Ce travail a été soutenu par le NIH subventions EY019312 et EY021126 (VJK), EY002687 au Département d&#39;ophtalmologie et des sciences visuelles à l&#39;Université de Washington, et par la recherche pour prévenir la cécité.

Tous les protocoles expérimentaux étaient en conformité avec le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel Animal Studies à l&#39;Université de Washington. 1. Configuration de perfusion et porte-échantillon <ol><li> Préparer la solution pour perfusion rétine frais sur le jour de l&#39;expérience. Utilisez de l&#39;eau distillée et déminéralisée. Utilisez l&#39;une des trois solutions suivantes. <ol><li> Préparez-contenant Bicarbonate de la solution (1 L): 1 bouteille de Ames Ames des médias et de 1,9 g de NaHCO 3, </li><li> Préparer la solution de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinate, 0,5 Na glutamate, 0,02 EDTA, et 10,0 glucose, 0,1% de vitamines MEM et amino acides </li><li> Préparer une solution de Ringer tamponnée par HEPES (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, MgCl 2 2,0, CaCl 2 1,0, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajusté à 7,5 avec de ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, ajouter 0,72 g / L du milieu de culture Leibovitz L-15. Utilisez 20-50 uM DL-AP4 et 50 - 100 uM BaCl 2 pour isoler la réponse du photorécepteur avec tout support de perfusion. </li></ol></li><li> Préparer la solution pour les électrodes 28 (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl 2 2,4, CaCl 2 1,2, 3, HEPES 0,01 EDTA et ajuster le pH à 7/4 à 7/5 avec du NaOH. Electrode de solution peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs mois. </li><li> Préparer et tester le porte-échantillon. <ol><li> Collez papier filtre noir / gris sur le dessus des dômes de la partie inférieure du porte-échantillon (voir la figure 1A). Étaler à deux composants 5 min de la colle époxy soigneusement autour des bords des sommets plats des dômes. Si nécessaire, le faire en vertu de la dissection microscope. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que la colle est presque à sec (environ 4 min) et appuyez sur le papier filtre sur les dômes en utilisant un objet plat. Colle de papier filtre, au moins un jour avant l&#39;expérience. Lepapier filtre peut être utilisé plusieurs fois, mais doit être remplacé après un mois d&#39;enregistrements. Utilisez 70% d&#39;éthanol pour nettoyer soigneusement dômes de tout résidu de colle avant d&#39;installer le papier de remplacement. </li><li> Remplissez les canaux d&#39;électrode avec une solution d&#39;électrode en essayant d&#39;éviter les bulles d&#39;air et vissez électrodes de pellets clos avec un adaptateur fileté dans les canaux d&#39;électrodes (voir les figures 1A et B). Connecter les pièces supérieure et inférieure du porte-échantillon avec quatre vis et remplir les lignes de perfusion avec une solution de l&#39;électrode. </li><li> Mesure de la résistance et de la tension entre les conducteurs de chaque paire d&#39;électrodes à l&#39;aide d&#39;un multimètre (figure 1B). La résistance doit être inférieure à 100 #k et la tension en dessous de 10 mV si les canaux sont sans bulles et les électrodes sont dans de bonnes conditions. </li></ol></li><li> Verser 400 à 700 ml de milieu de perfusion dans la bouteille en verre. Encore 300 ml séparée à utiliser dans la dissection des rétines et sdéchira dans un réfrigérateur. Réglez la tubulure de perfusion dans le bloc de l&#39;échangeur de chaleur et placez le bloc préchauffé sur la plaque de chauffage (voir figure 1D). </li><li> Joindre la bouteille avec un bouchon qui a des connexions de CO 2 / O 2 gazeux (si Ames »ou Locke est utilisé) et pour tubulure de perfusion (voir figure 1D). Préchauffer la bouteille avec les médias à 37 o C et le placer sur la plaque chauffante ou sur le dessus de l&#39;unité de stimulation lumineuse dans un bain d&#39;eau réglé à 37-39 o C 17. <ol><li> Premier Les lignes de perfusion par remplissage des médias de perfusion pour initier l&#39;écoulement par gravité. <ol><li> Dans le système LKC, placer la bouteille sur le dessus de l&#39;unité de stimulateur 17 pour fournir un écoulement gravitationnel significatif qui est ensuite ajustée par les régulateurs de débit sans être affectée par le niveau d&#39;abaissement de la solution de perfusion dans le flacon pendant l&#39;expérience. </li><li> Dans le système Ocuscience, placez le pbouteille de erfusion l&#39;intérieur de la cage de Faraday afin de minimiser le bruit et les placer à long perfusion lignes de sortie de la porte-échantillon (voir l&#39;étape 2.8) bien en dessous du niveau du support de spécimen (et une bouteille de perfusion) pour augmenter entraînement gravitationnelle de la solution. Protégez ces lignes de sortie et connecter le blindage à la terre