteminde, daha sonra deney sırasında şişede perfüzyon çözeltisi düşürücü seviyesi etkilenmeden akış hızı regülatörü ile ayarlanır önemli bir yer çekimsel bir akış sağlamak için stimülatör ünitesi 17 üzerine şişe yerleştirin. </li><li> Ocuscience sisteminde, s yernumune tutucu uzun perfüzyon çıkış hatları gürültüyü en aza indirmek ve yerleştirmek amacıyla Faraday kafesi içinde erfusion şişe çözümünün yerçekimi sürücü artırmak için de numune tutucu (ve perfüzyon şişesinin) seviyesinin altına (adım 2.8 bakınız). Bu çıkış hatlarını koruyun ve ERG sinyal elektromanyetik gürültü bağlanmasını engellemek için amplifikatörün toprağa kalkanı bağlayın. </li></ol></li></ol></li><li> Debi regülatörleri kullanarak / dk 5 ml - 3 perfüzyon ayarlayın. Doğru regülatör ile bir silindirden% 5 CO 2 /% 95 O 2 gazı bağlayın ve bir hava taşı ile şişe medyanın sürekli köpüren sağlamak için akış hızını ayarlayın. </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> Düz kanatlı microscissors, bir ya da iki 45 o cımbız, jilet ve filtre kağıdı dikdörtgen bir parça da dahil olmak üzere, temiz ve keskin diseksiyon aletleri birleştirin. </li><li> Soğuk perfu yaklaşık 200 ml dökünbüyük bir Petri kabındaki yon çözeltisi (kubbe dahil olmak üzere), numune tutucu bütün alt kısmı çözeltisi içine daldırılmış şekilde. Kubbelerin üzerindeki retina monte ederken Bu adım önemli hale (adım 2.6 bakınız). Bazı çözeltiler karbojen (% 5 CO 2/95% O x 2), doymuş üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu diseksiyon amaçları için gerekli değildir ve burada tarif edilen deneylerde yapılmadı. </li><li> Kayıtların önce 12 saat - Tipik bir deney için, aydınlık / karanlık döngüsü ve 6 onları koyu adapte 12/12 saat içinde hayvanlar tutmak. (Mikroskop ışık kaynağının önünde, örneğin kırmızı filtre kullanın) loş kırmızı ışık altında servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 inhalasyon yoluyla hayvan Euthanize ve loş kırmızı veya kızılötesi ışık altında aşağıdaki işlemleri yapmak. <ol><li> Cımbız kullanarak gözleri dışarı çekin ve medya koyun. Kağıt (örneğin, bazı düzenli filtre kağıdı) küçük bir parça üzerinde bir seferde bir göz yerleştirin ve olarak yapmakCımbız ile göz (bu burada çözümün dışında yapılır) tutarken ora serrata düzeyinde yaklaşık yaktı. </li></ol></li><li> Ora serrata boyunca kesin (ya da yakın gözün ekvatora) microscissors ve kornea ve lensi çıkarın. Büyük Petri kabındaki soğuk medyada göz fincan koyun ve diğer gözle aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Mümkün olduğunca sağlam olarak retina tutmak için retina ve sklera arasındaki makas tutarak optik sinir doğru göz fincan üstünden küçük bir kesi kesin. Kavrama iki cımbız kullanarak ve retina ayırmak için birbirinden uzakta cımbız çekin tarafından kesi her iki taraftan sklera. <ol><li> Optik siniri kesin ve uzak yüzeye fiziksel temas minimum miktarda retina izole etmeye çalışın. RPE çoğunlukla diseksiyon işlemi sırasında retina otomatik olarak ayırmak olacaktır. Bu gerçekleştirmek için daha retinanın mekanik rahatsızlık önlemek için daha önemlidirDiseksiyon hızlı bir şekilde, genel olarak retina yanıtı özellikleri üzerinde önemli etki olmadan çözelti içinde en az 30 dakika inkübe edilebilir. </li></ol></li><li> Numune tutucu (Şekil 1C) kubbe üzerinde retina monte edin. Disseke retina ile Petri kabındaki numune tutucu alt kısmını daldırın. Kubbenin üzerindeki retinayı yukarı fotoreseptör tarafı (izole retinanın dışbükey yüzeyi), Slayt ve retina filtre kağıdı üzerinde verdiği, böylece numune tutucu kaldırın. Diğer retina için aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Elektrik retina arasındaki karışma yanı sıra gürültü ve sinyal şant önlemek için dikkatli bir şekilde tutucu plakayı kurutun. Numune tutucu tutucu alt ve üst parçaları arasındaki çözüm dökülme önlemek için yanı sıra bireysel retina fotoreseptör ve ganglion hücre tarafı elektrik izolasyonu yardım etmek için alt kısmı kubbe etrafında O-halkalarını vardır. (Dört vida ile sahibinin üst kısmını takınŞekil 1B) ve bir şırınga ve iğne kullanılarak perfüzyon çözeltisi ile perfüzyon kanalları doldurun. </li><li> Isı değiştirici blok sonraki numune tutucu aktarın ve numune tutucu (Şekil 1D) giriş ve çıkış perfüzyon hatlarını bağlayın. (Üst elektrotlar amplifikatör toprak / eksi pin bağlantı) ERG amplifikatör elektrotlar bağlayın ve bir adaptör kullanılarak numune tutucuya stimülatörü / kontrol ünitesi takın veya bağlı stimülatörü ünitesine ısıtma yastığı kaydırın in vivo hangi ERG sistemi kullanılmaktadır. </li></ol> 3. Kayıtlar <ol><li> In vivo sistemin yazılımını kullanarak amplifikatör ve uyarıcı ayarlarını yapılandırın. 300 Hz filtreleme 1 ile 10 kHz ve low-pass arasında bir değere satın alma frekansını ayarlayın. Yüksek geçiren filtreleme kullanmayın. 60 Hz (veya Avrupa&#39;da 50 Hz) Gerekiyorsa filtreyi çentik kullanın. </li><li> Işık uyarımı ve zekâ olmadan Tutanak temelh loş stimülasyon (örn., -35 dB veya 0.3 mCd şiddetindeki sm -2 yeşil ışık) elektrotlar ve retina örnek arasında iyi elektrik bağlantısı için test etmek. Retina sıcaklık ve fonksiyon istikrarlı duruma ulaşması ve böylece veri toplama başlamadan önce 20 dakika - 10 bekleyin. <ol><li> Herhangi bir özel deneye göre uyaran parametrelerini seçin ve veri toplama başlar. Örneğin, 0 dB kadar ya da 0.1 1.000 kadar mCd şiddetindeki sm den -40 yeşil ışık kullanmak -2 bir skotopik yanıt aile için. Çubuklar arka plan ışığı tarafından bastırılmış gereken Fotopik kayıtlarda yaklaşık 2 parlak log-birimleri 3 yanıp söner kullanın (3-30 Cdm -2) ya da bir prob flaş (-2 = 1 dB yaklaşık 1.3 Cd sm, bakınız Şekil 3). </li><li> Ancak, tam ışık şiddeti değerleri sistem kalibrasyonu ve deneysel koşullara biraz bağımlı olabileceğini unutmayın. Genel bir kural olarak, aşağı 5 ölçek yoğunlukları - 10 kat in vivo karşılaştırıldığında </em&gt; kayıtlar yeşil ışık 17 kullanarak. (Ticari bağdaştırıcı sistemine dahil) retina üzerinde delikler olan bir siyah kapağı numune tutucu ışık saçılması: azaltmak ve in vivo sistemler ticari Ganzfeld çevrede her iki retina homojen ve eşit bir uyarım kolaylaştırmak için kullanılabilir. NOT: koyu adapte retina kayıtları, tipik bir deney ağartıcı pigment sadece önemsiz bir kısmını kullanılan test yanıp söner yoğunlukları böylece RPE odaklı rejenerasyon eksikliği söz konusu değildir. Buna ek olarak, daha önce koni pigment rejenerasyon hala Müller hücresi görsel döngüsü 20 üzerinden izole retinada yer alabilir gösterilmiştir. </li></ol></li><li> Deneyler birkaç saat 30 dakika kadar tipik son gibi bu değişiklikler teknik sorunlara işaret edebileceğiniz gibi, deney sırasında bazal sürüklenme, gürültü seviyesi ve yanıt istikrarı izlemek. NOT: Artan gürültü ya da azalmad tepki genlikleri hava perfüzyon veya elektrot kanalları kabarcıklar, çok düşük ya da yüksek sıcaklık, çözüm sızıntı / dökülme veya retina deplasman gösterebilir. </li></ol> 4. Temizlik <ol><li> Perfüzyon hatları numune tutucu ayırın açın ve filtre kağıdı retina yıkayın. Elektrotları çıkarın ve damıtılmış su (etanol kullanmayın) ile durulayın. Etanol ve / veya distile su ile (perfüzyon kanalları dahil) numune tutucu temizleyin. Dikkatlice yıkayın perfüzyon boru 70&gt; ile% etanol. </li><li> Damıtılmış su (deterjanlar kullanmayın) ile perfüzyon şişesini durulayın. Etanol, aynı zamanda şişe temizlemek için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Armington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Electroretinogram. , (1974).</li><li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities.">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).