de l&#39;amplificateur pour éviter le couplage du bruit électromagnétique au signal ERG. </li></ol></li></ol></li><li> Ajustez la perfusion de 3 - 5 ml / min en utilisant les régulateurs de débit. Connectez 5% de CO 2/95% O 2 du gaz d&#39;un cylindre avec régulateur approprié et ajuster le débit pour assurer bouillonnement constant des médias dans la bouteille par une pierre à air. </li></ol> Préparation de l&#39;échantillon 2. <ol><li> Assemblez instruments de dissection propres et nettes, y compris microciseaux lame droite, un ou deux 45 o pince à épiler, une lame de rasoir et une pièce rectangulaire de papier filtre. </li><li> Pour environ 200 ml de froid perfusion de solution dans une grande boîte de Petri de sorte que toute la partie inférieure du porte-échantillon (y compris les dômes) peut être immergé dans la solution. Cette étape devient important lors du montage des rétines sur les dômes (voir l&#39;étape 2.6). Bien que certaines solutions sont conçues pour être saturée avec du carbogène (5% de CO2 / 95% d&#39;O 2), ce ne soit pas essentiel aux fins de dissection et n&#39;a pas été fait dans les expériences décrites ici. </li><li> Pour une expérience typique, garder les animaux dans les 12/12 heures cycle d&#39;obscurité / lumière et l&#39;obscurité, de les adapter pour les 6 - 12 heures avant les enregistrements. Euthanasier l&#39;animal par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale sous faible lumière rouge et de faire toutes les procédures suivantes sous la lumière rouge ou IR dim (utiliser par exemple, filtre rouge en face de la source de lumière du microscope). <ol><li> Tirez les yeux en utilisant une pince à épiler et les mettre dans les médias. Placez un œil à la fois sur un petit morceau de papier (par exemple, du papier régulier du filtre) et de faire enallumé environ sur le niveau de ora serrata tout en maintenant l&#39;œil avec des pincettes (cela se fait en dehors de la solution ici). </li></ol></li><li> Coupez le long de l&#39;ora serrata (ou plus près de l&#39;équateur de l&#39;œil) avec microciseaux et retirez la cornée et le cristallin. Placez la tasse d&#39;oeil dans les médias froid dans la grande boîte de Pétri et répétez la même procédure avec l&#39;autre œil. </li><li> Couper une petite incision du haut de l&#39;œilleton vers le nerf optique en gardant les ciseaux entre la rétine et la sclérotique afin de garder la rétine aussi intact que possible. Tenue de la sclère des deux côtés de l&#39;incision à l&#39;aide de deux pinces à épiler et tirer la pince à une distance l&#39;une de l&#39;autre pour détacher la rétine. <ol><li> Couper le nerf optique et essayer d&#39;isoler la rétine avec un montant minimum de contact physique à la surface distale. RPE sera principalement détacher automatiquement à partir de la rétine au cours du processus de dissection. Il est plus important d&#39;éviter la perturbation mécanique de la rétine que pour effectuer ladissection rapidement, généralement rétines peut être incubée au moins 30 min dans la solution sans effets significatifs sur les propriétés de réponse. </li></ol></li><li> Monter les rétines sur les dômes de support de l&#39;échantillon (figure 1C). Immerger la partie inférieure du porte-échantillon dans la boîte de Pétri avec les rétines disséqués. Faites glisser la rétine, côté photorécepteur (la surface convexe de la rétine isolée) vers le haut, au-dessus du dôme et soulever le porte-échantillon de telle sorte que la rétine se fixe sur le papier filtre. Répétez la procédure pour l&#39;autre rétine. </li><li> Séchez soigneusement la plaque de support pour empêcher la diaphonie électrique entre les rétines ainsi que le bruit et le signal manœuvre. Porte-échantillons a joints toriques autour des dômes de partie inférieure pour empêcher solution déversement entre la parties inférieure et supérieure du titulaire ainsi que pour aider à l&#39;isolation électrique des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires de la rétine côtés individuels. Fixez la partie supérieure de la porte avec les quatre vis (voir la figure 1B) et remplir les canaux de perfusion avec une solution de perfusion en utilisant une seringue et une aiguille. </li><li> Transférer le porte-échantillon à côté du bloc de l&#39;échangeur de chaleur et de connecter les entrée et sortie perfusion lignes au support de spécimen (figure 1D). Raccorder les électrodes à l&#39;amplificateur ERG (électrodes supérieures relient à la terre / moins broche dans l&#39;amplificateur) et fixer l&#39;unité stimulateur / contrôle sur le porte-échantillon en utilisant un adaptateur ou faites glisser le coussin chauffant dans l&#39;unité de stimulateur selon le in vivo ERG système est utilisé. </li></ol> 3. Enregistrements <ol><li> Configurer les paramètres de l&#39;amplificateur