</li><li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve.">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li><li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave.">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li><li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity.">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li><li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina:+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram.">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs.">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li><li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium:+origin+of+the+electroretinogram+c-wave.">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li><li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bovine+arterially-perfused+eye:+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP,+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature.">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+(Rana+temporaria).">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li><li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog.">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li><li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+adaptation+in+toad+rods:+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium.">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li><li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina.">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li><li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system.">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li><li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells.">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li><li>Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+(glial)+cells+in+the+toad+retina.">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li><li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina.">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina.">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model.">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina.">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li><li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse:+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments.">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li><li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG.">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li><li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+protocols+alter+phototransduction:+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold.">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy.">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors.">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li><li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors:+adaptation,+noise,+and+kinetics.">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

St Louis Washington Üniversitesi Xenotec, Inc. ile bir lisans anlaşması olan ve ex vivo adaptörün satışından elde bir telif alabilirsiniz.

<html> Biz burada bir ex vivo ERG adaptörü ile birlikte in vivo ERG sistem bileşenlerini kullanarak iki izole fare retina aynı anda yüksek kaliteli ex vivo ERG kayıtları elde etmek için kritik adımlar göstermektedir. Bu çalışmada, aynı solüsyonu (ya Ames &#39;, Locke ya da Ringer) ile hayvandan her iki retina perfüze ama uyuşturucu test amaçlı, farklı bir çözüm örneğin her retina serpmek de mümkündür. yüksek kaliteli veri elde etmek için en önemli adımlar, gelişmiş bir ısmarlama numune tutucu kullanarak ve loş kırmızı (veya IR) altındaki tüm numune hazırlama prosedürlerini uygulayarak elektromanyetik gürültü, retinanın dikkatli diseksiyon, istikrarlı ve nispeten hızlı perfüzyon akışı koruyucu vardır Işık. Burada tarif edilen yöntem, in vivo ve ex vivo ERG kayıtları gerçekleştirmek için iki retina ve bir in vivo ERG kurulum çift kullanım anında kullanımına izin verir. _content &quot;&gt; geçenlerde bizim 17 tarafından tasarlanan ve halen piyasada mevcut ısmarlama ex vivo ERG numune tutucu, proksimal ve retinanın uzak bölgelerinde verimli elektrik izolasyonu ile SNR geliştirir ve retina (yüksek çözüm kur üzerinde perfüzyon akışını optimize .) ex vivo ERG sinyal yavaş frekanslı gürültü bileşenlerinin olmaması çok küçük yanıtlardan bile nicel analiz sağlar Ancak, bu ex vivo kayıt AC güç hattı gürültü (ABD&#39;de 60 Hz girişime daha eğilimli olduğunu gördük;. 50 in vivo deneyler Avrupa&#39;da daha Hz). esas olarak perfüzyon hattı boyunca sinyale bağlanmış Bu gürültü ve çoğunlukla Faraday kafesi ya Ganzfeld kürenin dışında bulunan) bir şişe, tüp (koruyucu (ve topraklama) Tüm perfüzyon parçaları çıkarılabilir olabilir . Buna ek olarak, zaman zaman 60 Hz gürültü ısı eşanjöründen ex vivo ERG sinyali ile birleştirilir ve bu gürültü, aynı zamanda topraklama ile çıkarılabilir. &lt;/ P&gt; Biz üç farklı fizyolojik perfüzyon ortamına (Şekil 2) ile aynı retina / deneyde farklı hücre tiplerinin fonksiyonu diseksiyonu sağlayan deney sırasında perfüzyon içine farmakolojik blokerleri ekleyerek belirli ERG sinyal bileşenleri kaldırmak için nasıl gösterilmektedir. Yeni yapılan bir çalışmada perfüzyon medya seçimi tek hücre kayıtları 32 fotoreseptör fizyolojisini etkilediğini göstermiştir. Burada yokluğunda ve ERG sinyal (Şekil 2) fotoreseptör bileşenini izole etmek amaçlı farmakolojik reaktiflerin varlığında koyu adapte flaş yanıtları kaydetmek için Ames &#39;, Locke ve&#39; HEPES-Ringer &#39;medya kullanıldı. Bikarbonat tamponlu çözümler mV 1&#39;e kadar, daha geniş a- ve b-dalgası genlikleri verdi. Bloker Locke&#39;un ortamı altında fotoreseptör loş flaş yanıtları AmesR ile görülmedi karmaşık kurtarma dalga formu (Şekil 2D inset bakınız) içeriyordu17; veya Zil perfüzyon. Ex vivo ERG kullanımı daha laboratuarlar tarafından uyarlanmış olur zaman farklı sinyal bileşenlerini izole etmek için aynı perfüzyon medya ve standart yöntemleri kullanmak yararlı olacaktır. Bu noktada o kararlı ve büyük a- ve b-dalgası genlikleri verir çünkü çok yönlü bir seçenek Ames &#39;orta görünüyor. Buna ek olarak, fotoreseptör tepkisi, izole edilmiş bir farmasötik olarak, bu çözelti içinde tek fotoreseptörlerin (Şekil 2E) için kaydedilen andıran basit bir dalga biçimine sahip olduğu görülmektedir. Ancak bazı açık sorular in vivo koşullarda gözlenen diğer ERG sinyal bileşenlerinin varlığı hakkında kalır. Tipik bir in vivo ERG yanıtı b-dalga yükselen fazında gözlenen 150 Hz salınan dalgalar - Örneğin, ex vivo kayıt koşullarına biz önde gelen salınım potansiyeller, 100 görmedim. Bu nedenle mümkün olduğu bizim ex vivo iç retina fonksiyonu </eBüyük ex vivo b-dalgalar bipolar hücre fonksiyonu AÇIK yaşayabilir karıştığı rağmen m&gt; durumlar tatlıya bağlandı. Gelecekteki çalışmalar burada gösterilen deneysel protokollerde değişiklikler (diseksiyon, perfüzyon vs.) bizi ex vivo koşullarda salınım potansiyelleri kaydetmek için izin edip çözmelidir. Koni fonksiyonu vizyonumuzun için hayati önem taşımaktadır. Ancak, koni soruşturma, özellikle 33 retina fare kendi küçük boyutu ve kıtlık nedeniyle engellenmektedir. Onların M-koni ve çubuk hemen hemen aynı spektral hassasiyetleri 30 çünkü koni fonksiyonunun İzolasyon fare ERG kayıtları daha karmaşıktır. Standart protokoller çubuk bastıran arka plan ışığı kullanarak çubuk ve koni duyarlılıkları arasındaki birkaç günlük birimi farkından yararlanmak. Ancak, sabit arka plan ışığı çubuklarını 34,35 duyarsız ve çubuk ve koni arasındaki boşluk kavşak kaplin modülasyonu yoluyla muhtemelen koni