et de relance en utilisant le logiciel du système in vivo. Réglez la fréquence d&#39;acquisition d&#39;une valeur comprise entre 1 et 10 kHz et filtrage passe-bas à 300 Hz. Ne pas utiliser le filtrage passe-haut. Utilisez 60 Hz (ou 50 Hz en Europe) Notch Filter si nécessaire. </li><li> Fiche de référence sans la stimulation lumineuse et d&#39;esprith stimulation dim (ex., le feu vert de -35 dB ou 0,3 mCd sm -2) pour tester bonne connexion électrique entre les électrodes et l&#39;échantillon rétine. Attendez de 10 - 20 min avant de commencer la collecte de données de telle sorte que la température et la fonction rétinienne atteignent un état stable. <ol><li> Choisissez les paramètres de stimulation selon l&#39;une expérience spécifique et commencer la collecte des données. Par exemple, utiliser le feu vert de -40 à 0 dB ou de 0,1 à 1,000 mCd sm -2 pour une famille de réponse scotopique. Utilisez environ 2 à 3 log-unités lumineux clignote en enregistrements photopiques où tiges doivent être réprimées par la lumière de fond (3-30 Cdm -2) ou un flash de la sonde (environ 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, voir Figure 3). </li><li> Cependant, rappelez-vous que les valeurs d&#39;intensité lumineuse exactes pourraient être quelque peu dépendant de votre étalonnage du système et les conditions expérimentales. En règle générale, les intensités d&#39;échelle en baisse de 5 à 10 fois par rapport à in vivo </em&gt; enregistrements lors de l&#39;utilisation de lumière verte 17. Une housse noire avec des ouvertures au-dessus des rétines (inclus dans le système d&#39;adaptateur commerciale) peut être utilisé pour réduire la dispersion de la lumière dans le support d&#39;échantillon et de faciliter la stimulation homogène et égale des deux rétines par la sphère de la publicité in vivo systèmes de Ganzfeld. NOTE: Pour les enregistrements de la rétine adaptée à l&#39;obscurité, les intensités des bouffées de test utilisées dans un agent de blanchiment expérience typique seulement une fraction négligeable du pigment de sorte que l&#39;absence de régénération conduit RPE-est pas un problème. En outre, il a été montré précédemment que cône pigment régénération peut encore avoir lieu dans la rétine isolée par l&#39;intermédiaire de la cellule Müller cycle visuel 20. </li></ol></li><li> Comme expériences durent habituellement de 30 minutes à plusieurs heures, de surveiller la dérive de référence, le niveau de bruit et la stabilité de réponse lors de l&#39;expérience que les changements de ceux-ci pourraient indiquer des problèmes techniques. NOTE: Augmentation du bruit ou de la diminutionamplitudes d de réponse peuvent indiquer des bulles d&#39;air dans les canaux de perfusion ou électrodes, température trop basse ou haute, solution de fuite / déversement ou de déplacement de la rétine. </li></ol> 4. Nettoyage <ol><li> Détachez le porte-échantillon à partir des lignes de perfusion, l&#39;ouvrir et vider les rétines du papier filtre. Retirez les électrodes et les rincer avec de l&#39;eau distillée (ne pas utiliser de l&#39;éthanol). Nettoyer le porte-échantillon (y compris les canaux de perfusion) avec de l&#39;éthanol et / ou de l&#39;eau distillée. Rincer soigneusement tubulure de perfusion avec&gt; 70% d&#39;éthanol. </li><li> Rincer la bouteille de perfusion avec de l&#39;eau distillée (ne pas utiliser de détergents). L&#39;éthanol peut également être utilisé pour nettoyer la bouteille. </li></ol>

<ol>
	<li>Armington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Electroretinogram. , (1974).</li><li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities.">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).</li><li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve.">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li><li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave.">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li><li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity.">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li><li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina:+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram.">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs.">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li><li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium:+origin+of+the+electroretinogram+c-wave.">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li><li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bovine+arterially-perfused+eye:+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP,+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature.">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+(Rana+temporaria).">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li><li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog.">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li><li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+adaptation+in+toad+rods:+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium.">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li><li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina.">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li><li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system.">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li><li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells.">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li><li>Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+(glial)+cells+in+the+toad+retina.">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li><li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina.">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina.">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model.">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina.">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li><li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse:+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments.">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li><li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG.">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li><li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+protocols+alter+phototransduction:+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold.">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy.">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors.">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li><li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors:+adaptation,+noise,+and+kinetics.">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

Université Washington à St. Louis a conclu un accord de licence avec Xenotec, Inc. et peut recevoir des redevances de la vente de l&#39;adaptateur ex vivo.

<html> Nous démontrons ici les étapes critiques pour l&#39;obtention de haute qualité ex vivo enregistrements ERG simultanément à partir de deux rétines de souris isolées en utilisant des composants in vivo du système ERG avec un ex vivo ERG adaptateur. Dans cette étude, nous avons perfusé les deux rétines de l&#39;animal avec la même solution (soit Ames &#39;, Ringer Locke ou) mais il est également possible de perfuser chaque rétine avec une solution différente, par exemple,...

Électrorétinogramme (ERG) est une technique bien établie qui peut être utilisé pour enregistrer l&#39;activité électrique de la rétine provoquée par la lumière. Le signal est généré ERG principalement par les variations de tension provoquées par les courants radiaux (selon l&#39;axe des photorécepteurs et les cellules bipolaires) circulant dans l&#39;espace extracellulaire résistif de la rétine. Le premier signal ERG a été enregistrée en 1865 par Holmgren de la surface d&#39;un œil de poisson 1. Einthoven et Jolly 1908 2 divisés la réponse ERG à l&#39;apparition de la lumière en trois vagues différentes, appelé A, B, et C-ondes, qui sont maintenant connu pour refléter principalement l&#39;activité des photorécepteurs, les cellules bipolaires ON, et l&#39;épithélium pigmentaire cellules, respectivement 8.3. ERG peut être enregistrée dans les yeux des animaux anesthésiés ou humains (in vivo), de la préparation des yeux isolé 9, à travers la rétine isolée intacte (ex vivo) 3,10-15 ou à travers les couches de la rétine spécifiques avec des microélectrodes (localERG) 4,16. Parmi ceux-ci, in vivo ERG est actuellement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la fonction rétinienne. Il est une technique non invasive qui peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour suivre la progression de maladies de la rétine chez les animaux ou patients. Cependant, in vivo enregistrements ERG produisent un signal compliqué avec plusieurs composants qui se chevauchent, souvent contaminés par le bruit extraoculaire physiologique (par exemple, la respiration et l&#39;activité cardiaque). ERG local peut être utilisé pour enregistrer le signal à travers des couches spécifiques de la rétine, mais il est le plus invasive et présente le plus faible rapport signal-sur-bruit (SNR) par rapport aux autres configurations d&#39;enregistrement ERG. ERG local est aussi techniquement exigeante et nécessite un équipement coûteux (par exemple, un microscope et micromanipulateurs). Transretinal ERG de la intacte, la rétine isolée (ex vivo ERG) offre un compromis entre les méthodes in vivo et ERG locales permettant stable et higenregistrements h SNR de rétines intactes d&#39;animaux ou les humains 17. Récemment, cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la fonction des bâtonnets