işlevini etkilediği bilinmektedir &lt;sup&gt; 36,37. Böylece, koniler etkilemeden doymuş çubuklar tutmak için yeterince parlak bir arka plan ışık yoğunluğunu bulmak zor. Burada düşük hassasiyet ve koni 19,29,30 hızlı iyileşme kinetik hem yararlanır alternatif çift flaş yöntem ortaya koymaktadır. Bu şekilde, gerçek-karanlık adapte koni aracılı yanıtları izole etmek daha kolaydır. Biz Ames &#39;ya da herhangi bir bloker olmadan Locke&#39;un çözümleri, kurtarma dalga detayları biraz parlak prob ve test yanıp söner kullanımı ile deney sırasında etkilendiğini fark ettim. Bu koni yanıtları izole etmek için çıkarma analizi karmaşık. Bununla birlikte, baryum ile glial öğenin çıkarılması değişkenliği Müller hücre bileşenine bağlı olduğunu gösteren tepkilerinin kuyruk stabilize yardımcı oldu. Bu şekilde, WT farelerinde (Şekil 3), koyu adapte koni tahrik yanıtlar elde etmek mümkün olmuştur. Çift flaş ile izole koni yanıtlarıÇubuk aktivitesi 17,37 bastırmak için arka plan ışığı kullanarak WT farelerden kaydedilen kıyasla olarak WT farelerden tekniği küçük ortaya çıktı. Bu fark, yavaş yavaş (en az 10 olan) muhtemelen konik tepkilerinin 37-39 çubuk aracılı bastırılması kaldırılması konik tepki genlikleri artırır Arka ışığın iyi karakterize edilmiş bir etkisi ile açıklanabilir. Özetle, burada gösterilen yöntem retinanın işlevini incelemek mümkündür ex vivo elektrofizyolojik kayıtlar yapar. Gelecekte, daha birçok laboratuarlar, hayvan ve insan retina fizyolojisi ve patolojisi incelemek için bu güçlü bir yöntem adapte olacaktır ve retina fonksiyonun anlayışımızı ilerletmek için ve hastalıkları kör için daha iyi tedaviler geliştirmek umuyoruz.

Elektroretinogram (ERG) ışıkla tetiklenir retina elektriksel aktivitesi kaydetmek için kullanılabilen bir köklü bir tekniktir. ERG sinyal retinanın rezistif dışı uzayda akan radyal akımların neden olduğu gerilim değişiklikleri (fotoreseptör ve bipolar hücrelerin ekseni boyunca) ağırlıklı olarak üretilir. İlk ERG sinyali bir balık gözü 1 yüzeyinden Holmgren, 1865 kaydedilmiştir. Einthoven ve Jolly 1908 2 b-, a- denilen üç farklı dalgaların içine ışık başlangıcından ERG yanıtı, ve c-dalgalar, şimdi bipolar hücreler ON fotoreseptör esas aktivitesini yansıttığı bilinmektedir ve pigment epiteli bölünmüş Hücreler sırasıyla 3-8. ERG, yerel (mikroelektrotla (ex vivo) izole sağlam retina arasında, izole edilmiş bir göz Hazırlama 9&#39;da elde edilen, anestezi uygulanmış hayvanlar ya da (in vivo) insan gözüyle 3,10-15 ya arasında belirli bir retina katmanları kaydedilebilirERG) 4,16. Bunlardan in vivo ERG şu anda retina fonksiyonunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu teşhis amaçlı kullanılabilir veya hayvanlarda veya hastalarda retina hastalıklarının ilerlemesini takip etmek invaziv olmayan bir tekniktir. Ancak, in vivo ERG kayıtları genellikle ekstraoküler fizyolojik gürültü (örneğin, solunum ve kalp aktivitesi) ile kirlenmiş, birkaç örtüşen bileşenleri ile karmaşık bir sinyal üretmek. Yerel ERG retina spesifik katmanlar arasında sinyalini kaydetmek için kullanılabilir, ancak, en invaziv ve diğer ERG kayıt konfigürasyonları ile karşılaştırıldığında düşük bir sinyal-gürültü oranı (SNR) sahip olmasıdır. Yerel ERG ayrıca teknik olarak ve pahalı donanımları (örn mikroskop ve mikromanipülatörler) gerektirir. Sağlam, izole retina gelen Transretinal ERG (ex vivo ERG) istikrarlı ve HIG izin in vivo ve yerel ERG yöntemleri arasında bir uzlaşma sunuyorhayvanlar ya da insanlar 17 sağlam retina h SNR kayıtları. Son zamanlarda, bu yöntem, memeli primat ve insan retina 18-20 çubuk ve koni fotoreseptör fonksiyonunu incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo olarak, retina pigment epiteli olmaması, ERG sinyalinin pozitif Cı dalga bileşeni çıkarılır ve önemli bir negatif yavaş PIII