et des cônes photorécepteurs dans les rétines de mammifères, les primates et les droits de 18-20. En outre, en raison de l&#39;absence de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine ex vivo, la composante c-onde positive du signal ERG est retiré et un composant PIII lente négative importante est révélée dans les enregistrements ex vivo. La composante lente PIII a été démontré que provenir de l&#39;activité des cellules gliales de Müller dans la rétine 21-23. Ainsi, ex vivo ERG procédé pourrait également être utilisé pour étudier les cellules de Müller dans la rétine intacte. Plusieurs études ont également montré que les ex vivo enregistrements ERG pourraient être utilisés pour mesurer la concentration d&#39;agents pharmacologiques autour de la rétine 24 et de tester l&#39;innocuité et l&#39;efficacité des médicaments 25-27. Multiple commercial dans des systèmes in vivo sont disponibles etutilisée dans de nombreux laboratoires qui ne disposent pas nécessairement vaste expérience en électrophysiologie. En revanche, ex vivo dispositifs ont pas été disponible jusqu&#39;à récemment 17 et par conséquent que très peu de laboratoires sont en cours avantage de cette technique puissante. Il serait bénéfique de faire des enregistrements ex vivo ERG disponible pour plusieurs laboratoires afin de faire progresser nos connaissances sur la physiologie et la pathologie de la rétine, et de développer de nouvelles thérapies pour les maladies cécitantes. Nous démontrons ici un dispositif simple et abordable ex vivo ERG 17 et montrons comment il peut être utilisé en combinaison avec plusieurs systèmes vivo ERG disponibles dans le commerce pour enregistrer dans la signalisation de bâtonnet et le cône médiation (A et B-ondes) et la fonction de les cellules de Müller (ralentir PIII) de rétines de souris de type sauvage intacte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>HMsERG</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo ERG system</td>
			<td>LKC Technologies</td>
			<td>UTAS-E 3000</td>
			<td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex vivo adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>Ex VIVO ERG adapter</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>North Central Instruments</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;idCategory=27">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR emitter</td>
			<td>Opto Diode Corp.</td>
			<td>OD-50L</td>
			<td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prowler Night Vision Scopes</td>
			<td>B.E. Meyers Electro Optics</td>
			<td>D4300-I</td>
			<td>Military grade product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red filter</td>
			<td>Rosco Laboratories</td>
			<td>Roscolux #27 Medium Red</td>
			<td>May be used instead of IR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red head light</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>ERGX011</td>
			<td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>500086</td>
			<td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers #5</td>
			<td>WPI, Inc.</td>
			<td>14101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Metler Toledo</td>
			<td>AB54-S/FACT</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter and electrode</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>pHI 350</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60129</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">May use any brand</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63020</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>1.0 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>101</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>224731</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2834</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz culture medium L-15</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4386</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN3156</td>
			<td>5% CO2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Nous avons enregistré les réponses flash de type sauvage adaptés à l&#39;obscurité (WT) C57BL / 6 rétines de souris en suivant les protocoles expérimentaux décrits ci-dessus et illustrés dans la Figure 1 en utilisant différentes solutions de perfusion classiques (Figure 2). Les formes d&#39;ondes et de la cinétique de réponse ainsi que la sensibilité des photorécepteurs à bâtonnets semblent similaires à Ames »et les médias de Locke (Figure 2A et <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System at JoVE.com

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K vues.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Vidéo: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Recherche

Neurosciences

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...