bileşeni ex vivo kayıtları ortaya çıkar. Yavaş PIII bileşeni retina 21-23 Müller glia hücrelerinin aktivitesi kaynaklı gösterilmiştir. Bu nedenle, ex vivo olarak ERG yöntemi de sağlam retinada Müller hücreleri incelemek için kullanılabilir. Çeşitli çalışmalarda da bu ex vivo ERG kayıtları retina 24 civarında farmakolojik ajanların konsantrasyonu ölçmek ve uyuşturucu 25-27 güvenliğini ve etkinliğini test etmek için kullanılan olabilir göstermiştir. In vivo sistemlerde birden fazla ticari mevcuttur vemutlaka geniş elektrofizyoloji altyapıya sahip olmayan birçok laboratuvarlarında kullanılan. Buna karşılık, ex vivo cihazlar son zamanlarda 17 kadar ve sadece çok az laboratuarlar anda bu güçlü tekniği yararlanarak bir sonucu olarak mevcut olmamıştır. Bu retina fizyolojisi ve patolojisi hakkında bilgimizi ilerletmek ve hastalıkları kör için yeni tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla laboratuvarlara ex vivo ERG kayıtları kullanılabilir hale getirmek için yararlı olacaktır. Burada, bir basit ve uygun fiyatlı bir ex vivo ERG aygıtı 17 göstermektedir ve bu çubuk ve koni aracılı sinyal kaydetmek için çeşitli ticari olarak temin edilebilir, in vivo ERG sistemleri ile kombinasyon halinde kullanılabilir göstermek (a- ve b-dalgası) ve fonksiyonu görmemiş vahşi tip fare retinaları Müller hücrelerinin (PIII yavaş).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>HMsERG</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>LKC Technologies</td>
			<td>UTAS-E 3000</td>
			<td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex vivo adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>Ex VIVO ERG adapter</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>North Central Instruments</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;idCategory=27">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR emitter</td>
			<td>Opto Diode Corp.</td>
			<td>OD-50L</td>
			<td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prowler Night Vision Scopes</td>
			<td>B.E. Meyers Electro Optics</td>
			<td>D4300-I</td>
			<td>Military grade product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red filter</td>
			<td>Rosco Laboratories</td>
			<td>Roscolux #27 Medium Red</td>
			<td>May be used instead of IR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red head light</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>ERGX011</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>500086</td>
			<td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers #5</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Metler Toledo</td>
			<td>AB54-S/FACT</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter and electrode</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>pHI 350</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60129</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63020</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>101</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>224731</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2834</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz culture medium L-15</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN3156</td>
			<td>5% CO2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Bu koyu adapte yabani tip flaş yanıtları kaydedildi deney protokolleri farklı standart perfüzyon için solüsyonlar (Şekil 2) ile, yukarıda tarif edilen ve Şekil 1 &#39;de gösterilen izleyerek (WT), C57BL / 6 fare retinaları. tepki dalga ve kinetik yanı sıra çubuk fotoreseptör duyarlılığı Ames &quot;ve Locke&#39;un medya (Şekil 2A ve B) benzer çıktı. Öte yandan, HEPES-tamponlu Ringer çözeltisi (Resim bikarbonat ya da% 5 CO 2/95% O 2) altında tepki genlikleri, anlamlı daha küçük. Biz de bu koşullarda b-dalgası istikrar tatlıya bulundu. 40 uM APB ekleme (DL-AP4) her üç medya (Şekil 2D-F) verimli pozitif B-dalga kaldırıldı. B- dalga çıkarılması Müller hücre aktivitesi 21 atfedilmiştir büyük yavaş negatif dalga (Şekil 2D) saptandı. Ekleme 100# 956; baryum M ex vivo ERG sinyali (Şekil 2D-F) fotoreseptör yanıtını açığa Bu bileşeni kaldırıldı. Maksimum tepkiler Ringer perfüzyon altında yaklaşık 200 mV tipik oysa biz Ames &#39;ve Locke 1 mV doymuş fotoreseptör yanıtları kadar kayıt olabilir. Koni fotoreseptör yanıtları kozalakları onların koyu adapte devleti restore ama çubuklar 19,29 doymuş kalır zaman çubuklar doyurarak parlak bir prob flaş bir anda bir test flaş izler sözde çift flaş tekniği daha önce izole edilmiştir. Burada çift flaş tekniği (Şekil 3) kullanılarak 100 baryum uM değil DL-AP4 ile desteklenmiş Ames medyada (a- ve b-dalgası hem de içeren) koni aracılı ERG yanıtları izole. Baryum özellikle brigh tekrarlayan kullanımı sırasında tepkilerin daha fazla değişken geç parçası haline göründü yavaş glial bileşeni kaldırmak için kullanılant yanıp söner. Biz koni tepkiler 300 msn prob flaş sonra çubuklar ve değişken testi yanıp doyurmak için sürekli sonda flaş kullanılır. &#39;Prob + test flaş&#39; yanıtlardan prob flaş yanıtını çıkarılarak elde edilen bir koni tepki ailesi Şekil 3B gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig1.jpg" /> Elektrot kanalları Şekil 1. ex vivo ERG numune tutucu kullanılması. (A) Doldurma ve elektrot çiftleri arasındaki direnci ve gerilim ölçerek diseksiyonu önce monte numune sahibinin elektrotların montajı. (B) Testi. (C) Montaj Numune tutucu filtre kağıdı üzerinde retinanın. (D) Ticari ERG sy perfüzyon hatları ve ERG amplifikatöre bağlı numune tutucukök. perfüzyon akış yolu mavi oklarla gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52855/52855fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52855/52855fig2.jpg" /> Locke (A) ile perfüze koyu adapte WT fare retinaları, Ames (B) ve HEPES-tamponlu Ringer (C) ortamdan kaydedilen Şekil 2. Flaş yanıtı aileler. yanıp söner (-0.9 günlüğüne -9 dB -36 ya da -3,6 dan (Cd sm -2) yeşil ışık (530 nm)) 3, 40, 130, 390 ve 1.400 fotonlar mikron -2 teslim. 40 uM APB 100 uM baryum ilavesinden sonra (ac) &#39;de retina kaydedilen (DF) göster yanıtlarında siyah izleri. Retinanın kaydedilen (D) show yanıtlarında Kırmızı izleri (A)<html> ile perfüze Locke 40 uM APB değil, baryum ile takviye edilmiştir. içerlek APB ve baryum içeren Locke&#39;un medyada üç dimmest yanıp söner tepkilerini gösterir. yanıp söner, 3 1.400 fotonlarından um -2 (-36 den -9 dB yeşil ışık) (E), 7 -2 mikron fotonlar 14000 (D) (-32 den dB yeşil ışık 1) arasında değişmekteydi 7 1.400 fotonlar um -2 in (F) (-32 -9 dB yeşil ışık için). Vinberg ve ark., 2014 17 ve Lyubarsky ark., 1999 30 ve fotonların um -2 Cd sm verilen Fotopik ışık enerjisini -2 dönüştürme ayrıntılar için 2004 31. Bakınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52855/52855fig2large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Yük / 52855 / 52855fig3.jpg &quot;/&gt; WT fare çift flaş yöntemi ile koni yanıtları Şekil 3. izolasyonu. (A) Flaş (14.000 fotonlar um -2 veya 1 dB yeşil ışık, siyah) ve bir test flaş ardından flaş soruşturma bir yanıt prob bir yanıtı (81.000 fotonlar um -2 veya 9 dB yeşil ışık, kırmızı). (B) Koni flaş yanıtları &quot;prob flaş yanıtını çıkarılarak izole 360 81.000 kadar fotonlarından um -2 (-14 10 dB yeşil ışık değişen yanıp söner) test etmek prob + test flaş &quot;yanıtı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52855/52855fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System at JoVE.com

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K Görüntüleme.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Video: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...